一种利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方法

摘要

本发明公开了一种利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方法，首先制备雨生红球藻藻液，雨生红球藻到对数生长期后期，此时细胞浓度达到106cells？mL-1，用缺氮的BBM培养基稀释藻液使其浓度达到2×105cells？mL-1，获得诱导用的藻液；然后用DMSO配成128g？L-1的丁基羟基茴香醚母液，将丁基羟基茴香醚母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使丁基羟基茴香醚浓度达到4.95-5.05mgL-1；然后将上述藻液进行培养，待藻体细胞完全变红后，收集藻细胞此时其虾青素的积累量已达到最高。本发明方法简单可行，成本低廉，并大幅缩短雨生红球藻变红的时间且虾青素的量有较显著地提高，从而很大的提高了虾青素的产率。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产 虾青素的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

天然虾青素(3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜 素)是类胡萝卜素的最高级衍生物，结构的特殊性决定了其抗氧化活 性明显高于其他类胡萝卜素。虾青素作为强抗氧化剂在医药、化妆品 和保健品等领域有很大的应用，也作为添加剂广泛用于食品、水产等 行业。

天然虾青素主要来源于发夫酵母、鲑鱼、虾壳及雨生红球藻，其 中雨生红球藻在胁迫条件下，比如高温、强光照、氮饥饿等，能大量 的积累虾青素，其含量可达到藻细胞干重的5-6％，被称为天然虾青 素的浓缩品。外源诱导子促进雨生红球藻积累虾青素是提高虾青素产 量的有效手段。丁基羟基茴香醚是一种常见脂溶性抗氧化剂，可作为 一种外源诱导子对雨生红球藻进行胁迫培养，激发植物防御基因的表 达，诱导植物的化学防御，与机械损伤和昆虫取食有相似的效果。因 此丁基羟基茴香醚对雨生红球藻积累虾青素会有一定的促进作用。

目前国内已有多家公司可以大规模化生产虾青素，也已有了一些 相关的技术和专利，比如“一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法” (CN104529852A)公开了一种高效提取虾青素的方法，主要利用冰醋 酸冰浴、匀浆机匀浆和液氮低温处理相结合的方法，大大提高了细胞 破壁率及虾青素提取率。宁波大学的“大规模培养雨生红球藻和转化 虾青素的装置及其方法”(CN1966660)，公开了一种雨生红球藻大规 模培养及虾青素转化的装置，包括光生物反应器、充气装置、培养液 灌输装置和静细胞收集装置,通过浮沉控制装置实现全天候高密度养 殖，并将藻的养殖和虾青素积累结合在同一反应器中完成。天津大学 的“用酵母发酵残液培养藻类生产虾青素的方法”(CN1480524A)，公 开了一种利用酵母发酵残液生产虾青素的方法，是向酵母发酵残液中 加入无机盐配成培养基，在特定的容器内培养雨生红球藻或绿球藻， 经过分离提取虾青素。上述相关专利技术虽然先进，但是工艺较为复 杂，设备要求高，操作较为繁琐，这就增加了生产的成本和技术推广 的难度。

发明内容

本发明要解决的技术问题克服现有的缺陷，提供一种利用丁基羟 基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方法，可以有效解决背景技术 中的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供一种利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青 素的方法，包括以下步骤：

步骤1、藻液的制备：培养雨生红球藻到对数生长期后期，用缺 氮的BBM培养基稀释藻液并获得诱导的藻液；

步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：用DMSO配成128gL^-1的 丁基羟基茴香醚母液，将丁基羟基茴香醚母液添加到已经稀释好的诱 导的藻液中使丁基羟基茴香醚浓度达到2-8mgL^-1；然后将上述藻液 进行培养，待藻体细胞完全变红后，收集藻细胞；

步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素。

2、根据权利要求1所述的利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻 生产虾青素的方法，其特征在于，所述雨生红球藻为雨生红球藻菌株。

3、根据权利要求1所述的利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻 生产虾青素的方法，其特征在于，所述步骤1中藻液的制备具体为： 在25℃、光强3000lx，持续光照条件下培养，培养雨生红球藻到达 对数生长期后期，此时细胞浓度达到10⁶cellsmL^-1，利用缺氮的BBM 培养基稀释到2×10⁵cellsmL^-1作为诱导藻液。

4、根据权利要求1所述的利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻 生产虾青素的方法，其特征在于，所述步骤2中诱导雨生红球藻积累 虾青素中的培养条件为：28℃、光强10000lx、冷光灯连续光照及 氮饥饿的复合胁迫。

5、根据权利要求1所述的利用丁基羟基茴香醚促进雨生红 球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述步骤3中利用有机溶剂提 取藻细胞的虾青素具体为：取5ml上述藻液，4000r/min离心5min， 弃上清得藻细胞沉淀；分别向藻细胞沉淀中加入2mL30％甲醇和5％ KOH混合液，60℃水浴15min，4000r/min离心10min，除上清， 沉淀加入纯水洗涤2次，除碱液残留；然后加入5mLDMSO，200w 超声破壁15min，其中，超声1min，10s间歇，于45℃水浴20min， 抽提至藻体发白，离心收集上清测OD490；并按照公式 计算得出虾青素的含量，其中C为虾青素含 量，A为490nm下OD值，Va为DMSO体积，Vb为藻液体积。

