具有改善的甲硫氨酸合酶活性和甲硫氨酸流出的用于甲硫氨酸生产的微生物

摘要

本申请涉及经优化用于发酵生产甲硫氨酸和/或其衍生物的重组微生物，其中在所述重组微生物中，钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性和甲硫氨酸流出得到增强。本申请还涉及用于优化甲硫氨酸和/或其衍生物的发酵生产的方法，其包括下列步骤：c.在包含可发酵碳源和硫源的合适培养基中培养重组微生物，其中在所述微生物中，钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性和甲硫氨酸流出得到增强，和d.从培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物。

说明书

发明领域

本发明涉及可用于生产L-甲硫氨酸和/或其衍生物的重组微生物和用于制备L-甲硫氨酸的方法。本发明的微生物以下述方式修饰，使得通过增强其钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性及其L-甲硫氨酸输出而改善L-甲硫氨酸生产。特别地，基因metH、fldA、fpr或它们的同源基因和基因ygaZ和ygaH或它们同源基因在微生物中是过表达的。

背景技术

含硫化合物(如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸)对于细胞代谢是至关重要的。特别地，L-甲硫氨酸(一种必需氨基酸，其不能由动物合成)在许多身体功能中发挥重要的作用。产业生产的大部分甲硫氨酸广泛用作动物饲料和食物添加剂。

随着由于BSE和禽流感所致的动物来源蛋白质的使用减少，纯甲硫氨酸的需要已经增加。通常，D,L-甲硫氨酸自丙烯醛、甲基硫醇和氢氰酸化学合成。然而，外消旋混合物性能不像纯L-甲硫氨酸一样好(Saunderson,1985)。另外，虽然可以自外消旋甲硫氨酸生成纯L-甲硫氨酸，例如经由N-乙酰基-D,L-甲硫氨酸的酰基酶(acylase)处理，但是这明显增加生产成本。因而，与环境关切偶联在一起的纯L-甲硫氨酸的需要增加使甲硫氨酸的微生物生产成为一种有吸引力的预期。

其它重要的氨基酸(如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸)经由发酵生产以在动物饲料中使用。因此，可以使用葡萄糖和其它可再生资源作为起始材料来生产这些氨基酸。经由发酵生产L-甲硫氨酸尚未获得成功，但是技术的开发在进行中。

先前已经描述了用于优化微生物中的L-甲硫氨酸生成的不同办法(见例如专利或专利申请US7,790,424、US7,611,873、WO2002/10209、WO2005/059093和WO2006/008097)；然而，从微生物中产业生产L-甲硫氨酸需要进一步改善。

在大肠杆菌(Escherichiacoli)中，两种独特的酶催化甲硫氨酸的从头生物合成中的末端步骤；含有活性所需的辅基的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶(MetH,EC2.1.1.13)和不依赖于钴胺素的甲硫氨酸合酶(MetE,EC2.1.1.14)(Foster等,1961；Gonzalez等,1992)。钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶MetH是一种含有4个域的～136kDa的蛋白质：含有钴胺素辅因子的域(Cob域)、结合甲基-THF底物的域(CH3-THF域)、结合高半胱氨酸底物的域(Hcy域)、和结合S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)的域(Adomet域)(Matthews,2001)。在氧的存在下，酶被氧化失活(Banerjee等,1990)。为了再活化酶，发生还原性甲基化。该反应牵涉与酶的AdoMet域结合的由SAM提供的甲基基团，和经由外部转运链转移的两个电子。在大肠杆菌中，两个电子由NADPH提供，并且经由由含有FAD的黄素氧还蛋白还原酶(flavodoxine还原酶)FldA和含有FMN的黄素氧还蛋白还原酶Fpr构成的下行电势驱动的氧化还原链转移(Fujii&Huennekens,1974；Wan&Jarrett,2002)。如专利申请WO2009/144270中公开的，在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中，已经鉴定了FldA和Fpr的功能性同源物。它们分别是FdxC、FdxD或FdxA和FprA1、FprA2、FprA3或FldR1。

蛋白质复合物YgaZ和YgaH是负责输出L-缬氨酸的支链氨基酸输出蛋白(LIV-E)家族的成员。以相同的方式，YgaZH也参与甲硫氨酸的输出，如它由及同事对于BrnFE(来自谷氨酸棒杆菌的YgaZH的同源物)所显示的(等,2005)。

关于通过不同手段改善甲硫氨酸合酶活性以生成L-甲硫氨酸，提交了许多专利申请：

-来自BASF的WO2007/012078和WO2007/135188要求保护除了其它修饰以外导致至少metH和/或metE过表达的遗传改变，

-来自Evonik的WO2009/144270公开了用微生物生产甲硫氨酸的方法，所述微生物展现钴(I)胺素依赖性MetH再活化系统的量和/或活性增加，

-来自Evonik的WO2008/080900要求保护MetH^FBR形式(反馈抗性)，其应当对高L-甲硫氨酸浓度更有抗性。

以相同的方式，少数专利公开了不同微生物中编码甲硫氨酸分泌系统的基因的过表达：

-专利申请WO2002/097096和WO2005/085463(Degussa)中描述了棒杆菌属(Corynebacterium)中L-甲硫氨酸摄取的减少或

-专利申请EP1239041(Ajinomoto)和WO2008/082211(CJCorporation)中公开了负责L-缬氨酸和L-甲硫氨酸的输出的支链氨基酸输出蛋白(YgaZH)的过表达。

本发明人已令人惊讶且出乎意料地发现，重组L-甲硫氨酸过度生产者微生物中L-甲硫氨酸流出的增加以及钴胺素依赖性L-甲硫氨酸合酶活性的增强改善甲硫氨酸生产。

发明概述

本发明涉及用于优化甲硫氨酸和/或其衍生物生产的重组微生物和方法，其中增强钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性和甲硫氨酸流出。在重组微生物中，通过过表达metH的表达，和任选地来自大肠杆菌的基因fldA和fpr或它们来自谷氨酸棒杆菌的同源基因的表达而增强钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性，而通过过表达来自大肠杆菌的基因ygaZH或来自谷氨酸棒杆菌的brnFE或它们的同源基因而增强甲硫氨酸流出。

重组微生物还可包含其它遗传修饰，如：

-至少一种下述基因的表达增加：ptsG，pyc，pntAB，cysP，cysU，cysW，cysA，cysM，cysJ，cysI，cysH，gcvT，gcvH，gcvP，lpd，serA，serB，serC，cysE，metF，metA，编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA*等位基因，thrA，或编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA*等位基因和/或

-下述基因之一的表达减弱：metJ，pykA，pykF，purU，ybdL，udhA，dgsA，metE，metN，metI，metQ或yncA。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及重组微生物，其中：a)基因metH，和任选地来自大肠杆菌的基因fldA和fpr或它们来自谷氨酸棒杆菌的同源基因是过表达的，b)来自大肠杆菌的基因ygaZ和ygaH或来自谷氨酸棒杆菌的基因brnF和brnE或它们源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌的同源基因是过表达的，并且c)基因metA*，cysPUWAM，cysJIH，gcvTHP，metF，serA，serB，serC，cysE，thrA*，ptsG和pyc的表达是增强的；并且d)基因metJ，pykA，pykF，purU，yncA，dgsA和metE的表达是减弱的。

优选地，重组微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。

发明详述

在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于具体例示的方法，并且当然可以有所变化。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述本发明的具体实施方案，而并不意图为限制性的，其仅会以所附权利要求限定。

本文中(无论在上文还是在下文)引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过提述以它们的整体并入。

