H9N2亚型禽流感病毒细胞高产疫苗株构建及应用

摘要

本发明属于动物疫苗制备技术领域。具体涉及H9N2亚型禽流感病毒细胞高产疫苗株构建及应用。所述的疫苗株是由禽流感分离株通过人工诱变筛选得到。该疫苗株被命名为H9N2亚型禽流感病毒W1‐HA358毒株，其原始分离株为A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2))株。对该分离株的HA基因非编码区3ˊ端的3,5,8位点进行了人工定点突变，利用反向遗传操作拯救出突变株，突变株在MDCK细胞上传代至稳定后得到高增殖滴度的毒株，得到H9N2亚型禽流感病毒细胞苗。本发明解决了H9N2禽流感病毒在MDCK细胞上增殖不稳定问题，克服了禽流感爆发时大量鸡胚的短缺问题，提高了疫苗的制备效率。

说明书

技术领域

本发明属于动物疫苗制备技术领域。具体涉及一株H9N2亚型禽流感病毒细胞高产疫苗株构建及应用。

背景技术

H9N2亚型禽流感(Avianinfluenza，AI)是由A型流感病毒感染家禽后引起一种传染性综合征，在世界范围内广泛传播，严重威胁着畜牧业的发展。1966年首次从火鸡中检测H9N2亚型AIV，此后，AIV在禽类中广泛传播流行。1994年，我国首次报道从广东某鸡场中分离到H9N2亚型AIV，而此后H9N2亚型AIV一直在我国的养禽地区广泛传播。H9N2亚型AIV虽然属于低致病性AIV，但是现在研究表明它还可以感染小鼠，雪貂和人类。除此之外，可以引起禽产蛋率下降、造成免疫抑制、以及激发其他病毒或细菌的混合或继发感染，给我国的养禽业造成严重的经济损失。而且H5N1流感病毒的内部基因都有可能构成H9N2的内部基因，这引起了人们对H9N2禽流感病毒的高度重视。1999年，在中国香港发生了人感染H9N2亚型AIV事件。再到2009年12月，香港第7次在人身上检测出H9N2AIV。这表明，H9N2AIV可以从禽类到哺乳动物跨越物种障碍进行传播，从而扩大了宿主范围。2013年，中国发生了H7N9禽流感病毒感染人事件，导致134人感染和45人死亡。到2014年2月23日为止，总共有213人感染66人死亡。根据禽流感病毒基因组比对和亲缘分析显示，H7N9病毒的6个基因片段来源于H9N2AIV。这表明，H9N2有可能成为将来流行的一种病毒，应该引起高度的重视。因此，为了人类健康和畜牧经济的健康发展，必须加强对H9N2亚型AIV的防控。

接种疫苗，是预防禽流感发生与传播最有效的手段。从1878年流感爆发到现在，鸡胚灭活疫苗一直是预防禽流感发生的重要的疫苗之一。目前，我国使用的H9N2亚型AIV疫苗均为鸡胚尿囊液灭活疫苗。鸡胚是禽流感疫苗生产和研究的主要材料。虽然鸡胚灭活苗具有方便运输，制备工艺简单，安全稳定等优点，但是鸡胚培养流感病毒也存在如下许多弊端:(一)在流感大规模爆发的时候，在短期内收集9-10日龄鸡胚甚是困难。(二)用鸡胚培养流感病毒，容易产生大量废弃的鸡胚及其病毒的残留，排放到自然中对环境危害很大。(三)受到母源抗体的影响；(四)生产成本高、周期性长等缺点。为了克服禽流感爆发时大量鸡胚的短缺问题及生产周期长的缺点，通过利用反向遗传操作技术，改造病毒内部基因，提高H9N2禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖滴度。用细胞培养AIV的方法取代用鸡胚生产AIV疫苗的方法，改变传统的方法，完善H9N2亚型禽流感疫苗灭活疫苗生产方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现在使用鸡胚培养禽流感病毒的传统方法，获得一种在细胞上稳定增殖且具有高病毒滴度的细胞疫苗。

