一种利用表面微结构激活星形神经胶质细胞的方法

摘要

本发明提供一种利用表面微结构激活星形神经胶质细胞的方法，属细胞培养技术领域，具体步骤为：(1)获得带有凸凹不平微结构的PDMS细胞培养表面；(2)采用原代培养的神经胶质细胞为激活对象，待细胞生长至细胞融合，将细胞用0.25％胰酶消化后制成细胞悬液，(3)将细胞悬液添加至微结构表面，细胞贴壁后培养1-14天；(4)从上述方法获得的星形神经胶质细胞经鉴定表现为细胞发生EMT转化、细胞干性增强、葡萄糖转运增强等一系列激活表现。本发明的优点是可以利用培养物表面物理微结构激活神经胶质细胞，且可以避免形成胶质细胞反应性增生导致的胶质瘢痕。本发明在神经系统损伤性及退行性疾病的治疗中具有广阔应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术，特别提供了一种利用表面微结构激活星形神经胶质细胞的方法。

背景技术

星形胶质细胞是中枢神经系统中体积最大、数量最多、分布最广的一种胶质细胞，具有大量的放射状突起。星形胶质细胞在神经发育、突触形成、血脑屏障构建、能量代谢等多个方面发挥决定性作用，对维持脑内稳态与神经元的正常功能至关重要。

星形胶质细胞存在静息态和激活态两种状态。当神经系统受到各种有害因素，如低氧、外伤、炎症等损伤刺激后，星形胶质细胞从静息态转化为激活态，成为活化星形胶质细胞。活化胶质细胞的作用为“双刃剑”。一方面，活化的胶质细胞迅速迁移并包围损伤区域，避免损伤范围的进一步扩大；此外，还可分泌多种营养因子保护多巴胺能神经元，例如，NGF、BDNF、GDNF、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)等。另一方面，活化胶质细胞的反应性增生形成的胶质瘢痕对于神经系统损伤后轴突再生起严重阻碍作用。当再生的神经轴突遇到胶质瘢痕时，会形成一种萎缩的末端小球状结构，后者不能再伸展形成生长锥，从而使再生的神经轴突停滞在胶质瘢痕处，影响神经轴突的生长。

目前既有的激活神经胶质细胞的方法如机械损伤、低氧、炎症因子刺激等，均无法避免激活带来的反应性胶质瘢痕的形成。因此，开发一种激活神经胶质细胞后即可发挥其促神经再生的作用又限制其反应性增生的新技术，具有重大的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便的通过凸凹不平的表面微结构激活神经胶质细胞的方法，该方法获得的神经胶质细胞既可发挥其促神经再生的作用又能限制胶质瘢痕的形成。

本发明是通过下述技术方案得以实现的：

一种利用培养物表面微结构激活星形神经胶质细胞的方法，具体步骤如下

(1)采用湿法刻蚀等微加工方法，获得带有凸凹不平的微米级表面微结构的模板，用PDMS浇筑后固化，将其揭下后获得带有凸凹不平微结构的PDMS细胞培养表面；

(2)采用原代培养的神经胶质细胞为激活对象，待细胞生长至细胞融合，将细胞用0.25％胰酶消化后制成细胞悬液，

(3)将细胞悬液添加至微结构表面，细胞贴壁后培养1-14天；

(4)从上述方法获得的星形神经胶质细胞经鉴定表现为细胞发生EMT转化、细胞干性增强、葡萄糖转运增强等一系列激活表现。

所获得的凸凹不平微结构PDMS表面特征如下：表面带有阵列式形状规则的微凹陷或微凸起，其形状可为圆形、方形、五边形、六边形、椭圆、三角形、直线、曲线或这些形状的组合体。

所述微凹陷与其周边隆起之间的高度差为5～100μm，边缘隆起的宽度为0～50μm。

所述所述的阵列式形状规则的微凹陷，其形状的边长为5～100μm。

所述带有表面微结构的模板材质为硅板、玻璃或SU-8；

所述带有微结构的细胞培养表面，其材质可以为PDMS、PMMA、聚苯乙烯、PLGA、壳聚糖或其他多种高分子材料。

所述获得的星形神经胶质细胞在14天内具有EMT转化、细胞干性增强、葡萄糖转运增强等一系列激活表现。

所产生的活化星形神经胶质细胞用于神经系统外伤及缺血缺氧性脑病的治疗。

所产生的活化星形神经胶质细胞用于帕金森及阿尔茨海默病的治疗。

采用湿法刻蚀等微加工方法，获得带有凸凹不平的微米级表面微结构的模板，将Sylgard184单体和引发剂SiliconeElaStomer按体积比10：1混合均匀，浇筑于模板上，80℃30分钟后PDMS固化。用镊子将PDMS揭下，将带有微结构的一面朝上放入培养皿中，利用PDMS本身的黏性将其固定于培养皿底部。紫外照射过夜灭菌。