此外，除非另有指示，本发明的实践采用本领域技术内的常规微生物学和分子生物学技术。此类技术是技术人员公知的，并且在文献中完整解释。

必须注意到，如本文中及所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指称，除非上下文另有明确规定。如此，例如提及“微生物”包括复数的此类微生物，并且提及“内源基因”是指一个/种或多个/种内源基因，等等。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的材料和方法相似或等同的任何材料和方法可以用于实施或测试本发明，但是现在描述优选的材料和方法。

在所附权利要求中及在本发明的连续描述中，除了上下文由于表达文字或必要含意而另有要求的情况外，词语“包含”、“含有”、“牵涉”、或“包括”或变型以包括在内的意义使用，即，以详明所述特征的存在，而不是排除本发明的多个实施方案中的其它特征的存在或添加。

术语“甲硫氨酸”和“L-甲硫氨酸”指具有化学式HO₂CCH(NH₂)CH₂CH₂SCH₃和用于特定L-异构体的CAS编号59-51-8或63-68-3的必需含硫氨基酸。

“甲硫氨酸的衍生物”指呈现相同化学主链但是与甲硫氨酸相差至少一个化学基团的类似甲硫氨酸的分子。在本发明中，优选的甲硫氨酸衍生物是N-乙酰基甲硫氨酸(NAM)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和羟基-甲硫氨酸(或甲硫氨酸羟基类似物或MHA)。

如本文中使用的，术语“微生物”指没有人工修饰的细菌、酵母或真菌。优选地，微生物选自下组：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)、或棒杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优选地，本发明的微生物是菌种大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。

如本文中使用的，术语“重组微生物”或“经遗传修饰的微生物”指在自然界中找不到，并且与其在自然界中找到的等同物有遗传差异的细菌、酵母或真菌。这意味着它通过导入或者通过缺失或者通过修饰遗传元件来修饰。它也可以通过将定向诱变和特定选择压力下的进化组合，从而迫使新代谢途径的形成和进化来转化(见例如WO2004/076659或WO2007/011939)。

若外源基因与容许它们在宿主微生物中表达的所有元件一起导入微生物中，则微生物可以修饰为表达这些基因。用外源DNA修饰或“转化”微生物对于本领域技术人员是常规任务。

微生物可经修饰以调控内源基因的表达水平。

术语“内源基因”意指基因在任何遗传修饰前存在于微生物中。可通过在内源调节元件外引入异源序列或者引入异源序列替换内源调节元件，或者通过将基因的一个或多个补充拷贝引入染色体或质粒中而过表达内源基因。内源基因也可经修饰以调控其表达和/或活性。例如，可将突变引入编码序列中以修饰基因产物或者可在内源调节元件外引入异源序列或者引入异源序列来替换内源调节元件。内源基因的调控可导致基因产物活性的上调和/或增强，或者下调和/或降低内源基因产物的活性。

调控其表达的另一种方式是将基因的内源启动子(例如野生型启动子)与更强或更弱的启动子交换以上调或下调内源基因的表达。这些启动子可以是同源的或异源的。它完全在本领域技术人员选择合适启动子的能力内。

相反，“外源基因”意指通过本领域技术人员已知的手段将基因导入微生物中，而此基因不天然存在于微生物中。外源基因可以整合到宿主染色体中，或者由质粒或载体在染色体外表达。多种质粒(它们就其复制起点和其在细胞中的拷贝数而言有所不同)是本领域中已知的。这些基因可以是同源的。

在本发明的上下文中，术语“同源基因”不限于指具有理论共同遗传祖先的基因，还包括可以在遗传上无关的基因，其虽然如此已进化成编码执行相似功能和/或具有相似结构的蛋白质。因此，就本发明而言，术语“功能性同源物”涉及如下事实：某种酶活性可不仅由限定氨基酸序列的特定蛋白质提供，还由来自其它(不)相关微生物的相似序列的蛋白质提供。

使用在Genbank中对已知基因给出的参考，本领域技术人员能够确定其它生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。有利地，使用共有序列完成此常规工作，所述共有序列可通过与源自其它微生物的基因进行序列比对，并且设计简并探针来克隆另一种生物体中的相应基因来确定。分子生物学的这些常规方法是本领域技术人员公知的。

如本文中使用的，术语“改善的甲硫氨酸产量”、“改善甲硫氨酸产量”及其语法等同物指增加的甲硫氨酸/碳源得率(每克/mol消耗的碳源所生成的克/mol甲硫氨酸的比率，它可以百分比表示)和/或生成的甲硫氨酸的改善的纯度。在本发明中，可通过降低酮戊酸甲酯(ketomethylvalerate)和/或高羊毛氨酸(homolanthionine)的生成提高生成的甲硫氨酸的纯度。用于测定消耗的碳源量和生成的甲硫氨酸的方法是本领域技术人员公知的。与相应的未修饰的微生物相比，生成的甲硫氨酸的得率和/或纯度在重组微生物中更高。

术语“优化用于发酵生产甲硫氨酸的微生物”指与相应的野生型微生物的内源生产相比经进化和/或遗传修饰以呈现改善的甲硫氨酸生产的微生物。“优化”用于甲硫氨酸生产的此类微生物是本领域中公知的，并且已经特别在专利申请WO2005/111202、WO2007/077041、WO2009/043803和WO2012/098042中公开。

根据本发明，术语“发酵生产”、“培养”或“发酵”用于表示细菌生长。此生长通常在具有合适培养基的发酵罐中进行，所述培养基适于使用的微生物且含有至少一种简单碳源和(如果需要的话)共底物。

“合适的培养基”意指包含对于细胞的维持和/或生长必需或有益的营养物，如碳源或碳底物、氮源(例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵)；磷源(例如磷酸一钾或磷酸二钾)；痕量元素(例如金属盐)，例如镁盐、钴盐和/或锰盐；及生长因子，如氨基酸和维生素的培养基(例如无菌液体培养基)。

根据本发明的术语“碳源”或“碳底物”或“碳的来源”意指本领域技术人员可用于支持微生物的正常生长的任何碳源，包括单糖(如葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖或乳糖)、寡糖、二糖(如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纤维素及其组合。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一种优选的简单碳源是蔗糖。碳源可源自可再生原料。可再生原料定义为某些产业工艺需要的原材料，其可在短暂的延迟内且以足以允许其转化成期望产物的量再生。经处理或未处理的植物生物量是一种感兴趣的可再生碳源。

根据本发明的术语“硫源”指硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐(dithionate)、连二亚硫酸盐(dithionite)、亚硫酸盐、甲硫醇(methylmercaptan)、二甲基硫化物(dimethylsulfide)和其它甲基加帽的硫化物或不同来源的组合。更优选地，培养基中的硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐或其混合物。

术语“氮源”对应于铵盐或氨性气体。氮源以铵或含氨形式供应。

术语“减弱”或“表达减弱”在此上下文中意指与非修饰微生物相比基因的表达或酶的生成是降低或抑制的，导致与非修饰微生物相比核糖核酸、蛋白质或酶的胞内浓度的降低。本领域技术人员已知测量细胞中的核糖核酸浓度或蛋白质浓度的不同手段和方法，包括例如使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时聚合酶链式反应(qPCR)来测定核糖核酸浓度及使用特异性抗体来测定特定蛋白质的浓度。

