雨生红球藻游动细胞的培养方法及原生质体的制备方法

摘要

本发明提供了一种雨生红球藻游动细胞的培养方法，包括将雨生红球藻在含有乙酸钠、酵母提取物和其他无机营养的培养基中进行培养的步骤。通过具有特定成分的培养基培养可获得高达85％以上的游动细胞，细胞密度可达10

说明书

技术领域

本发明涉及一种雨生红球藻游动细胞的培养方法及原生质体的制备方法。

背景技术

雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)被公认为自然界中生产天然虾青素(3，3’-二羟 基-β，β’-类胡萝卜素-4，4’-二酮)的最好生物。虾青素是一种生物活性物质，具有抗氧化、 消除自由基、增强动物免疫、促进繁殖、生长、成熟等作用，被应用于医药、水产养殖等各 个领域。近年来，雨生红球藻已应用于大规模的自养培养中，但由于雨生红球藻为自养型生 物，导致其在培养过程中存在生长缓慢、生物量低、培养条件要求高等问题，严重制约了雨 生红球藻大规模商业化高密度培养。利用现代微生物育种技术选育性状优良的藻株已日益受 到关注。原生质体融合、基因工程等育种技术已成为选育优良藻株的有效手段。因此，建立 高效的雨生红球藻原生质体的制备技术及其重要。

雨生红球藻的生活周期主要分为进行营养生长的绿色游动细胞时期和积累红色虾青素的 不动细胞时期。当环境适宜(如低光照、营养盐充足等)时，细胞为绿色细胞并且大量繁殖。 当细胞处于胁迫条件(如高光照、营养盐缺乏、高C/N等)时，细胞壁增厚、体积增大、细 胞增殖减慢，且因积累大量虾青素而呈红色。雨生红球藻生长十分缓慢，Harker等曾在30L 的气升式(air-lift)光反应器中用光和自养方法(不添加有机碳源)培养雨生红球藻，三周的 时间内，生物量仅达到10⁵个/ml。

藻类的细胞操作可以追溯到50年代末期，Fushs(1958)利用丝状蓝藻——颤藻 (Oscillatoriaamoena)制备得到原生质体。到70年代中后期，其他种类藻原生质体的制备 也相继获得成功：Kobayashi用机械法挤压出羽藻(Bryopsishypnoides)的原生质体；1986 年，Cheney分离得到江篱(Gracilariaverrucosa)的原生质体，并培养成株；1989年，周一 红和王素娟用生物技术手段分离获得鹧鸪菜(Caloglossaleprieurii)原生质体并培养成株。1990 年，Saga和Sakai分离到海带(LaminariaJaponica)、巨藻(Macrocystis)和马尾藻(Sargassum horueri)的原生质体，并把巨藻和马尾藻的原生质体培养成株。1993年，Gall等分离到了长 紫菜(porphyracrispata)的原生质体，并观察了其中间及最终再生形态。1996年，查向东 等利用褐藻胶酶和纤维素酶获得裙带菜配子体原生质体，并经4-5周再生成为同普通配子体 大小和形状相同的新的配子体。

早期酶法制备原生质体过程中的酶主要来源于生物体内，如微生物来源的海藻解壁酶、 动物来源的海藻解壁酶。目前，广泛用于原生质体制备的酶主要有纤维素酶、半纤维素酶、 果胶酶、几丁质酶、蛋白酶、崩溃酶、离析酶等。范寰等(一种白腐真菌的原生质体制备方 法，中国专利200910228483X)采用蜗牛酶酶解分离一种酵母菌的原生质体，β-巯基乙醇预 处理条件下，原生质体形成率可达90％-96％。

根据不同藻类细胞壁成分的不同，各种多糖水解酶如纤维素酶、蜗牛酶、果胶酶、离析 酶等被广泛应用于微藻原生质体的制备中。魏东等(葡萄藻原生质体的制备及葡萄藻原生质 体制备率检测方法，中国专利201410312883X)提出采用纤维素酶、果胶酶及离析酶的复合 酶溶液来制备葡萄藻原生质体的方法，但并未提及制备效率。