从上述方法获得的星形神经胶质细胞经鉴定表现为细胞发生EMT转化、细胞干性增强、葡萄糖转运增强等一系列激活表现。EMT转化具体表现为细胞内波形蛋白表达增加，b-连环蛋白向细胞核内发生转位。细胞干性增强表现为SOX-2及OCT-4表达增加。葡萄糖转运增强表现为葡糖糖转移酶GLUT-1表达增加。

本发明提供的利用表面微结构激活神经胶质细胞的方法，所述细胞包括原代提取的哺乳类神经胶质细胞，也包括永生化的神经胶质细胞系。

本发明的优点是可以利用培养物表面物理微结构激活神经胶质细胞，且可以避免形成胶质细胞反应性增生导致的胶质瘢痕。本发明在神经系统损伤性及退行性疾病的治疗中具有广阔应用前景。

附图说明

图1带有正六边形凹陷阵列微结构的PDMS芯片电镜图

图2边长30μm正六边形凹表面微结构促进神经胶质细胞波形蛋白表达以及b-连环蛋白核转位；其中1PDMS平表面培养的神经胶质细胞表达的b-连环蛋白主要位于细胞膜上，在细胞周边呈连续性表达；2边长30μm正六边形凹表面培养的神经胶质细胞表达的b-连环蛋白主要位于细胞质及细胞核中。

图3与PDMS平表面相比，边长30μm正六边形凹表面微结构可促进神经胶质细胞SOX-2及OCT-4表达；

图4与PDMS平表面相比，边长30μm正六边形凹表面微结构可促进神经胶质细胞GLUT-1表达；

图5与PDMS平表面相比，边长30μm正六边形凸表面微结构可促进神经胶质细胞波形蛋白及SOX-2表达；

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

利用计算机辅助设计和湿法刻蚀方法，制作边长为30μm的正六边形凸表面膜板，正六边形之间距离为5μm，凸表面与凹槽之间的高度差为60μm。将PDMS单体和引发剂按10:1的比例混合均匀，浇筑于模板上进行反膜，80℃30分钟后PDMS固化。用镊子将PDMS揭下，获得带有凹表面正六边形微结构的PDMS芯片(见图1)。将带有微结构的一面朝上放入培养皿中，利用PDMS本身的黏性将其固定于培养皿底部。紫外照射过夜灭菌。

原代提取新生24h乳鼠大脑皮层星形神经胶质细胞，去除杂细胞后待细胞生长至融合，将细胞用0.25％胰酶消化后制成细胞悬液，将细胞悬液添加至PDMS微结构表面，置入培养箱中贴壁培养1-14天。对凹表面上生长的神经胶质细胞进行鉴定，结果显示细胞发生EMT转化、细胞干性增强、葡萄糖转运增强等一系列激活表现。细胞内波形蛋白表达增加，b-连环蛋白向细胞核内发生转位(见图2)，干性相关蛋白SOX-2及OCT-4表达增加(见图3)，葡糖糖转移酶GLUT-1表达增加(见图4)。

实施例2

制作边长为30μm的正六边形凹表面膜板，正六边形之间距离为5μm，凹表面与周围凸起的边框之间的高度差为60μm。用PDMS反膜后获得带有凸表面正六边形微结构的PDMS芯片。将带有微结构的一面朝上放入培养皿中，利用PDMS本身的黏性将其固定于培养皿底部。紫外照射过夜灭菌。

将原代提取的乳鼠星形神经胶质细胞悬液添加至PDMS微结构表面，置入培养箱中贴壁培养1-14天。对凸表面上生长的神经胶质细胞进行鉴定，结果显示细胞发生了与凹表面相似的变化，细胞内波形蛋白及干性相关蛋白SOX-2表达均增加(图5)。