本发明的技术方案如下：

本发明的H9N2禽流感细胞疫苗的疫苗株的原始分离株H9N2禽流感病毒株A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)是申请人2004年在湖北某鸡场分离得到【参见：Xiao‐JuanXu,Gao‐YuanXu,Hong‐BoZhou,Zheng‐JunYu.EvolutionarycharacterizationofinfluenzavirusA/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)isolatedfromcentralChinaVirusGenes.2008Feb；36(1):79‐83.Epub2007Nov20】；将A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)中的8个内部基因片段(其核酸序列已被收录在NCBI中)，分别克隆至转录/表达载体pWH2000上(美国St.Jude儿童研究医院Webster博士惠赠)，构建得到8个质粒。构建W1毒株的内部基因的载体分别命名为PWH2000-PB2、PWH2000-PB1、PWH2000-PA、PWH2000-NP、PWH2000-NA、PWH2000-HA、PWH2000-M、PWH2000-NS，将其中命名为PWH2000-HA质粒3,5,8位点的碱基进行人工突变(突变方向为：G3→A3,U5→C5和C8→U8)，构建得到一个突变质粒，然后利用反向遗传操作技术，将该突变质粒和其余7个内部流感基因片段，将W1其余7个构建好的质粒和突变质粒共转染293T+MDCK混合细胞，拯救得到H9N2禽流感病毒突变株W1-HA358，将所述的H9N2禽流感病突变毒株W1-HA358在MDCK细胞上传代，获得高增值滴度并稳定细胞适应的毒株，将其灭活后作为油乳灭活苗检测其免疫原性，证明构建所得的疫苗株具有良好的免疫原性。

申请人将该细胞适应毒株命名为H9N2亚型禽流感病毒W1‐HA358毒株，于2015年6月11日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNO：V201522。

与现有技术相比，本发明的优点是；

(1)本发明利用禽流感病毒H9N2作为背景，将HA基因的3'端的3、5、8位点的碱基进行人工突变，然后拯救并得到突变毒株。该突变毒株在MDCK细胞上具有更好的适应性，提高了病毒滴度。

(2)本发明制备的突变毒株在MDCK细胞上传代获得高增殖滴度的细胞适应毒株，有利于缓解禽流感爆发时亟需大量鸡胚以及鸡胚短缺问题。

更详细的技术方案参考见《具体实施方案》所示。

附图说明

序列表SEQIDNO：1是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因HA的DNA序列，序列长度为1472bp。

序列表SEQIDNO：2是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因NA的DNA序列，序列长度为1457bp。

序列表SEQIDNO：3是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因M基因的DNA序列，序列长度为1027bp。

序列表SEQIDNO：4是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因NP的DNA序列，序列长度为1565bp。

序列表SEQIDNO：5是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因NS基因的DNA序列，序列长度为890bp。

序列表SEQIDNO：6是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因PA的DNA序列，序列长度为2233bp。

序列表SEQIDNO：7是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因PB1的DNA序列，序列长度为2341bp。

序列表SEQIDNO：8是H9N2禽流感分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(H9N2)内部基因PB2的DNA序列，序列长度为2341bp。

