多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法和应用

摘要

本发明公开了属于食品配料和食品加工技术领域的一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法和应用。所述方法为：以多酚、蛋白质/多肽为原料，利用碱法诱导反应，制备多酚-蛋白质/多肽共价复合物；然后再以碳水化合物和制备的多酚-蛋白质/多肽共价复合物为原料，利用美拉德反应，制备多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物。所述制备方法使用天然来源的原料，不使用任何有机试剂，通过两个步骤即可获得性能良好的多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物，制备方法简单、高效、安全，易于生产。所得产品具有较高的抗氧化性和乳化性，利用该产品稳定的β-胡萝卜素乳状液具有良好的理化稳定性。

说明书

技术领域

本发明属于食品配料和食品加工技术领域，特别涉及一种多酚-蛋白质/多肽 -碳水化合物共价复合物的制备方法和应用。

背景技术

多酚化合物是植物体内一类最重要的次生代谢产物，具有较强的抗氧化作 用，以及明显的抑菌、抗癌、抗衰老和抑制胆固醇升高等功效。在食品加工及 人体消化过程中，多酚能与多种化合物发生相互作用，其中蛋白质/多肽是最主 要的有机化合物。

蛋白质/多肽与多酚相互作用会引起蛋白质/多肽结构的改变，进而导致其功 能性质如溶解性、持水能力、黏度、凝胶作用、弹性、塑性和乳化性等的相应 变化。多酚与蛋白质/多肽共价反应后，反应产物在很大程度上保持了多酚的化 学性质，同时赋予蛋白质/多肽分子许多新的性能，明显拓宽了植物多酚和蛋白 质/多肽的应用领域。

碳水化合物具有良好的增稠性和持水性，可通过美拉德反应引入蛋白质/多 肽从而改善蛋白质/多肽的功能特性。一般来说，蛋白质/多肽因能在油水或气液 界面上形成吸附层降低界面张力而多在胶体体系中作为乳化剂使用，碳水化合 物则由于其良好的增稠性和持水性而常用做稳定剂。在食品体系中两种生物大 分子共存时，显示出比各自单独使用时更好的性能。

美拉德反应可以使碳水化合物分子以共价键连接到蛋白质/多肽分子上，主 要是将蛋白质/多肽分子的ε-氨基连接到碳水化合物分子的还原端。这种生物大 分子复合物对于环境条件具有较高的适应性，而且蛋白质/多肽-碳水化合物共价 复合物在胶体体系中具有乳化和稳定的双重作用。另外，生物大分子在共价结 合条件下蛋白质/多肽分子构型趋于稳定，蛋白质/多肽变性程度以及聚集程度将 会减轻。

在蛋白质/多肽和碳水化合物的美拉德反应过程中，将蛋白质/多肽-碳水化合 物溶液混合后进行冷冻干燥，既保证了反应底物混合的均匀性，又增大了接触 面积；温和的反应条件能保证美拉德反应进行到适当程度，从而确保蛋白质/多 肽-碳水化合物共价复合物具有优越的乳化及热稳定等功能特性。

目前尚未见将多酚、蛋白质/多肽、碳水化合物制备三者共价复合物的报道。 因此，发明一种既具有良好的抗氧化性和生物活性，又具有较高热稳定性和乳 化性的多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物类生物大分子尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的 制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法，所述方法为： 以多酚、蛋白质/多肽为原料，利用碱法诱导反应，制备多酚-蛋白质/多肽共价复 合物；然后再以碳水化合物和制备的多酚-蛋白质/多肽共价复合物为原料，利用 美拉德反应，制备多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物。

所述的一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法的具体步 骤为：

(1)将多酚化合物与蛋白质/多肽分别溶解于磷酸盐缓冲液中，形成多酚溶 液与蛋白质/多肽溶液；在室温或50-60℃的水浴加热条件下，将多酚溶液与蛋白 质/多肽溶液等体积混合，形成混合溶液，并调节混合溶液的pH值为8.0-10.0； 然后向反应容器中缓慢通入氧气，反应24-48h，反应过程不断搅拌；采用超声 透析法，除去未反应的游离多酚，最后将透析袋中剩余的混合溶液冷冻干燥， 得到多酚-蛋白质/多肽共价复合物固体样品；