对于雨生红球藻而言，其细胞壁是由糖蛋白分子以及少量的纤维素和几丁质组成，所以 Tjahjono于1993年提出以蛋白酶K来制备原生质体。随后在2004年王明兹等(雨生红球藻原生 质体制备与再生技术，中国专利2004100075358)用酸性缓冲液、EDTA和二硫苏糖醇配制而 成的预处理剂处理雨生红球藻细胞，然后以纤维素酶、蜗牛酶、果胶酶和酸性缓冲液组成的 复合高渗酶溶液来分离得到原生质体，制备率可达80％。但是，在雨生红球藻生活史中存在 多种细胞类型，其细胞壁结构及组成均存在较大差异。上述专利中原生质体制备方法并未针 对雨生红球藻生活史中特定细胞，且需要进行破壁预处理，方法繁琐，耗时较长，所需酶种 类较多。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种雨生红球藻游动细胞的培养方法，以快速 获得富集化的雨生红球藻游动细胞。

本发明的另一目的是提供一种利用雨生红球藻游动细胞制备原生质体的方法，用以制备 雨生红球藻原生质体。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明技术方案的提出，是基于发明人认为在雨生红球藻的生活史中存在游动细胞和不 动细胞两种细胞，这两种细胞细胞壁结构上存在很大差异，游动细胞的原生质不含有纤维素 层，仅被一层透明的凝胶状细胞层所包被，而不动细胞则存在厚而致密的纤维素化细胞壁层， 因而通过游动细胞制备原生质体应要明显优于不动细胞。

本发明的第一方面，提供一种雨生红球藻游动细胞的培养方法，包括将雨生红球藻在含 有乙酸钠、酵母提取物和其他无机营养的培养基中进行培养的步骤。

上述培养基中，乙酸钠浓度为0.5-3g/L，酵母提取物浓度为0.5-3g/L；其中，乙酸钠不 仅为红球藻提供异养的有机碳源，而且还明显导致藻细胞光自养的光合综合性能指数发生改 变；酵母提取物为普通市售酵母提取物，含有氨基酸、核苷酸、肽、B族维生素、微量元素、 各种形式的氮和磷等营养物质，可明显促进雨生红球藻游动细胞的快速增殖。

上述培养基中，所述其他无机营养包含：硝酸钠1000mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水 氯化钙36mg/L，磷酸二氢钾40mg/L，碳酸钠20mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵3mg/L， 乙二胺四乙酸钠1mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，四水氯化锰1.81mg/L， 二水钼酸钠0.39mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L，硼酸2.86mg/L。

上述培养方法中，培养的条件为：培养温度为20-25℃、光照强度为30-60μmolm^-2s^-1， 培养时间为3-6天。

采用上述的培养方法，获得的雨生红球藻的游动细胞占总细胞数的85％以上，细胞密度 可达10⁵个/ml以上。

本发明的第二方面，提供一种利用游动细胞制备原生质体的方法，包括：将雨生红球藻 的游动细胞以一定初始密度重悬于含有胶原蛋白酶的缓冲液中进行酶解的步骤和制备雨生红 球藻原生质体悬液的步骤。

上述方法中，所述胶原蛋白酶选自胶原蛋白酶I，II，III或IV类型。

上述方法中，所述胶原蛋白酶的浓度为0.2-0.6％(m/v)。

上述方法中，所述酶解的条件为：在35±1℃和100rpm转速下酶解15-60分钟。

上述方法中，制备雨生红球藻原生质体悬液的步骤具体为：离心收集酶解后的细胞，利 用缓冲液进行洗涤，然后重悬在缓冲液中，获得雨生红球藻原生质体悬液。

上述方法中，缓冲液中主要成分为：0.5mMCaCl₂，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCl (pH7.8)。

上述方法中，游动细胞的初始密度为0.5-3×10⁵个/ml。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一种培养基成分及其培养条件，可用于快速富集培养获得雨生红球藻 游动细胞，采用本发明的培养基和培养条件进行培养，获得的雨生红球藻的游动细胞占总细 胞数的85％以上，细胞密度可达10⁵个/ml以上，在短时间内实现了雨生红球藻的大量繁殖。

(2)本发明还提供了一种利用雨生红球藻游动细胞制备原生质体的方法，通过含有胶原 蛋白酶成分的酶解液，可以高效处理获得雨生红球藻原生质体，原生质体的得率最高可达88％ 以上。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释 本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

将雨生红球藻(SCCAPK-0084)不动细胞接种于含0.5g/L乙酸钠和3g/L酵母提取物的 BG11培养基中(BG11培养基中含有硝酸钠1000mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36 mg/L，磷酸二氢钾40mg/L，碳酸钠20mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵3mg/L，乙二胺 四乙酸钠1mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，四水氯化锰1.81mg/L，二 水钼酸钠0.39mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L，硼酸2.86mg/L)，于25℃、持续光强为60μmol m^-2s^-1条件下培养3天可获得游动细胞占细胞总数85％的培养物。