序列表SEQIDNO：9是扩增相关基因的通用引物Uni12的DNA序列。

序列表SEQIDNO：10是扩增HA基因(登录号：DQ465400.1)的引物对的上游引物。

序列表SEQIDNO：11是HA基因(登录号：DQ465400.1)的引物对的下游引物。

序列表SEQIDNO：12是扩增NA基因(登录号：DQ465402.1)的引物对的上游引物。

序列表SEQIDNO：13是扩增NA基因(登录号：DQ465402.1)的引物对的下游引物。

序列表SEQIDNO：14是扩增M基因(登录号：DQ465403.1)的引物对的上游引物。

序列表SEQIDNO：15是扩增M基因(登录号：DQ465403.1)的引物对的下游引物。

序列表SEQIDNO：16是扩增NP基因(登录号：DQ465401.1)的引物对的上游引物。

序列表SEQIDNO：17是扩增NP基因(登录号：DQ465401.1)的引物对的下游引物。

序列表SEQIDNO：18是扩增NS基因(登录号：DQ465404.1)的引物对的上游引物。

序列表SEQIDNO：19是扩增NS基因(登录号：DQ465404.1)的引物对的下游引物。

序列表SEQIDNO：20是扩增PA基因(登录号：DQ465399.1)的引物对的上游引物。

序列表SEQIDNO：21是扩增PA基因(登录号：DQ465399.1)的引物对对的下游引物。

序列表SEQIDNO：22是扩增PB1基因(登录号：DQ465398.1)的引物对的上游引物。

序列表SEQIDNO：23是扩增PB1基因(登录号：DQ465398.1)的引物对的下游引物。

序列表SEQIDNO：24是扩增PB2基因(登录号：DQ465397.1)的引物对的上游引物。

序列表SEQIDNO：25是扩增PB2基因(登录号：DQ465397.1)的引物对的下游引物。

图1：是本发明中涉及的PHW2000原始质粒图谱。该质粒是用来构建反向遗传操作的8个质粒的原始质粒。

图2：流感病毒各片段cDNA克隆到pHW2000载体构建示意图。

图3：流感病毒HA3‐5‐8突变体构建示意图。

图4：是本发明涉及W1毒株全基因序列克隆的PCR图。附图标记说明：泳道从左至右依次为：DL15000marker；PB2、PBI、PA；DL2000marker；HA、NP、NA；DL2000marker；M，NS。

图5：HA基因(登陆号：DQ465400)3-5-8位点突变的PCR图。附图标记说明：泳道依次为：Plus2000marker；PHW2000-HA3-5-8的质粒扩增电泳结果。

图6：是本发明制备的突变毒株在MDCK细胞上增殖传代的结果。

具体实施方案

实施例1：禽流感病毒分离株A/chicken/Hubei/W1/2004毒株全基因组感染性克隆

1、禽流感病毒分离株A/chicken/Hubei/W1/2004RNA的提取

从-80℃冰箱中取出备用的鸡胚尿囊液禽流感病毒分离株A/chicken/Hubei/W1/2004(简称病毒)，【参见：Xiao-JuanXu,Gao-YuanXu,Hong-BoZhou,Zheng-JunYu.EvolutionarycharacterizationofinfluenzavirusA/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)isolatedfromcentralChinaVirusGenes.2008Feb；36(1):79-83.Epub2007Nov20】置于室温下溶解，取300μL病毒液加入到装有1mLTrizol1.5mLEP管中，轻轻的上下颠倒，放在冰上冰浴15min；然后加入200μL氯仿，用振荡器涡旋混匀15s，放置冰上静置10min,以4℃，12000r/min离心10min，取上清(避免吸到白色沉淀)移入新的一个1.5mLEP管，加等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min，室温12000r/min离心10min，弃上清，加1mL75％乙醇，室温12000r/min离心10min，吸弃乙醇，将EP管置于超净台中风干，最后将RNA沉淀溶于10μl的DEPC水，置-80℃保存备用(一般采用立即反转效果较好，避免RNA被空气中的RNA酶降解)。

2、引物设计合成

用来扩增所有A型流感病毒8个全长基因片段的通用引物如下所示。引物由上海生物工程有限公司合成，具体引物的核苷酸序列如下：

反转录通用引物Uni12primer：5’AGCAAAAGCAGG3’(SEQIDNO：9)

(1)扩增HA基因(登录号：DQ465400.1)的引物对:

P15’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG3’(SEQIDNO：10)

P25’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’(SEQIDNO：11)

(2)扩增NA基因(登录号：DQ465402.1)的引物对:

P15’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT3’(SEQIDNO：12)

P25’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT3’(SEQIDNO：13)

(3)扩增M基因(登录号：DQ465403.1)的引物对:

P15’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG3’(SEQIDNO：14)

P25’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT3’(SEQIDNO：15)

(4)扩增NP基因(登录号：DQ465401.1)的引物对:

P15’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA3’(SEQIDNO：16)

P25’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT3’(SEQIDNO：17)

(5)扩增NS基因(登录号：DQ465404.1)的引物对:

P15’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG3’(SEQIDNO：18)

P25’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’(SEQIDNO：19)

(6)扩增PA基因(登录号：DQ465399.1)的引物对:

P15’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAC3’(SEQIDNO：20)