酶生成的降低或抑制通过减弱编码所述酶的基因的表达获得。

可通过本领域技术人员已知的手段和方法实现基因的减弱。一般地，基因表达的减弱可通过如下实现：

-突变编码区或启动子区或

-缺失对于基因表达必需的全部或部分的启动子区或，

-通过同源重组缺失全部或部分的基因编码区或，

-将外部元件插入编码区或启动子区中或

-在弱启动子或诱导型启动子的控制下表达基因。

本领域技术人员知道展现不同强度的多种启动子以及哪种启动子用于弱或诱导型遗传表达。

术语酶的“活性”与术语“功能”可互换使用，在本发明的上下文中意指由酶催化的反应。本领域技术人员知道如何测量所述酶的酶活性。

术语酶的“减弱活性”或“降低活性”意指通过氨基酸序列中的突变获得的蛋白质的特定催化活性降低和/或通过突变核苷酸序列或通过缺失基因的编码区获得的细胞中的蛋白质浓度降低。

术语酶的“增强活性”或“增加活性”意指例如通过过表达编码酶的基因获得的酶的特定催化活性升高和/或细胞中酶的量/可用度增加。

术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过表达”及其语法等同物在文本中可互换使用，并且具有相似的意义。这些术语意指与非修饰微生物相比基因的表达或酶的生成是增加的，导致与非修饰微生物相比核糖核酸、蛋白质或酶的胞内浓度增加。本领域技术人员知道测量细胞中的核糖核酸浓度或蛋白质浓度的不同手段和方法，包括例如使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时聚合酶链式反应(qPCR)来测定核糖核酸浓度及使用特异性抗体来测定特定蛋白质的浓度。

增加的酶生成通过增加编码所述酶的基因的表达来获得。

为了增加基因的表达，本领域技术人员已知不同的技术，如：

-增加微生物中的基因拷贝数。所述基因在染色体中或染色体外编码。在基因位于染色体上时，可通过本领域技术人员已知的重组方法(包括基因替换)在染色体上引入基因的几个拷贝。在基因位于染色体外时，它可以由不同类型的质粒携带，所述质粒就其复制起点以及如此其在细胞中的拷贝数而言有所不同。取决于质粒的性质，这些质粒在微生物中以1至5个拷贝、或约20个拷贝、或直至500个拷贝存在：紧密复制的低拷贝数质粒(例如对于大肠杆菌pSC101、RK2)、低拷贝数质粒(例如对于大肠杆菌pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(例如对于大肠杆菌pSKbluescriptII)。

-使用导致高水平的基因表达的启动子。本领域技术人员知道哪些启动子是最方便的，例如启动子Ptrc、Ptac、Plac或lambda启动子cI是广泛使用的。这些启动子可被特定化合物或特定的外部条件(如温度或光)“诱导”。这些启动子可以是同源或异源的。

-减弱基因特异性或非特异性的转录阻抑物的活性或表达。

-使用使相应信使RNA稳定的元件(Carrier和Keasling,1999)或使蛋白质稳定的元件(例如GST标签，GEHealthcare)。

术语“编码”指多核苷酸经由转录和翻译机制生成氨基酸序列的过程。编码酶的基因可以是外源或内源的。

术语“反馈敏感性”或“反馈抑制”指催化细胞中的特定物质生成的一种或几种酶在所述物质已经积累到某种水平时受到抑制或不太有活性的细胞机制控制。因此，术语“降低的反馈敏感性”或“降低的反馈抑制”意指与非修饰微生物相比此类机制的活性是降低或抑制的。本领域技术人员知道如何修饰酶以获得此结果。此类修饰已经描述于专利申请WO2005/111202或专利US7,611,873中。

在本发明的第一个方面中，重组微生物通过增强钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性以及通过增强所述微生物中的甲硫氨酸流出而经优化用于发酵生产甲硫氨酸和/或其衍生物。优选地，重组微生物选自肠杆菌科或棒杆菌科。更优选地，本发明的重组微生物选自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。

如上文所述，钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性由MetH酶介导。为了具有持续的活性，此酶需要再活化系统。此系统由大肠杆菌中的两个基因fldA和fpr编码，且由谷氨酸棒杆菌中分别选自fdxC、fdxD或fdxA和fprA1、fprA2、fprA3或fldR1的基因编码。在本申请中，术语“MetH及其再活化系统”或“metH、fldA、fpr”指钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶及其在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌两者中的再活化系统或它们来自大肠杆菌及来自谷氨酸棒杆菌两者的编码基因。如此，优选通过过表达metH基因以及还有其由fldA和fpr基因编码的再活化系统进行钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性的增强。

在本发明的一个实施方案中，通过过表达来自大肠杆菌的基因metH、fldA、fpr或其来自谷氨酸棒杆菌的同源基因(增强其表达)而增强钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性。优选地，这些基因在与其野生型启动子不同的启动子下过表达。

更优选地，在染色体中过表达基因metH、fldA或fpr或它们来自谷氨酸棒杆菌的同源基因，即从染色体中过表达这些基因。在微生物的染色体上引入每种基因的一个或几个补充拷贝。它们整合于选自专利申请WO2011/073122中公开的列表并且其缺失对甲硫氨酸生成没有影响的不同基因座。每种基因的编码序列的野生型拷贝是保守的，但是其启动子区可以由人工启动子和/或核糖体结合位点(RBS)替换。

在本发明的一个具体的实施方案中：

-野生型metH基因是保守的，具有其天然启动子和RBS的替换，并且在染色体上引入两个额外的拷贝，以及

-野生型fldA和fpr基因及其启动子区是保守的，并且在染色体上引入每种基因的一个额外拷贝。

在人工启动子和RBS的控制下表达引入的基因的额外拷贝。

在氨基酸生产者微生物中，通过特定的流出转运蛋白分泌甲硫氨酸。值得注意的是，在大肠杆菌中，此转运蛋白称作YgaZH，并且由ygaZ和ygaH基因编码，而在谷氨酸棒杆菌中，它命名为BrnFE，并且由brnF和brnE基因编码。已经在几种其它微生物中鉴定出此甲硫氨酸流出系统的功能性同源物。在本发明中，重组微生物过表达来自大肠杆菌的ygaZH基因或来自谷氨酸棒杆菌的brnFE基因。或者，本发明的重组微生物可过表达YgaZH或BrnFE转运蛋白的功能性同源物。表1和表2中分别呈现了YgaZ和YgaH同源蛋白。

表1：YgaZ同源蛋白

表2：YgaH同源蛋白

通过表中对每种同源物公开的登录号，本领域技术人员能够在例如NCBI数据库上获得氨基酸序列及其核苷酸编码序列。

从氨基酸序列或核苷酸序列中，获得编码这些同源物的基因对于本领域技术人员是常规任务。它可以通过从其氨基酸序列中人工合成编码感兴趣蛋白质的基因或者通过从相应的基因组DNA中PCR扩增感兴趣的编码区完成。在本发明的上下文中，这些基因称作“ygaZ或ygaH同源基因”。可针对宿主微生物的密码子偏爱调节这些ygaZH同源基因的序列。

在本发明的一个具体的实施方案中，重组微生物过表达编码其序列分别以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2公开的蛋白质的来自大肠杆菌的基因ygaZ和ygaH或来自谷氨酸棒杆菌的brnF和brnE或其同源基因。优选地，ygaZ和ygaH同源基因由源自同一生物体的基因对构成以及由ygaZ的同源基因和ygaH的同源基因构成。然而，可使用来自第一生物体的ygaZ同源基因和来自第二生物体的ygaH同源基因的错配对。优选地，过表达基因ygaZH、brnFE或其同源基因。

YgaZH同源基因选自编码分别在表1和表2中公开的YgaZ和YgaH同源物的基因。优选地，ygaZH同源基因选自编码来自柠檬酸杆菌属(Citrobacter)菌种、志贺氏菌属(Shigella)菌种、拉乌尔菌属(Raoultella)菌种、肠杆菌属(Enterobacter)菌种、耶尔森氏菌属(Yersinia)菌种和光杆状菌属(Photorhabdus)菌种的YgaZH同源物的基因。更优选地，ygaZH同源基因源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌。最优选地，ygaZH同源基因源自克氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌或肠杆菌属菌种。