本发明所达到的有益效果是：一方面本发明操作简单易行、成本 低，原材料为自己筛选的雨生红球藻菌株可按常规方法培养，另一方 面本发明大幅提高了虾青素的产率，实验证明，添加2-8mgL^-1的丁 基羟基茴香醚的诱导组比对照组积累虾青素的周期缩短了6-13％，虾 青素的产量比对照组提高了56.14-71.72％，达到19.99-21.654mg L^-1。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供一种利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青 素的方法，包括以下步骤：

步骤1、藻液的制备：雨生红球藻采用雨生红球藻菌株，利用BBM 培养基，在25℃、光强3000lx，持续光照条件下培养，培养雨生红 球藻到达对数生长期后期，此时藻细胞浓度达到10⁶cellsmL^-1，无 菌条件下离心，利用缺氮的BBM培养基稀释到2×10⁵cellsmL^-1作为 诱导藻液；

步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：用DMSO配成128gL^-1的 丁基羟基茴香醚母液，将丁基羟基茴香醚母液添加到已经稀释好的诱 导藻液中使丁基羟基茴香醚浓度达到2-8mgL^-1；然后将上述藻液在 28℃、光强10000lx、冷光灯连续光照及氮饥饿的复合胁迫下进行 培养，待藻体细胞完全变红后，收集藻细胞；

步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素，虾青素的提取方法：

每隔一天取5ml上述藻液，4000r/min离心5min，弃上清得 藻细胞沉淀；分别向藻细胞沉淀中加入2mL30％甲醇和5％KOH混合 液，60℃水浴15min，4000r/min离心10min，除上清，沉淀加入 纯水洗涤2次，除碱液残留；然后加入5mLDMSO，200w超声破壁 15min(超声1min，10s间歇)，于45℃水浴20min，抽提至藻体 发白，离心收集上清测OD490；并按照公式计 算得出虾青素的含量，其中C为虾青素含量，A为490nm下OD值， Va为DMSO体积，Vb为藻液体积。

实施例1

(1)雨生红球藻采用雨生红球藻菌株，利用BBM培养基，在25℃、 光强3000lx，持续光照条件下培养，培养雨生红球藻到达对数生长 期，此时藻细胞浓度达到10⁶cellsmL^-1，无菌条件下离心，利用缺 氮的BBM培养基稀释到2×10⁵cellsmL^-1作为诱导藻液。

(2)用DMSO配成128gL^-1的丁基羟基茴香醚母液，将丁基羟基茴 香醚母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使丁基羟基茴香醚浓度达 到2mgL^-1；然后将上述藻液在28℃、光强10000lx、冷光灯连续 光照及饥饿营养盐的复合胁迫下进行培养，每天定期取样观察藻细胞 颜色变化，发现13天后藻体细胞完全变红后，收集藻细胞利用有机 溶剂提取藻细胞的虾青素，此时其虾青素的积累量已达到最高。

实施例2

(1)雨生红球藻采用雨生红球藻菌株，利用BBM培养基，在25℃、 光强3000lx，持续光照条件下培养，培养至雨生红球藻到达对数生 长期，此时藻细胞浓度达到10⁶cellsmL^-1，利用缺氮的BBM培养基 稀释到2×10⁵cellsmL^-1作为诱导藻液。

(2)用DMSO配成128gL^-1的丁基羟基茴香醚母液，将丁基羟基 茴香醚母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使丁基羟基茴香醚浓度 达到4mgL^-1；然后将上述藻液在28℃、光强10000lx、冷光灯连 续光照及饥饿营养盐的复合胁迫下进行培养，每天定期取样观察藻细 胞颜色变化，13天后藻体细胞完全变红后，收集藻细胞利用有机溶 剂提取藻细胞的虾青素，此时其虾青素的积累量已达到最高。

实施例3

(1)雨生红球藻采用雨生红球藻菌株，利用BBM培养基，在25℃、 光强3000lx，持续光照条件下培养，培养至雨生红球藻到达对数生 长期，此时藻细胞浓度达到10⁶cellsmL^-1，利用缺氮的BBM培养基 稀释到2×10⁵cellsmL^-1作为诱导藻液。

(2)用DMSO配成128gL^-1的丁基羟基茴香醚母液，将丁基羟 基茴香醚母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使丁基羟基茴香醚浓 度达到8mgL^-1；然后将上述藻液在28℃、光强10000lx、冷光灯 连续光照及饥饿营养盐的复合胁迫下进行培养，每天定期取样观察藻 细胞颜色变化，14天后藻体细胞完全变红后，收集藻细胞利用有机 溶剂提取藻细胞的虾青素，此时其虾青素的积累量已达到最高。

丁基羟基茴香醚可以作为一种植物生长调节剂有效地促进植物 的生长和发育，利用一定适当浓度的丁基羟基茴香醚作为诱导剂，诱 导雨生红球藻积累虾青素，通过采用上述虾青素的提取方法对各组进 行提取虾青素，结果显示：空白对照组(不添加丁基羟基茴香醚)积 累虾青素完成的时间为15天，第10天时虾青素的含量为12.4725mg L^-1，丁基羟基茴香醚处理后的比对照组积累虾青素的周期缩短了 6-13％，且虾青素的产量比对照组提高了56.14-71.72％，达到 19.99-21.654mgL^-1。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不 用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技 术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包 含在本发明的保护范围之内。