P25’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT3’(SEQIDNO：21)

(7)扩增PB1基因(登录号：DQ465398.1)的引物对:

P15’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGCA3’(SEQIDNO：22)

P25’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT3’(SEQIDNO：23)

(8)扩增PB2基因(登录号：DQ465397.1)的引物对:

P15’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTC3’(SEQIDNO：24)

P25’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT3’(SEQIDNO：5)

3、禽流感A/chicken/Hubei/W1/2004病毒RNA的反转录

在20μl反转录体系中进行，依次加入如表1所述的组分，混匀后置PCR仪上于42℃进行反转录反应60min，反应产物直接用于PCR或置于4℃保存备用。

表1：禽流感病毒A/chicken/Hubei/W1/2004病毒RNA的反转录体系

4、禽流感病毒A/chicken/Hubei/W1/2004cDNA的PCR扩增

在PCR反应管中加入表2所述的扩增体系。将配置好的体系混匀后于PCR仪上进行扩增。PCR扩增程序为预变性94℃5min，变性94℃20sec，退火58℃30sec，延伸72℃5min，运行30个循环，最后于72℃后延伸10min。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物各取5μl，在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳分析，剩余置4℃保存备用。

表2：禽流感病毒A/chicken/Hubei/W1/2004cDNA的PCR扩增体系

Trans-T DNA1.0μldNTP Mixture2.0μlPCR Buffer5.0μlP1(10μm)2.0μlP2(10μm)2.0μlcDNA模板2.0μlRNase freed H₂O36.0μl反应总体积50μl/样品(Sample)

5、PCR产物的回收与纯化

电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收DNA。具体方法如下：切下目的DNA回收片段，放入一无菌的1.5mL的EP管中，加入500-750μlBindingBuffer，于50-60℃水浴5min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化。然后将溶化的液体转至一回收柱，于室温静置2min，8000r/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，用500μlWashingsolution8000r/min，离心1min，洗两次；最后12000r/min离心15s，将回收柱转至一干净的1.5mLEP管中，加10-20μlddH₂O洗脱，于室温放置5min，12000r/min离心1min，收集管中即为回收的DNA片段，可直接用于DNA连接，也可于-20℃保存备用。

6、连接反应

将回收的PCR产物直接连到pMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，连接体系如表3。体系配置好后，将连接体系放于16℃水浴中过夜连接。

表3连接体系

pMD18-T vector DNA1.0μlLigation Solution I9.0μlPCR回收产物10.0μl反应总体积20μl/样品(Sample)

7、连接产物的转化

取100μl新鲜制备的感受态细胞DH5α置于冰上。加入10μl连接产物，混匀后，冰浴30min。42℃热激90s，冰浴2min，使之冷却。加入400μlLB混匀，220r/min，37℃摇床培养45min后于5000r/min离心5分钟，吸弃300μl上清，重悬菌体后吸取200μl培养液，涂布抗性平板上。37℃培养10h－12h可出现单菌落。

8、PCR鉴定阳性重组质粒

PCR筛选阳性克隆的程序如下：取灭菌的0.5ml的EP管8-12个，依次在每管中加入30μl的灭菌双蒸水。用灭菌枪头刮取平皿上的单菌落，在EP管中吹吸几次使菌体悬浮在双蒸水中。每个样品无菌取10μl菌体悬液以备进一步扩大培养用，剩余的20μl用沸水水浴10min，12000r/min离心5min，取上清5μl作PCR模板。PCR扩增出预期目的片段的样品，取其相应的菌体悬液扩大培养，制备质粒测序用。用于鉴定的PCR程序与扩增该基因的程序相同，具体PCR体系如表4。

表4PCR鉴定体系

Trans-Taq DNA0.5μldNTP Mixture1.0μlTrans-Taq PCR Buffer2.0μlP1(10μm)1.0μlP2(10μm)1.0μl模板5.0μlRNase freed H₂O9.5μl反应总体积20μl/样品(Sample)

将上述筛选得到的阳性克隆的8个基因，每个基因选择4个样品送上海生工生物工程有限公司进行测序，然后使用软件DNAStar4.0对测序的序列进行比对分析。

9、质粒小提

采用质粒提取试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)