因此，ygaZH同源基因优选选自编码分别如下限定的YgaZ同源物和YgaH同源物对的基因：来自克氏柠檬酸杆菌的SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、来自弗氏志贺氏菌的SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、来自解鸟氨酸拉乌尔菌的SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、来自肠杆菌属菌种(R4-368)的SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、来自小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎亚种的SEQIDNO:11或12和SEQIDNO:13或14、发光光杆状菌laumondii亚种的SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、来自杨氏柠檬酸杆菌的SEQIDNO:17和SEQIDNO:18、来自弗氏柠檬酸杆菌的SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。

在本发明的一个优选的实施方案中，在诱导型启动子的控制下过表达这些基因ygaZH或brnFE或源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌的同源基因。本领域技术人员知道此类诱导型启动子。例如，可在本发明的重组微生物中使用启动子，像λP_R或λP_L来过表达ygaZH基因或brnFE基因或源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌的ygaZH同源基因。

本发明的另一个目的是鉴定ygaZH同源基因并且单独或与如下文公开的其它遗传修饰组合在氨基酸生产者微生物中过表达所述基因。

甲硫氨酸生物合成途径的优化

修饰根据本发明的重组微生物以改善甲硫氨酸的生成。参与甲硫氨酸生成的基因是本领域中公知的，并且包括参与甲硫氨酸特异性生物合成路径的基因以及参与前体提供途径的基因和参与甲硫氨酸消耗途径的基因。

甲硫氨酸的有效生成需要优化甲硫氨酸特异性途径和几种前体提供途径。特别地，甲硫氨酸生成菌株已经记载于专利申请WO2005/111202、WO2007/077041和WO2009/043803。这些申请并入本申请作为参考。

除非另有叙述，下文提及的关于甲硫氨酸生物合成途径优化的所有基因指来自大肠杆菌的那些。

在本发明的一个具体的实施方案中，如下文描述修饰重组微生物：选自下组的至少一种基因的表达是增加的：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metA、编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶的metA*等位基因、thrA、或编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶的thrA*等位基因。

·ptsG编码如专利申请WO2013/001055中描述的PTS酶IICB^Glc，

·pyc编码如专利申请WO2013/001055中描述的丙酮酸羧化酶。在一个优选的实施方案中，pyc基因是异源的，并且选自来自埃特里根瘤菌(Rhizobiumetli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或棒杆菌属菌种的pyc基因，

·pntAB编码膜结合转氢酶的亚基，如专利申请WO2012/055798中描述的，

·cysP编码周质硫酸盐结合蛋白，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的，

·cysU编码硫酸盐ABC转运蛋白的组分，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的，

·cysW编码膜结合硫酸盐转运蛋白，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的，

·cysA编码硫酸盐通透酶，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的，

·cysM编码O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶(sulfhydralase)，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的，

·cysI和cysJ分别编码亚硫酸盐还原酶的α和β亚基，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的。优选地，cysI和cysJ一起过表达，

·cysH编码腺苷酰硫酸还原酶，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的。

提高C1代谢也是导致改善的甲硫氨酸生成的修饰。它涉及选自下组的参与C1代谢的至少一种酶的活性的增加：GcvTHP、Lpd、MetF或MetH。在本发明的一个优选的实施方案中，通过增强下列至少一项的表达和/或活性而提高一种碳代谢：

·gcvT、gcvH、gcvP和lpd，其编码甘氨酸切割复合物，如记载于专利申请WO2007/077041的。甘氨酸切割复合物(GCV)是一种多酶复合物，其催化甘氨酸的氧化，产生二氧化碳、氨、亚甲基-THF和还原性吡啶核苷酸。GCV复合物由4种蛋白质组分组成，即甘氨酸脱氢酶(所述P蛋白)(GcvP)、硫辛酰-GcvH-蛋白(所述H蛋白)(GcvH)、氨基甲基转移酶(所述T蛋白)(GcvT)、和二氢硫辛酰胺脱氢酶(所述L蛋白)(GcvL或Lpd)。P蛋白催化磷酸吡哆醛依赖性的自甘氨酸的CO2释放，留下甲胺部分。甲胺部分被转移到H蛋白的硫辛酸基团，其在甘氨酸脱羧前与P蛋白结合。T蛋白催化NH3自甲胺基团的释放，并且将剩余的C1单元转移到THF，形成亚甲基-THF。然后，L蛋白氧化H蛋白的硫辛酸组分，并且将电子转移到NAD⁺，形成NADH；

·MetF，其编码亚甲基四氢叶酸还原酶，如记载于专利申请WO2007/07704的。

参与丝氨酸生物合成的至少一种下述基因的过表达也降低副产物异亮氨酸的生成：

·serA，其编码磷酸甘油酸脱氢酶，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的，

·serB，其编码磷酸丝氨酸磷酸酶，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的，

·serC，其编码磷酸丝氨酸氨基转移酶，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的。

已经显示下述基因的过表达改善甲硫氨酸的生成：

·cysE编码丝氨酸酰基转移酶；其过表达容许甲硫氨酸生成的增加，如记载于WO2007/077041的；

·metA编码高丝氨酸琥珀酰转移酶。等位基因metA*编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶。优选地，使用专利申请WO2005/111202中描述的等位基因metA*；

·thrA编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶；thrA*等位基因编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶，如记载于WO2005/111202的。

在本发明的一个具体的实施方案中，至少一种所述基因在诱导型启动子的控制下。在本发明的一个优选的实施方案中，这些基因中的至少一种在温度诱导型启动子的控制下。优选地，至少一种下述基因的表达直接或间接在诱导型启动子的控制下：thrA、cysE、metA。更优选地，基因thrA、cysE和metA直接或间接在诱导型启动子的控制下。在本发明的一个优选实施方案中，thrA基因的表达在诱导型启动子的直接控制下，并且cysE基因的表达在thrA基因的诱导型表达的极性效应下。在本发明的另一个优选实施方案中，thrA基因的表达在诱导型启动子的直接控制下，并且cysE和metA基因的表达在thrA基因的诱导型表达的极性效应下。

在一个最优选的实施方案中，温度诱导型启动子属于P_R启动子家族。具有诱导型启动子控制下的基因的甲硫氨酸生成菌株记载于专利申请WO2011/073122。

在本发明的另一个具体的实施方案中，已经进一步修饰微生物，并且减弱至少一种下述基因的表达：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、metE、dgsA、metN、metI、metQ或udhA。

·基因metJ编码负责甲硫氨酸调节子下调的阻抑物蛋白MetJ(GenBank1790373)，如专利申请JP2000/157267中提示的，

·基因pykA和pykF编码酶“丙酮酸激酶”。至少一种或两种丙酮酸激酶的表达的减弱降低磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的消耗。增加的PEP利用度可增加草乙酸(天冬氨酸的一种重要前体，天冬氨酸又是甲硫氨酸的前体)的生成，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的，

·purU编码甲酰四氢叶酸去甲酰酶，即一种催化甲酰基-THF去甲酰酶反应的酶。去甲酰酶活性的减弱增加甲基-THF的生成，所述甲基-THF是高半胱氨酸甲基化需要的。通过去甲酰化丧失C1代谢物导致不能转化成甲硫氨酸的高半胱氨酸的生成增加。然后，高半胱氨酸可为用于酶胱硫醚γ合酶(MetB)的底物，该胱硫醚γ合酶(MetB)可催化O-琥珀酰高丝氨酸和高半胱氨酸之间的反应，导致高羊毛氨酸(homolanthionine)的生成，如记载于WO2007/077041和WO2009/043803的，