(2)将碳水化合物和制备的多酚-蛋白质/多肽共价复合物溶于磷酸盐缓冲 液中，形成混合溶液，冷冻干燥；将干燥后的样品磨细，过筛后，进行美拉德 反应，反应结束后采用超声透析法除去未反应的碳水化合物，得到多酚-蛋白质/ 多肽-碳水化合物共价复合物。

所述的多酚为：茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、没食子酸、 单宁、槲皮素、阿魏酸或姜黄素。

所述的蛋白质/多肽为：乳蛋白、血清蛋白、卵蛋白、鱼糜蛋白、明胶、胶 原蛋白、大豆蛋白、花生蛋白、乳清蛋白肽、大豆肽、玉米肽、小麦肽、胶原 肽或谷胱甘肽；所述的乳蛋白为α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白或酪蛋白。

所述的碳水化合物为葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、聚葡萄糖、 燕麦β-葡聚糖、菊粉或麦芽糊精。

所述多酚化合物的用量为0.5g/L-50g/L，蛋白质/多肽的用量为 10g/L-200g/L，碳水化合物的用量为10g/L-200g/L。

所述美拉德反应的条件为：反应在固相中进行，反应的相对湿度为79％， 温度为50-100℃，pH值为4-11，反应时间为18h-24h。

所述超声透析法的方式为：将透析袋固定于装有去离子水的透析容器内， 在20-106KHz的超声频率下，透析24-72h，每隔3-6h换一次去离子水。

所述的一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法制备的多 酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物。

所述的多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物在制备β-胡萝卜素乳状液 中的应用。

所述应用采取的方式为：将多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物溶解 于水中，形成浓度为5g/L-50g/L的水相；将β-胡萝卜素溶解于植物油中，形成 浓度为0.5g/L-10g/L的油相；然后将水相与油相按(20:1)-(10:1)的体积比 混合后，在8000-12000r/min的条件下剪切乳化6-10min，再进行高压均质，得 到β-胡萝卜素乳状液。

所述的高压均质方式为：在温度为45-75℃的条件下，采用二级加压，均质 1-5次；其中，一级均质压力为30-60Mpa，二级均质压力为3-6Mpa。

本发明的有益效果为：所述制备方法使用天然来源的多酚化合物、蛋白质/ 多肽和碳水化合物，不使用任何有机试剂，通过两个步骤即可获得性能良好的 多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物，制备方法简单、高效、安全，易于 生产。所得产品具有较高的抗氧化性和乳化性，利用多酚-蛋白质/多肽-碳水化 合物共价复合物稳定的β-胡萝卜素乳状液具有良好的理化稳定性。

附图说明

图1为制备多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的流程示意图。

图2为乳铁蛋白、绿原酸-乳铁蛋白共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖 共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物累积分子量分布图。

图3为乳铁蛋白、绿原酸、绿原酸-乳铁蛋白共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白 -葡萄糖共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白- 葡萄糖非共价复合物和绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖非共价复合物的铁还原力图； 其中CA：绿原酸；LF：乳铁蛋白；CA-LFcon：绿原酸-乳铁蛋白共价复合物； CA-LF-Glucon：绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物；CA-LF-Glumix：绿原酸 -乳铁蛋白-葡萄糖非共价复合物；CA-LF-PDcon：绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共 价复合物；CA-LF-PDmix：绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖非共价复合物。