(1)随机挑取平板上转化的单个菌落，接种至5mL含抗生素(Amp，终浓度为0.1％)的LB培养液中，37℃300r/min振荡培养过夜；

(2)取2mL菌液加入一个新的EP管中，以12000r/min离心2min，收集菌体，直至培养液收集完，弃去上清，收集沉淀；

(3)加入250μLP1溶液(试剂盒自带)(使用前加入RnaseA，放于4℃冰箱保存，)重悬菌体沉淀，至菌体彻底重悬均匀；

(4)加入250μLP2溶液(试剂盒自带)，然后温和地上下翻转4-7次均匀混合，使菌体完全裂解，室温放置；

(4)加入350μLP3溶液(试剂盒自带)，立即温和地上下翻转4-7次混合均匀，直至出现白色絮状沉淀，待液体颜色由黄色为透明即可；然后在室温下以12000r/min离心10min，小心吸取上清，尽量不要吸入沉淀；

(5)将上一步所得上清加入吸附柱中(吸附柱已放入收集管中)，在室温下静置2min，然后以12000r/mim离心60s，倒掉收集管中的废液。如果所得上清体积大于750μL，可以分多次加入吸附柱中,再次离心,倒掉废液即可；

(6)往吸附柱中加入600μL的WashingBuffer，以12000r/mim离心1min,倒掉收集管中的废液；

(7)重复步骤(6)；

(8)将吸附柱再次放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量完全去除WashingBuffer，以免其中的残留乙醇影响；

(9)取出吸附柱,放入一个干净新的EP管中,在吸附膜的中间部分悬空加入加20-50μL洗脱缓冲液(Elutionbuffer；洗脱缓冲液的来源或提供其配方及配置方法，使用洗脱缓冲液前在65-75℃水浴加热之后洗脱效果更好)，室温放置2min,以12000r/min离心3min，收集质粒DNA；

(10)取0.1μLDNA质粒用紫外分光光度计检测浓度后于-20℃保存备用。

10、PHW2000重组质粒的构建

将上述提取的质粒进行酶切，同时用BsmBI线性化载体pHW2000(美国St.Jude儿童研究医院Webster博士惠赠，质粒图谱如图1所示)。其中PB1、PA、HA、NA、M及NS基因片段(片段序列同《附图说明》所示的序列)用BsmBI酶切，回收后同线性化的载体pHW2000相连。用BsmBI酶切PB2基因片段后，产生1.9kb和0.4kb两条带；用BsaI酶切NP基因片段产生1.1kb和0.4kb两条带。将两条带一起回收后分别与线性化的载体pHW2000相连，对三个片段进行连接。用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后挑取单个菌落，摇菌，小提质粒。用酶切和PCR方法(采用常规方法)来筛选阳性克隆子。将所得的阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司鉴定后证明序列连接正确。

11、结果

(1)W1毒株全基因组克隆

利用步骤2(引物设计合成)中公开的8对引物扩增全基因组序列(PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M、NS)目标基因，得到W1流感病毒株基因的8个片段，片段大小为依次约为2.3kb、2.3kb、2.2kb、1.7kb、1.5kb、1.4kb、1.0kb和0.9kb(见图2所示)。

构建PHW2000-HA358突变质粒

由上海生物工程有限公司合成HA3-5-8位点突变的引物，引物的核苷酸序列如5所示：

表5HA3-5-8位点突变的引物

设计一对含突变点有10个碱基反向互补的引物，如表5所述。用高保真的DNA聚合primerStarPCR扩增全质粒DNA(HA-PHW2000)，跑胶鉴定(结果见图3)，用DpnI酶处理3.5h去除未甲基化模板质粒，转化后挑几个菌落测序鉴定突变位点。PCR体系如表6：

表6PCR体系

primerstar Taq DNA1.0μldNTP Mixture2.0μlprimerstar PCR Buffer5.0μlP1(10μm)2.0μlP2(10μm)2.0μl模板1.0μlRNase freed H₂O37.0μl反应总体积50μl/样品(Sample)