·ybdL编码氨基转移酶，如记载于专利申请WO2012/090021的，

·yncA编码N-酰基转移酶，如记载于专利申请WO2010/020681的，

·metE编码不依赖于钴胺素的甲硫氨酸合酶，如记载于专利申请PCT/IB2012/001336的，

·dgsA(以Mlc更为有名)编码转录双重调控物，其控制编码磷酸转移酶(PTS)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)系统的酶的基因的表达，如记载于专利申请WO2013/001055，

·metN、metI、metQ编码甲硫氨酸摄取系统，

·udhA编码可溶性吡啶核苷酸转氢酶，如记载于专利申请WO2012/055798。

在本发明的一个更优选的实施方案中，通过重组微生物(其中甲硫氨酸输入是减弱的，并且甲硫氨酸流出是增强的)从作为主要碳源的葡萄糖发酵生产甲硫氨酸和/或其衍生物可在所述微生物中经由上文讨论的修饰的组合实现，例如：

减弱基因metJ的表达，并且增强编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶(MetA*)的metA*等位基因的表达；

减弱基因metJ的表达；增强编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶(MetA*)的metA*等位基因的表达；并且增强编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶(thrA*)的thrA*等位基因的表达；

减弱基因metJ的表达；增强编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶(MetA*)的metA*等位基因的表达；增强编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶(thrA*)的thrA*等位基因的表达；并且增强基因cysE的表达；

减弱基因metJ的表达；增强编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有降低的反馈敏感性的酶(MetA*)的metA*等位基因的表达；增强编码对苏氨酸具有降低的反馈抑制的酶(thrA*)的thrA*等位基因的表达；增强基因cysE的表达；并且增强基因metF的表达。

在本发明的一个具体的方面中，重组微生物包含下述遗传修饰：

·过表达基因metH、及来自大肠杆菌的fldA和fpr或它们来自谷氨酸棒杆菌的同源基因，

·过表达来自大肠杆菌的基因ygaZ和ygaH或来自谷氨酸棒杆菌的基因brnF和brnE或它们源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌的同源基因，

·增强基因metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG和pyc的表达，并且

·减弱基因metJ、pykA、pykF、purU、metE、dgsA和yncA的表达。

在本发明的一个具体的实施方案中，要修饰的微生物来自细菌的肠杆菌科或棒杆菌科。

优选地，要修饰的微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。

培养条件

在本发明的第二个方面中，所述方法经优化用于发酵生产甲硫氨酸和/或其衍生物。它包括下列步骤：

-在包含可发酵碳源和硫源的合适培养基中培养重组微生物，其中通过分别过表达基因metH，和任选地来自大肠杆菌的基因fldA和fpr基因或它们来自谷氨酸棒杆菌的同源基因和来自大肠杆菌的基因ygaZH或来自谷氨酸棒杆菌的基因brnFE或它们同源基因而增强钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性和甲硫氨酸流出，并且

-从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物。

本领域技术人员能够为根据本发明的微生物限定培养条件。特别地，在20℃-55℃，优选25℃-40℃，且更特别是约30℃(对于谷氨酸棒杆菌)和约37℃(对于大肠杆菌)的温度发酵细菌。

对于大肠杆菌，培养基可与M9培养基(Anderson,1946)、M63培养基(Miller,1992)；或如由Schaefer等,(1999)限定的培养基具有相同或相似的组成。

对于谷氨酸棒杆菌，培养基可与BMCG培养基(Liebl等,1989)或与如由Riedel等,(2001)限定的培养基具有相同或相似的组成。

在本发明的方法中，在重组微生物中过表达的ygaZH同源基因优选选自下组：来自柠檬酸杆菌属菌种、志贺氏菌属菌种、拉乌尔菌属菌种、肠杆菌属菌种、耶尔森氏菌属菌种和光杆状菌属菌种，且更优选源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌的同源基因。

在方法的一个具体的实施方案中，重组微生物包含下述遗传修饰：

a.过表达基因metH，及来自大肠杆菌的fldA和fpr，或它们来自谷氨酸棒杆菌的同源基因，以及

b.过表达来自大肠杆菌的基因ygaZH，或来自谷氨酸棒杆菌的brnFE或它们的同源基因。

在本发明的此具体的实施方案中，所述ygaZH同源基因优选选自下组：来自柠檬酸杆菌属菌种、志贺氏菌属菌种、拉乌尔菌属菌种、肠杆菌属菌种、耶尔森氏菌属菌种和光杆状菌属菌种的同源基因，且更优选选自下组：来自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌的同源基因。

在本发明的方法中，在重组微生物中过表达的ygaZH同源基因最优选源自克氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌或肠杆菌属菌种。

在本发明的一些实施方案中，重组微生物的生长经受培养基中一种或几种无机底物，特别是磷酸盐和/或钾的限制或饥饿/缺乏。它指微生物的生长受到仍允许弱生长的供应的无机化学物的量控制的条件。对微生物生长的此类限制已经记载于专利申请WO2009/043372。在本发明的一个优选的实施方案中，培养物经受磷酸盐限制。

“从培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物”的行动意指回收L-甲硫氨酸和/或其衍生物之一，特别是N-乙酰基甲硫氨酸(NAM)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和可能有用的所有其它衍生物，如羟基-甲硫氨酸(或甲硫氨酸羟基类似物或MHA)的行动。用于回收和纯化生成的化合物的方法是本领域技术人员公知的(特别参见WO2005/007862，WO2005/059155)。优选地，回收甲硫氨酸和/或其衍生物的步骤包括浓缩发酵液中的甲硫氨酸和/或其衍生物的步骤。

可使用本领域中已知的许多方法，例如高效液相层析(HPLC)或气相层析(GC)测定发酵培养基中的产物量。例如，使用L-甲硫氨酸(Fluka,Ref64319)作为标准品在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC测量培养基中获得的甲硫氨酸的量。使用NAM(Sigma,Ref01310)作为标准品，使用折射测定HPLC测定NAM的量。

实施例

下述实施例证明了微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中编码L-甲硫氨酸分泌系统的基因的过表达以及编码B12依赖性甲硫氨酸合酶及其再活化系统的基因的过表达如何改善甲硫氨酸生成。

在下文给出的实施例中，使用本领域中已知的方法来构建含有复制载体和/或多种染色体插入、缺失和取代的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株，其使用由Datsenko&Wanner,(2000)(对于大肠杆菌)和在专利WO2007012078(对于谷氨酸棒杆菌)中充分描述的同源重组进行。

以相同的方式，使用质粒或载体以在重组微生物中表达或过表达一种或几种基因是本领域技术人员已知的。

合适的大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc、pACYC184npBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236等。

合适的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌穿梭载体的例子是例如pClik5aMCS(WO2005059093)或可见于Eikmanns等,(1991)。

操作棒杆菌属的合适载体的例子可见于2005年由Eggeling和Bott编的棒杆菌属的手册。

方案

已经使用几种方案来构建下述实施例中描述的甲硫氨酸生成菌株。

本发明中使用的方案1(通过同源重组进行的染色体修饰、选择重组体和抗生素盒切除)和方案2(噬菌体P1的转导)已经完整记载于专利申请WO2013/001055。

方案3：重组质粒的构建

重组DNA技术是本领域技术人员完善描述且已知的。

简言之，使用寡核苷酸(本领域技术人员会能够设计)和MG1655基因组DNA作为基质PCR扩增DNA片段。用相容的限制酶消化DNA片段和选择的质粒，连接，然后在感受态细胞中转化。分析转化体，并且通过DNA测序验证感兴趣的重组质粒。