图4为分别采用乳铁蛋白、绿原酸、绿原酸-乳铁蛋白共价复合物、绿原酸- 乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物、绿原酸- 乳铁蛋白-葡萄糖非共价复合物和绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖非共价复合物制备 的β-胡萝卜素乳状液的粒径分布图；其中CA：绿原酸；LF：乳铁蛋白；CA-LF con：绿原酸-乳铁蛋白共价复合物；CA-LF-Glucon：绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共 价复合物；CA-LF-Glumix：绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖非共价复合物；CA-LF-PD con：绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物；CA-LF-PDmix：绿原酸-乳铁蛋白 -聚葡萄糖非共价复合物。

具体实施方式

本发明公开了一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法及 其应用，所述制备方法的流程图如图1所示。下面结合具体实施例对本发明做 进一步阐述，但不应理解为对本发明的限制。所述原料如无特殊说明，均为能 从商业途径获得的产品。所述测试方法均为常规方法。

实施例1：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)-α-乳白蛋白-葡萄糖共价 复合物的制备

将EGCG(4g/L)与α-乳白蛋白(16g/L)溶解于pH8.0的磷酸盐缓冲液中， 形成EGCG溶液与α-乳白蛋白溶液；在50℃的水浴条件下，将EGCG溶液与α- 乳白蛋白溶液等体积混合，形成混合溶液，并调节混合溶液的pH值为8.0；然 后向反应容器中缓慢通入氧气(1毫升/分钟)，反应24-48h，反应过程不断搅拌， 使EGCG氧化成醌类化合物并与α-乳白蛋白的侧链氨基酸基团反应生成 EGCG-α-乳白蛋白共价复合物；将反应后的混合溶液置于透析袋(截留分子量 3500kDa)中，然后将透析袋固定于装有去离子水的透析容器内，在50KHz的 超声频率下，透析24h，每隔3h换一次去离子水，以确保未反应的游离EGCG 完全透析出去，最后将透析袋中的剩余的混合物冷冻干燥，得到EGCG-α-乳白 蛋白共价复合物固体样品；

将葡萄糖和制备的EGCG-α-乳白蛋白共价复合物按1:2的质量比溶于pH7.0 磷酸盐缓冲液中，形成混合溶液，冷冻干燥；将干燥后的样品磨细，过200目 筛，在相对湿度为79％，温度为60℃，pH值为7的条件下，固相反应24h； 反应结束后将共价复合物置于透析袋(截留分子量3500kDa)中，然后将透析袋 固定于装有去离子水的透析容器内，在50KHz的超声频率下，透析24h，每隔3 h换一次去离子水，以确保未反应的游离的葡萄糖完全透析出去；最后将透析袋 中的剩余的共价复合物冷冻干燥，得到EGCG-α-乳白蛋白-葡萄糖共价复合物固 体样品。

实施例2：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)-乳清蛋白肽-葡萄糖共价 复合物的制备

将EGCG(4g/L)与乳清蛋白肽(16g/L)溶解于pH8.0的磷酸盐缓冲液中， 形成EGCG溶液与乳清蛋白肽溶液；在60℃的水浴条件下，将EGCG溶液与乳 清蛋白肽溶液等体积混合，形成混合溶液，并调节混合溶液的pH值为8.0；然 后向反应容器中缓慢通入氧气(1毫升/分钟)，反应48h，反应过程不断搅拌，使 EGCG氧化成醌类化合物并与乳清蛋白肽的侧链氨基酸基团反应生成EGCG-乳 清蛋白肽共价复合物；将反应后的混合溶液置于透析袋(截留分子量3500kDa) 中，然后将透析袋固定于装有去离子水的透析容器内，在50KHz的超声频率下， 透析24h，每隔3h换一次去离子水，以确保未反应的游离EGCG完全透析出去， 最后将透析袋中的剩余的混合物冷冻干燥，得到EGCG-乳清蛋白肽共价复合物 固体样品；