实施例2：突变毒株W1-HA358禽流感病毒的拯救及其生物学特性观察

1、去内毒素质粒的提取

采用Omega公司生产的无内毒素超纯质粒小提试剂盒(Endo-freePlasmidMiniKitII)提取质粒。具体步骤如下：

(1)将pHW2000-PB1，pHW2000-PB2，pHW2000-PA，pHW2000-HA358，pHW2000-NA，pHW2000-NP，pHW200-M，pHW2000-NS八个已构建好的质粒保存的大肠杆菌菌液接种于100mL的LB液体培养基中，然后在37℃摇床过夜培养大肠杆菌12-16h。

(2)将所有100mL菌液加入50mL离心管中，配平，在4℃，12000r/min离心8min弃去培养基上清，收集菌体。

(3)弃上清，向沉淀中加入适量生理盐水或者PBS重悬菌体，分装到2mL的EP管中，在4℃，12000r/min离心2min弃去培养基上清，收集菌体。

(4)弃上清，加入500μL的SolutionI溶液(加入RNaseA)重悬菌体。

(5)加入500μL的SolutionII溶液，轻轻颠倒混匀7-10次，直至上清清亮(提前将bufferN3放在冰上，离心机降温至4℃。

(6)加入250μL冰浴的BufferN3(试剂盒自带)，并温和地上下颠倒离心管数次至白色絮状沉淀形成为止(上层若有黄色块状物，则是未裂解的菌体)，然后在4℃，12000r/min离心10min。

(7)将上清转移到新的1.5mL的EP管中，再次以4℃，12000r/min离心2min。

(8)将上清转移到新的1.5mL的EP管中，加入0.1倍体积的ETR，轻轻混匀后放在冰上10min，每隔2min颠倒几次(ETR为蓝色溶液，装于白色瓶子中，保存于4℃冰箱，此液体较粘稠，慢慢的吸取，用于去内毒素)。

(9)在冰上放置后，液体清亮，再放到42℃水浴锅中5min，此时液体再次变浑浊，在室温下以12000r/min离心10min，此时ETR沉于管底。

(10)将上清转移到新的2mLEP管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，静置2min；

(11)把HiBindDNAMin柱中提前加入200-300μLbufferGPS浸润，静置5min，在室温下以12000r/min离心30-60s，倒掉收集管中的液体；

(12)将步骤(10)中的溶液转入新的浸润过的HiBindDNAMin柱，每次700μL，静置2min，以12000r/min离心30-60s；

(13)弃掉收集管中的液体，加入500μLbufferHB洗柱子，室温下以12000r/min离心30-60s；

(14)弃掉收集管中的液体，加入700μL洗脱缓冲液(washingbuffer)(加乙醇)洗柱子，室温下以12000r/min离心30-60s；

(15)重复步骤(14)；

(16)把柱子重新放回收集管中，室温下以12000r/min离心2min；

(17)将柱子放入新的1.5mLEP管中，放于42℃温箱中5min，同时将无内毒素洗脱缓冲液(Endo-freeElutionbuffer)放入烘箱中；

(18)取70-100μLEB洗脱液，加入到柱子中央，静置2min，室温下以12000r/min离心2min；

(19)取0.1μLDNA质粒用紫外分光光度计检测浓度后，于-20℃或者-80℃冰箱保存备用。

2、转染用细胞的准备

(1)用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(购买自Thermo公司)分别培养MDCK细胞和293T细胞，待细胞长满单层后，用0.25％的胰酶消化，将细胞吹散后，接入适量细胞至6孔组织培养板中。

(2)其中293T+MDCK细胞混合培养组按细胞比率1：1接6孔组织培养板，待细胞密度长至80％-90％时进行转染。其中，用作转染的细胞，其状态一定要上佳，只有这样才能提供充足的酶类供基因转录所需。