表3：下述实施例中引用的序列

实施例1：在L-甲硫氨酸过度生成者大肠杆菌重组菌株菌株1中过度生成钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶或过度生成L-甲硫氨酸分泌系统以及菌株2、3、4、5和6的构建

菌株1：参照菌株

专利申请WO2013/001055(其并入本申请作为参考)中描述的甲硫氨酸生成菌株17在本申请中重新命名为菌株1。提醒的是，此菌株过表达metH，这是由于在其内源基因座处在metH基因前整合的人工启动子和核糖体结合位点(关于详情，参见专利申请WO2007/077041)。此菌株还含有专利申请WO2013/190343中公开的metH基因中的突变。

菌株5的构建：过度生成钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶，过表达metH、fldA和fpr

在菌株1的遗传背景中全部过表达编码钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶的大肠杆菌基因metH和编码MetH的再活化系统的基因fldA和fpr。

在使用菌株1前，使用Flp重组酶从ΔdgsA修饰除去抗生素盒，如Datsenko&Wanner,2000描述(根据方案1)。选择卡那霉素敏感性转化体，并且用合适的寡核苷酸通过PCR分析验证dgsA基因座处的抗生素盒的缺乏。保留的菌株命名为菌株2。

为了过表达metH，在染色体上在两个不同基因座ybeM和ypjC(选自专利申请WO2011/073122中公开的列表，并且其缺失对甲硫氨酸生成没有影响)处整合与如专利申请WO2007/077041中描述的相同启动子和核糖体结合位点可操作连接的此基因。

为了强烈过表达metH，使用由Datsenko&Wanner,2000(根据方案1)描述的同源重组策略。对于这两处染色体整合，通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)PCR扩增片段，所述片段携带与其人工启动子连接的metH基因和抗性标志物，两者侧翼为与靶向整合基因座ybeM或ypjC同源的DNA序列。用于重组入ybeM和ypjC中的序列对于ybeM和ypjC分别称为SEQIDN°21和22，及SEQIDN°23和24(表3中列出)。然后，通过电穿孔分别将获得的PCR产物“ΔybeM::metH::Km”和“ΔypjC::metH::Cm”导入菌株MG1655metA*11(pKD46)中。选择抗生素抗性转化体，并且用合适的寡核苷酸通过PCR分析验证在靶定基因座处具有抗性盒的metH基因插入。保留的菌株命名为MG1655metA*11ΔybeM::metH::Km和MG1655metA*11ΔypjC::metH::Cm。最终，通过P1噬菌体转导将ΔybeM::metH::Km和ΔypjC::metH::Cm染色体整合从MG1655metA*11ΔybeM::metH::Km和MG1655metA*11ΔypjC::metH连续(根据方案2)转移到菌株2。选择氯霉素或卡那霉素抗性转导体，并且用合适的寡核苷酸通过PCR分析验证ΔybeM::metH::Km和ΔypjC::metH::Cm染色体整合的存在。保留的菌株称作菌株3。

如由Datsenko&Wanner,2000描述(根据方案1)，使用Flp重组酶从在ybeM和ypjC基因座处对菌株3进行的染色体整合除去抗生素盒。选择卡那霉素和氯霉素敏感性转化体，并且用合适的寡核苷酸通过PCR分析验证这两个基因座处抗生素盒的缺乏。保留的菌株命名为菌株4。

为了过表达fldA和fpr，将这些基因与人工启动子及与人工核糖体结合位点可操作连接，并且在ytfA基因座处整合到染色体上(与ybeM和ypjC基因座相同的选择标准，参见上文)。对于fldA用SEDIDN°25以及对于fpr如专利申请WO2009/043803中为了过表达cysPUWAM操纵子描述的构建人工启动子。人工核糖体结合位点与专利申请WO2013/001055中公开的菌株17中为了过表达ptsG基因的描述相同。

为了将fldA和fpr过表达的拷贝添加到染色体上，使用由Datsenko&Wanner,2000(根据方案1)描述的同源重组策略。通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)PCR扩增片段，该片段携带具有其相应启动子的fldA和fpr基因和抗性标志物，两者侧翼为与整合基因座ytfA同源的DNA序列。用于重组入ytfA基因座中的序列称为SEQIDN°26和27(表3中列出)。然后，通过电穿孔将获得的PCR产物“ΔytfA::fldA-fpr::Km”导入MG1655metA*11(pKD46)菌株中。然后，选择抗生素抗性转化体，并且用合适的寡核苷酸通过PCR分析验证在ytfA基因座处具有抗性盒的fldA-fpr基因的插入。保留的菌株命名为MG1655metA*11ΔytfA::fldA-fpr::Km。最终，通过P1噬菌体转导(根据方案2)将ΔytfA::fldA-fpr::Km染色体整合从MG1655metA*11ΔytfA::fldA-fpr::Km转移到菌株4。选择卡那霉素抗性转导体，并且用合适的寡核苷酸通过PCR分析验证ΔytfA::fldA-fpr::Km染色体整合的存在。保留的菌株称作菌株5。

构建菌株6：过度生成L-甲硫氨酸分泌系统，过表达ygaZH

在菌株1中过表达编码甲硫氨酸的输出蛋白的大肠杆菌基因ygaZH。在使用ygaZ的天然启动子的情况下将它们在中等质粒拷贝数pCL1920(Lerner&Inouye,1990)上克隆。此质粒命名为pME1247。最终，将质粒pME1247转化入菌株1中，给出菌株6。

实施例2：在L-甲硫氨酸过度生成者大肠杆菌菌株中过度生成钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶且过度生成L-甲硫氨酸分泌系统：构建菌株7

在菌株5中过表达编码甲硫氨酸的输出蛋白的大肠杆菌基因ygaZH。将质粒pME1247转化到菌株5中，产生菌株7。

实施例3：在L-甲硫氨酸过度生成者谷氨酸棒杆菌重组菌株中过度生成钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶或其再活化系统或过度生成L-甲硫氨酸分泌系统—构建菌株A至F

谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032hom*ask*metH(在下文命名为菌株A)记载于专利WO2007/012078中。

在所述菌株A中，hom*和ask*分别对应于编码蛋白HsdhS393F的高丝氨酸脱氢酶和编码蛋白AskT311I(又称作LysCT311I)的天冬氨酸激酶的反馈抗性等位基因。

随后，用N-甲基-N’-硝基胍诱变此菌株A，如专利WO2007/012078中所述。分离显示甲硫氨酸效价是菌株A中的甲硫氨酸效价的至少两倍的克隆。在进一步实验中使用的一个此类克隆命名为菌株B。此菌株B是谷氨酸棒杆菌L-甲硫氨酸生成者。

然后，如专利WO2007/012078和WO2004/050694中描述的修饰谷氨酸棒杆菌菌株B以获得包含hsk*metYmetAmetFDmcbR的菌株C。

过表达编码高丝氨酸激酶HskT190A的突变等位基因hsk*以及缺失编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的metY、编码高丝氨酸乙酰基转移酶的metA、编码高半胱氨酸甲基化酶的metF和mcbR基因。

为了增加谷氨酸棒杆菌L-甲硫氨酸生成者菌株C中的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性，与编码铁氧还蛋白还原酶的fprA1基因一起过表达metHcg(来自谷氨酸棒杆菌的metH基因)，所述铁氧还蛋白还原酶起MetH再氧化蛋白作用。根据专利WO2009/144270的描述进行这些修饰。所得的菌株称作菌株D。

增加谷氨酸棒杆菌L-甲硫氨酸生成者菌株C中的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性的另一种方式是过表达metHEc(来自大肠杆菌的metH基因)以及来自大肠杆菌的fldA和fpr基因，其编码参与MetH酶的再活化的黄素氧还蛋白。这根据专利WO2009/144270的描述实现。所得的菌株称作菌株E。

为了增加菌株C中谷氨酸棒杆菌特异性的L-甲硫氨酸分泌系统，从大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC-XT99A(EP1085094)过表达brnFE操纵子。通过使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032DNA作为模板从PCR产生的片段在大肠杆菌中构建质粒。在pEC-XT99A中如由等,(2005)描述的构建质粒，并随后将所得的质粒pCB1转化入菌株C中，产生菌株F。

实施例4：谷氨酸棒杆菌L-甲硫氨酸过度生成者菌株中组合的钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶过度生成与L-甲硫氨酸分泌系统的过度生成：构建菌株G和H

为了组合MetH_CG、FprA1或MetH_EC、FldA、Fpr在谷氨酸棒杆菌中的过度生成与特异性的L-甲硫氨酸分泌系统BrnFE的过度生成，通过电穿孔将上文描述的质粒pCB1分别导入菌株D和E中，分别产生菌株G和H.