将葡萄糖和制备的EGCG-乳清蛋白肽共价复合物按1:2的质量比溶于pH 7.0磷酸盐缓冲液中，形成混合溶液，冷冻干燥；将干燥后的样品磨细，过200 目筛，在相对湿度为79％，温度为60℃，pH值为7的条件下，固相反应24h； 反应结束后将共价复合物置于透析袋(截留分子量3500kDa)中，然后将透析袋 固定于装有去离子水的透析容器内，在50KHz的超声频率下，透析24h，每隔3 h换一次去离子水，以确保未反应的游离的葡萄糖完全透析出去；最后将透析袋 中的剩余的共价复合物冷冻干燥，得到EGCG-乳清蛋白肽-葡萄糖共价复合物固 体样品。

实施例3：绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物和绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄 糖共价复合物的制备

将绿原酸(2g/L)与乳铁蛋白(10g/L)溶解于pH9.0的磷酸盐缓冲液中， 形成绿原酸溶液与乳铁蛋白溶液；在室温条件下，将绿原酸溶液与乳铁蛋白溶 液等体积混合，形成混合溶液，并调节混合溶液pH值为9.0；然后向反应容器 中缓慢通入氧气(1毫升/分钟)，反应36h，反应过程不断搅拌，使得绿原酸氧 化成醌类化合物并与蛋白质的侧链氨基酸基团反应生成绿原酸-乳铁蛋白共价复 合物；将反应后的混合溶液置于透析袋(截留分子量3500kDa)中，然后将透析 袋固定于装有去离子水的透析容器内，在106KHz的超声频率下，透析36h，每 隔6h换一次去离子水，以确保未反应的游离绿原酸完全透析出去，最后将透析 袋中剩余的混合物冷冻干燥，得到绿原酸-乳铁蛋白共价复合物固体样品；

将上述样品与葡萄糖或聚葡聚糖(10g/L)按1:1质量比，分别溶于pH7.0 的磷酸盐缓冲液中，形成混合溶液，冷冻干燥；将干燥后的样品磨细，过200 目筛，在相对湿度为79％，温度为70℃、pH值为7的条件下，固相反应18h； 反应结束后将共价复合物置于透析袋(截留分子量3500kDa)中，然后将透析袋 固定于装有去离子水的透析容器内，在106KHz的超声频率下，透析36h，每隔 6h换一次去离子水，以确保未反应的游离的葡萄糖或聚葡聚糖完全透析出去； 最后将透析袋中剩余的混合物冷冻干燥，得绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物 或绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物。

与乳铁蛋白、绿原酸-乳铁蛋白共价复合物相比，该实施例制备的绿原酸- 乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物和绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物具有更高 的平均分子量，如图2所示。通过铁还原力分析，与乳铁蛋白、绿原酸、绿原 酸-乳铁蛋白共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖非共价复合物和绿原酸-乳铁 蛋白-聚葡萄糖非共价复合物相比，该实施例制备的绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共 价复合物和绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物具有更强的体外抗氧化活性。 如图3所示。

将实施例制备的0.7g绿原酸-乳铁蛋白-葡聚糖共价复合物和绿原酸-乳铁蛋 白-葡萄糖共价复合物，分别溶解于100mL去离子水中，溶胀过夜，得到水相； 将0.015gβ-胡萝卜素油悬浮液溶解于5mL的中链甘油三酸酯中，得到油相；在 高速乳化均质机的搅拌下缓慢将油相添加到水相中，10000rpm剪切10min，形 成粗乳状液；粗乳液通过高压(阀)均质机采用二级加压进一步均质；其中一 级均质压力为60Mpa，二级均质压力为6MPa，均质3次，得到β-胡萝卜素乳 状液。

该实施例制备的β-胡萝卜素乳状液的粒径分布如图4所示。从图4可知，与乳 铁蛋白、绿原酸、绿原酸-乳铁蛋白共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖非共 价复合物和绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖非共价复合物相比，采用绿原酸-乳铁蛋 白-葡萄糖共价复合物或绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物制备的乳液粒径 分布较窄，平均粒径较小，且呈单峰分布，表明其具有较高的稳定性。