3、八个质粒的共转染

将10μL脂质体(lipofectin)转染试剂按说明书介绍的方法稀释到90μL无血清培养基OPTI-MEM(购自GIBCO公司)中，室温放置5min，另将2-3μg混合质粒(含PB2：PB1：PA：HA：NP：NA：M：NS(浓度比为1：1：0.5：1：1：1：1：1)稀释至100μl无血清培养基OPTI-MEM(购自GIBCO公司)中。然后将稀释的脂质体(lipofectin)(购自Invitrogen公司)缓慢滴加至混合质粒中，轻轻吹吸10余次，充分混匀，室温结合20min，同时设lipofectin对照，缺失一个或几个质粒的对照。将6孔组织培养板中已培养约18-24h，80％-90％丰度、分布均匀、生长状况好的293T+MDCK细胞。用无血清、无抗生素的DMEM培养基洗两次后，再用OPTI-MEM培养基洗一次，最后加入500μLOPTI-MEM培养基(购自GIBCO公司)覆盖于细胞上；加入质粒与lipofectin(购自Invitrogen公司)的结合物(共200μl)，使其均匀覆盖于细胞上，在37℃，5％CO₂培养箱中吸附8h，换入含10％血清的DMEM培养基1mL，30h后用磷酸盐缓冲液(PBS，为常用缓冲液)洗两次，最后加入含终浓度为2.5μg/mLTPCK胰酶(购自上海生工生物工程有限公司)的无血清DMEM培养基1mL，72h后小心吹落细胞，与上清一起收集。

4、W1-HA358禽流感病毒的增殖和鉴定

将转染后收集的细胞及上清中加入适量的双抗(氨苄霉素50mg/ml和卡那霉素50mg/ml)，充分混匀后，以0.2ml/胚的量接种9-11日龄的SPF鸡胚(购自北京梅里亚维通动物实验技术有限公司)，置37℃培养，每日观察鸡胚的死亡情况，适时收集鸡胚尿囊液，然后用红细胞测其血凝价，保存在-80℃冰箱中。在鸡胚上盲传三代，使W1-HA358禽流感病毒在其上稳定增殖。

5、W1-HA358禽流感病毒的细胞感染实验及其在MDCK细胞上的传代

将MDCK细胞培养至单层后传代，将吹散的细胞均匀接入6孔组织培养板中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞丰度达90％以上。将细胞中的培养基弃去后，用PBS洗两次，再用无血清的DMEM将细胞洗一次后，加入用DMEM稀释成10^-1的尿囊液，于37℃，5％CO₂培养箱中吸附1h后，加入含1.0μg/ml胰酶的无血清的DMEM维持液，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。每隔24h取25μL孔上清，测定血凝价。用同样的方法，取上一代的W1-HA358禽流感病毒继续传代，直至W1-HA358禽流感病毒在细胞上能稳定增殖(增殖结果如图4所示)。

6、禽流感病毒株W1-358和禽流感野毒株W1组织半数致感染量(TCID₅₀)的测定

将MDCK细胞培养至单层后传代，将吹散的细胞均匀接入96孔组织培养板中每孔100μL，在37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞丰度达90％以上。将细胞中的培养基弃去后，用PBS洗两次。加入用取冻于-80℃冰箱病毒尿囊液，用无血清DMEM培养基将禽流感病毒从10^-1稀释到10^-6,每个稀释度病毒接种8孔(0.1mL/孔)。做两个重复，放于37℃温箱孵育72h，检测细胞培养基上清血凝价，按Reed-Muench法公式计算半数感染量(结果如表7和表8)。

计算按Reed和Muench法计算：

距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/((高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)

TCID₅₀的对数＝高于50％病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数。

表7禽流感野毒株W1的TCID₅₀

表8禽流感病毒突变株W1-HA358的TCID₅₀

7、禽流感病毒鸡胚半数致死量(ELD₅₀)的测定

取冻于-80℃冰箱禽流感病毒尿囊液，用无菌PBS将禽流感病毒从10^-2稀释到10^-7，每个稀释度病毒接种5枚鸡胚(0.2mL/枚)，放于37℃温箱孵育72h，在24h内死亡的舍弃，然后将鸡胚放在4℃冰箱过夜，检测尿囊液血凝性，按Reed-Muench法公式计算半数致死量(结果见表9和表10)。

表9禽流感病毒突变株W1-HA358的ELD₅₀

表10禽流感野毒株W1-358的ELD₅₀

表9和表10结果表明，病毒稀释度为10^-5时，突变株W1-HA358的毒力相比野毒株W1-358毒力明显下降。

主要参考文献

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