菌株G仅携带属于谷氨酸棒杆菌的基因，而菌株H携带钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶和其来自大肠杆菌的再活化系统。

输出蛋白在所有情况中是BrnFE。

实施例5：通过用大肠杆菌菌株在生物反应器中发酵生产L-甲硫氨酸

使用补料分批策略，在2.5L反应器(PierreGuerin)中在生产条件下测试先前实施例中描述的菌株。

简言之，使用在10mL具有2.5g.L^-1葡萄糖的LB培养基中培养的24小时培养物来接种基本培养基(B1a)中的24小时预培养物。在旋转摇床(200RPM)中在含有50mL基本培养基(B1a)的500mL带挡板的摇瓶中进行这些温育。第一预培养在30℃的温度实现，第二预培养在34℃的温度实现。

在填充有200mL基本培养基(B1b)且用5mL浓缩预培养物接种到1.2g.L^-1的生物量浓度的生物反应器(Sixfors)中进行第三预培养步骤。将预培养温度恒定维持于34℃，并且使用10％NH₄OH溶液将pH自动调节到6.8的值。通过空气供应和/或搅拌将溶解氧浓度连续调节到30％空气分压饱和度的值。在从分批培养基耗尽葡萄糖后，以初始流速0.7mL.h^-1开始补料分批，之后以0.13h^-1的生长速率按指数增加26小时，以获得约20g.L^-1的最终细胞浓度。

表4：预培养分批无机培养基组成(B1a和B1b)

表5：预培养补料分批无机培养基组成(F1)

化合物浓度(g.L^-1)Zn(CH₃COO)₂.H₂O0.0104CuCl₂.2H₂O0.0012MnCl₂.4H₂O0.0120CoCl₂.6H₂O0.0020H₃BO₃0.0024Na₂MoO₄.2H₂O0.0020柠檬酸Fe(III)H₂O0.0524EDTA0.0067MgSO₄5.00(NH₄)₂SO₄8.32Na₂SO₄8.95(NH₄)₂S₂O₃24.80硫胺素0.01葡萄糖500.00维生素B120.01NH₄OH>调节到pH 6.8

随后，对2.5L发酵罐(PierreGuerin)填充600或620mL基本培养基(B2)，并且用范围为80至100mL的预培养物体积接种到3,2g.L^-1的生物量浓度。

通过磷酸盐控制细胞生长，这就是为什么通过添加不同浓度的KH₂PO₄、K₂HPO₄和(NH₄)₂HPO₄将分批培养基B2中的最终磷酸盐浓度调节到0至20mM之间包含的值。以相同的方式，通过添加不同浓度的KH₂PO₄、K₂HPO₄和(NH₄)₂HPO₄，将F2培养基的最终磷酸盐浓度调节到5至30mM之间包含的值。可调节补料分批培养基中的硫代硫酸盐浓度以防止培养期间此化合物的饥饿。

表6：培养分批基本培养基组成(B2)

化合物浓度(g.L^-1)Zn(CH₃COO)₂.2H₂O0.0130CuCl₂.2H₂O0.0015MnCl₂.4H₂O0.0150CoCl₂.6H₂O0.0025H₃BO₃0.0030Na₂MoO₄.2H₂O0.0025柠檬酸Fe(III)H₂O0.1064EDTA0.0084MgSO₄.7H₂O1.00CaCl₂.2H₂O0.08柠檬酸1.7027 -->(NH₄)₂S₂O₃7.74硫胺素0.01维生素B120.01生物素0.10葡萄糖10NH₄OH>调节到pH 6.8IPTG0,0047

表7：培养补料分批培养基组成(F2)

将培养温度恒定维持于37℃，并且通过自动添加NH₄OH溶液(10％和28％)将pH维持于工作数值(6.8)。在分批阶段期间将初始搅拌速率设置于200RPM，并且在补料分批阶段期间增加到直至1000RPM。在分批阶段期间将初始气流速率设置于40NL.h^-1，并且在补料分批阶段开始时提升到100NL.h^-1。通过提高搅拌将溶解氧浓度维持于20-40％，优选30％饱和度的值。

在必要时以20μM的终浓度在分批和补料分批培养基中添加IPTG。在需要它时，以浓度50mg.L^-1(对于壮观霉素)、30mg.L^-1(对于氯霉素)、50mg.mL^-1(对于卡那霉素)和100mg.L^-1(对于氨苄青霉素)添加抗生素。

在细胞质量达到接近5g.L^-1的浓度时，以5mL.h^-1的初始流速开始补料分批。以增加的流速以S形概貌(sigmoidprofile)注射补料溶液，所述增加的流速在25小时后达到24mL.h^-1。通过下述方程式计算精确的补料条件：

其中Q(t)是以mL.h^-1计的补料流速，其中p1＝1.80，p2＝22.4，p3＝0.27，p4＝6.50。贯穿整个培养，将此流速从10增加到50％，优选20-30％。

在25小时补料分批后，停止补料溶液泵，并且在葡萄糖耗尽后结束培养。

在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC量化胞外氨基酸，并且在硅烷化后使用HPLC及折射测定检测(有机酸和葡萄糖)和GC-MS分析其它相关代谢物。

测试了大肠杆菌中metH、fldA、fpr过表达和ygaZH过表达的组合的影响。结果在表8中呈现。

表8：不同菌株在补料分批培养物中产生的最大和最终甲硫氨酸得率和高羊毛氨酸浓度。将感兴趣的菌株，即菌株5、6和7的性能与参照菌株1比较，并且在相同条件中培养。符号～指示菌株间没有差异，符号+指示1-5％的增加，符号++指示5-10％的增加，并且符号+++指示大于10％的增加。对于甲硫氨酸/葡萄糖得率的定义，参见下文。

菌株菌株1菌株6菌株5菌株7重复数目n＝4n＝1n＝1n＝2最大甲硫氨酸得率参照～+++++最终甲硫氨酸得率参照～～++最终点时的高羊毛氨酸(mM)浓度14.8ND3.62.5MetH比活(mUI/mg蛋白质)2302301500ND

这些结果显示了在大肠杆菌中，仅ygaZH基因的过表达对甲硫氨酸的生成没有益处(菌株6)。大肠杆菌(菌株5)中钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶系统的过表达导致改善的甲硫氨酸生产。令人惊讶地，我们观察到过表达基因ygaZH和钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶系统的组合对甲硫氨酸生成具有协同影响，导致预料不到的增加的甲硫氨酸产生。此外，此组合还对高羊毛氨酸生成具有有利的影响，导致具有更好纯度的甲硫氨酸。