配制含0.5mMCaCl₂，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCl(pH7.8)的缓冲液，加入 胶原蛋白酶(CollagenaseIV)至终浓度为0.2％(m/v)，将上述制备的游动细胞以3×10⁵个/ml 的密度重悬于酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解45min，原生质体 得率可达84％。

实施例2

雨生红球藻(NIES-144)不动细胞接种于与实施例1中无机营养相同的培养基中，乙酸 钠和酵母提取物的浓度分别为3g/L和0.5g/L，于25℃、持续光强为30μmolm^-2s^-1条件下 培养3天可获得游动细胞占细胞总数90％的培养物。

将细胞以1×10⁵个/ml的细胞密度，重悬在含有0.4％胶原蛋白酶(CollagenaseⅢ)、0.5mM CaCl₂，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCl(pH7.8)的酶解缓冲液中，控制温度在35℃、 摇动速度100rpm下酶解30min，原生质体得率可达85％。

实施例3

雨生红球藻(SAG34-1b)不动细胞接种于与实施例1中无机营养相同的培养基中，乙 酸钠和酵母提取物的浓度分别为2g/L和2g/L，于25℃、持续光强为30μmolm^-2s^-1条件下 培养3天可获得约90％的游动细胞。

将细胞以2×10⁵个/ml的细胞密度，重悬在含有0.6％胶原蛋白酶(CollagenaseI)、0.5mM CaCl₂，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCl(pH7.8)的酶解缓冲液中，控制温度在35℃、 摇动速度100rpm下酶解50min，原生质体得率可达88％。

以上实施例中，将所用的藻种替换为NIES-144或SAG34-1b等其他株系的雨生红球藻， 或将所用的胶原蛋白酶更换为其他CollagenaseI或Ⅲ等胶原蛋白酶所得结果相似。

对比例1

将雨生红球藻(SCCAPK-0084)不动细胞接种于含4g/L乙酸钠的BG11培养基中，于 25℃、持续光强为60μmolm^-2s^-1条件下培养3天，可获得游动细胞占细胞总数74％的培养 物。

配制含0.5mMCaCl₂，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCl(pH7.8)的缓冲液，加入 胶原蛋白酶(CollagenaseIV)至终浓度为0.2％(m/v)，将上述制备的游动细胞以3×10⁵个/ml 的密度重悬于酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解45min，原生质体得 率为72％。

对比例2

将雨生红球藻(SCCAPK-0084)不动细胞接种于含0.5g/L乙酸钠和0.3g/L酵母提取物 的BG11培养基中，于25℃、持续光强为60μmolm^-2s^-1条件下培养3天可获得游动细胞占 细胞总数78％的培养物。

配制含0.5mMCaCl₂，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCl(pH7.8)的缓冲液，加入胶 原蛋白酶(CollagenaseIV)至终浓度为0.2％(m/v)，将上述制备的游动细胞以3×10⁵个/ml的密 度重悬于酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解45min，原生质体得率可 达75％。

对比例3

将雨生红球藻(SCCAPK-0084)不动细胞接种于含0.5g/L乙酸钠和0.5g/L酵母提取物 的BG11培养基中，于25℃、持续光强为60μmolm^-2s^-1条件下培养3天可获得游动细胞占 细胞总数76％的培养物。

配制含0.5mMCaCl₂，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCl(pH7.8)的缓冲液，加入胶 原蛋白酶(CollagenaseIV)至终浓度为0.2％(m/v)，将上述制备的游动细胞以3×10⁵个/ml的密 度重悬于酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解45min，原生质体得率可 达73％。

由上述实施例和对比例可以看出，在BG11培养基中添加乙酸钠和酵母提取物，可以用于 雨生红球藻生活史中特定的细胞(游动细胞)快速培养富集，并以此为对象进行原生质体的 制备。培养基中酵母提取物的加入量是经过多次试验优化得到的，酵母提取物加入的过多或 过少都会影响游动细胞的数量和原生质体的得率，经试验验证，在BG11培养基中添加浓度为 0.5-3g/L的乙酸钠和浓度为0.5-3g/L的酵母提取物，其最有利于雨生红球藻游动细胞的培养和 原生质体的制备。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加 以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。