测定甲硫氨酸/葡萄糖得率(Y_met)

通过对初始体积加上为了调节pH以及为了补料培养物添加的溶液量并且通过扣除用于取样和蒸发损失的体积计算反应器体积。

通过称重补料储液连续追踪补料分批体积。然后，基于注射重量、溶液密度和通过Brix([葡萄糖])方法测定的葡萄糖浓度计算注射葡萄糖的量。甲硫氨酸得率如下表示：

其中甲硫氨酸₀和甲硫氨酸_t分别是初始和最终甲硫氨酸浓度，并且V₀和V_t是初始和即时t体积。

消耗的葡萄糖如下计算：

注射葡萄糖_t＝补料体积_t*[葡萄糖]

消耗的葡萄糖_t＝[葡萄糖]₀*V₀+注射葡萄糖–[葡萄糖]_残留*V_t，其中[葡萄糖]₀、[葡萄糖]、[葡萄糖]_残留分别是初始、补料和残留的葡萄糖浓度。

钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性测定法

钴胺素依赖性甲硫氨酸活性测定法是在1995年由Drummond等描述的测定法的改编。

通过以350nm波长和于37℃的恒定温度用分光光度计测量产物四氢叶酸盐(H4folate)浓度而测定钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶活性。

在800μl的终体积中在80mM磷酸钾pH7.2、20mMDTT、15μMS-腺苷甲硫氨酸(SAM)、0.6mM(6R,S)-5-甲基-5,6,7,8-四氢叶酸、40μM羟钴胺素、0.1mM氯化锌和8μg粗提取物中进行反应混合物。于37℃将反应混合物温育10分钟，之后通过以0.8mM的终浓度添加底物高半胱氨酸开始反应。于37℃5分钟后，添加200μl酸性衍生化溶液(60％甲酸中的4MHCl)以淬灭回转(turnover)，使体积达到1ml，并且于80℃将管加热10分钟。此步骤对于稳定反应的酶促产物(即在酸中不稳定的四氢叶酸)是必需的。加热导致形成次甲基四氢叶酸，其吸收350nm的光，而残留的底物5-甲基四氢叶酸无助于350nm的吸光度。除了底物高半胱氨酸外，反应空白含有反应混合物的所有组分。

定量FldA和Fpr蛋白水平

为了定量两种蛋白质，生成了针对黄素氧还蛋白-1(fldA)和黄素氧还蛋白还原酶(fpr)的抗体(来自兔的抗体，Eurogentec)，并且用于Western印迹实验。使用山羊抗兔AP进行Western印迹检测。用商品化的成像系统(EpsonExpression1680专业)定量染色印迹上的FldA和Fpr的蛋白质水平，并在本专利中描述的不同染料中比较。

实施例6：用谷氨酸棒杆菌菌株通过发酵生产L-甲硫氨酸

在与专利申请WO2009/144270中描述的相同条件中在烧瓶中培养菌株。

表9：与参照菌株C相比由谷氨酸棒杆菌菌株D、E、F、G和H生成的甲硫氨酸效价。符号～指示菌株间没有差异，符号+指示1-3％的增加，符号++指示大于3％的增加。

与大肠杆菌类似，在谷氨酸棒杆菌中，基因brnFE和钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶系统(来自大肠杆菌-菌株H和来自谷氨酸棒杆菌-菌株G)的过表达的组合对甲硫氨酸生成具有协同影响，导致预料不到的增加的甲硫氨酸产生。

实施例7：在L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株过度生成者中过度生成钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶且过度生成同源L-甲硫氨酸分泌系统：构建菌株8至17

在菌株5的遗传背景中过表达来自柠檬酸杆菌属菌种、志贺氏菌属菌种、拉乌尔菌属菌种、肠杆菌属菌种、耶尔森氏菌属菌种和光杆状菌属菌种的ygaZH同源基因。

在使用菌株5前，使用Flp重组酶除去ytfA基因座处进行的染色体整合的抗生素盒，如由Datsenko&Wanner,2000所述(根据方案1)。选择卡那霉素敏感性转化体，并用合适的寡核苷酸通过PCR分析验证ytfA基因座处抗生素盒的缺乏。所得的菌株命名为菌株8。

构建菌株9：过度生成内源L-甲硫氨酸分泌系统，过表达来自大肠杆菌的ygaZH

为了在相同遗传背景中比较来自大肠杆菌的ygaZH的过表达和ygaZH同源物的过表达的影响，将携带来自大肠杆菌的ygaZH的质粒pME1247转化到菌株8中，产生菌株9。

构建菌株10至17：过度生成同源L-甲硫氨酸分泌系统，过表达来自表10中列出的属和种的ygaZH

为了过表达表10中列出的ygaZH同源基因，在使用大肠杆菌ygaZ基因的天然启动子和天然核糖体结合位点的情况中在中等拷贝数质粒pCL1920(Lerner&Inouye,1990)上克隆每对基因，如先前对大肠杆菌ygaZH基因描述的。如表11中详明的，在针对大肠杆菌优化或不优化密码子选择的情况下从相应菌株的基因组DNA扩增或者化学合成ygaZH同源基因(如由GeneSynthesis服务以软件-Lifetechnologies提出)。表11中指示的SEQID中公开了包含ygaZH同源基因的扩增DNA片段。如表11中提及的命名所得的质粒。最后，将每种质粒转化到菌株8中，产生菌株10至17，如表11中提及的。

表10：YgaZH同源蛋白

表11：携带ygaZH同源基因的质粒和菌株

实施例8：在烧瓶实验中通过发酵生产L-甲硫氨酸

在小锥形瓶中评估过度生成钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶MetH及来自各种微生物的不同L-甲硫氨酸分泌系统(与来自大肠杆菌的YgaZH同源)的重组L-甲硫氨酸生成者。

在小锥形瓶中评估生产菌株。在混合培养基(具有2.5g.L^-1葡萄糖的10％LB培养基(Sigma25％)和90％基本培养基PC1)中于30℃将5.5mL预培养物培养21小时。使用它接种培养基PC1中的50mL培养物至0.2的OD₆₀₀。在必要时，添加50mg.L^-1浓度的壮观霉素和10mg.L^-1的庆大霉素。培养物的温度是37℃。当培养物达到了5至7的OD₆₀₀时，在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC量化胞外氨基酸，并且在硅烷化后使用HPLC及折射测定检测(有机酸和葡萄糖)和GC-MS分析其它相关代谢物。

表12：基本培养基组成(PC1)

表13：携带ygaZH同源基因以及metH、fldA和fpr基因的过表达的感兴趣菌株在烧瓶培养中生成的以g甲硫氨酸/％g葡萄糖计的甲硫氨酸得率(Ymet)。关于甲硫氨酸/葡萄糖得率的精确定义，参见下文。“n”指示重复的数目。

如表13中可见，在过表达metH、fldA、fpr基因的L-甲硫氨酸生成者中来自多种微生物的ygaZH同源基因的过表达导致与用过表达来自大肠杆菌的ygaZH的菌株9获得的那些性能等同或更好的性能。来自与大肠杆菌不同的微生物的同源L-甲硫氨酸分泌系统可以替换细菌的内源蛋白。

与菌株9(Ymet＝18.7g/g)相比，来自克氏柠檬酸杆菌(菌株10，Ymet＝19,6g/g)、杨氏柠檬酸杆菌(菌株16,Ymet＝19,6g/g)、弗氏柠檬酸杆菌(菌株17,Ymet＝19,6g/g)和肠杆菌属菌种(菌株13，Ymet＝19,4g/g)的同源蛋白YgaZH显示最佳的L-甲硫氨酸产生得率。

甲硫氨酸得率如下表示：

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