公开/公告号CN105628773A
专利类型发明专利
公开/公告日2016-06-01
原文格式PDF
申请/专利权人 中国食品药品检定研究院;
申请/专利号CN201410617618.2
申请日2014-11-05
分类号G01N27/447;
代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司;
代理人苏蕾
地址 100050 北京市东城区天坛西里2号
入库时间 2023-12-18 15:42:25
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-07-16
授权
授权
2016-06-29
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N27/447 申请日:20141105
实质审查的生效
2016-06-01
公开
公开
技术领域
本申请涉及生物制品领域,具体地,涉及一种用于细菌性疫苗菌种的质量控制的方法。
背景技术
疫苗生产用菌种是指从自然界或临床上分离、筛选出的用于疫苗生产和质量控制用的细菌、病毒、螺旋体以及立克次氏体等微生物,经过鉴定、分类并给以固定编号进行微生物纯培养物。菌种是疫苗研究、生产和检定的物质基础,各种细菌性疫苗,例如灭活疫苗、活疫苗或组分纯化疫苗,均是通过菌种扩大培养等工艺所制备而来的。生产菌种的质量直接或间接影响到疫苗的质量、安全和效力,因此菌种必须经过严格筛选才能作为疫苗生产菌种,同时,对生产菌种也必须进行严格的管理和质量控制。钩端螺旋体(简称钩体)疫苗是为钩体病流行地区的易感人群和兽类提供特异性预防的一种生物制品。当前我国使用钩体疫苗是由各地区主要的钩体流行菌型组成的灭活菌体疫苗。在钩体疫苗生产过程中,菌种的毒力是影响疫苗有效性主要因素。因此为了保持钩体菌种的毒力,疫苗菌种每传3-6代,应该将钩体疫苗菌种接种动物(例如豚鼠),通过采取动物心脏血液,培养钩体,用于钩体菌种传代,保持钩体的致病力,从而达到钩体菌种增毒的目的,从而保持钩体的毒力,并同时做血清学和生物学特性检查,才能用于菌种保存或疫苗生产。
现阶段我国对钩体疫苗生产用菌毒种的质量控制主要还局限于形态观察、培养特性、生化反应和功能检测(如产毒试验等)等方面,缺乏从基因层面的控制,尤其是菌种在动物传代后,存在混入杂菌或菌种本身遗传性状改变的可能。近些年,随着生物技术的发展,多种分子遗传分析方法相继问世,例如针对细菌全基因组水平分析脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术,但这种方法尚未见用于细菌性疫苗菌种的质量控制,因此,为了从疫苗源头保证产品的安全性,迫切需要建立一种钩体疫苗菌种的分子遗传质量控制的方法,加强疫苗菌种的质量控制。
发明内容
本申请一方面提供了一种用于钩端螺旋体疫苗菌种的质量控制的方法,所述方法包括:
a.对所述钩端螺旋体疫苗菌种进行动物传代,所述动物传代是将所述钩端螺旋体疫苗菌种接种动物,然后通过采取动物心脏血液,培养钩端螺旋体,用于钩端螺旋体菌种传代;
b.对进行所述动物传代前和进行所述动物传代后不同代次的钩端螺旋体疫苗菌种进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析;
c.比较所得到的DNA图谱;
其中,如果所得到的DNA图谱一致,则说明进行所述动物传代前和进行所述动物传代后不同代次的钩端螺旋体疫苗菌种是稳定的。
在所述方法的优选实施方案中,其中步骤b的PFGE分析可如下进行:
(1)取钩端螺旋体疫苗菌种的菌液制备悬浮液,加琼脂糖溶液,混匀后加入模具中,在室温凝固,获得细菌胶块;
(2)用酶处理所述细菌胶块;
(3)对所述细菌胶块进行脉冲场电泳和染色。
在所述方法的进一步优选实施方案中,其中步骤(2)中所述的酶可为蛋白酶K和NotI。
在所述方法的优选实施方案中,其中所述动物可以是豚鼠。
脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析是对细菌菌株进行的分子指纹图谱分型方法,不同菌株之间的染色体DNA序列不同,通过适当的核酸内切酶切割细菌染色体DNA以及特定的脉冲场电泳,从而可在基因组水平上对细菌的变异特征进行分析。
本发明的目的在于建立一种基于PFGE分子分型技术的钩体疫苗菌种的指纹图谱,用于钩体疫苗菌种的分子遗传质量控制。将动物传代前以及经动物传代后不同代次(20次)的钩体疫苗菌种进行PFGE分析,得到高低不同的大量DNA条带,发现钩体疫苗菌种在动物传代前以及经动物传代后20代次内菌种DNA条带完全一致,具有相同PFGE图谱,而不同钩体疫苗菌种之间PFGE图谱不同。这种方法是通过对钩体菌种整个染色体进行分析,具有重复性好、区分能力强、结果稳定且对结果的解释更清楚的优点。据此建立不同钩体疫苗菌种的指纹图谱,用于钩体疫苗菌种的分子遗传质量控制。在全基因组水平,加强了疫苗菌种的质量控制,从而更加有效保证了疫苗的有效性和安全性,在有效维护广大人民群众生命安全和身体健康方面具有重要意义。
附图说明
图1显示了不同钩端螺旋体疫苗菌种的PFGE图谱;其中各泳道如下:1.MarkerH9812;2.黄疸出血群(赖株);3.秋季群(临4株);4.流感伤寒群(临6株);5.MarkerH9812。
图2显示了一种钩端螺旋体疫苗菌种流感伤寒群(临6株)不同代次(包括钩体在动物传代前及经动物传代后不同代次)的PFGE图谱;其中各泳道如下:1.MarkerH9812;2.第一代;3.第二代;4.第三代;5.第五代;6.MarkerH9812;7.第八代;8.第十代;9.第十五代;10.第二十代;11.MarkerH9812。
具体实施方式
下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述,以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解,可以采用其他实施方式,并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节,说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此,以下详细描述不应以限制性的意义来理解,且本发明的范围仅由所附权利要求界定。
以下的实施例便于更好地理解本申请,但并不用来限制本申请的范围。
下述实施例中所使用的各原料,除特别指出的以外,均可由市售获得。
实施例1一般方法
1.细菌PFGE胶块的制备
取兔血清磷酸盐培养基中28℃生长7-10天的钩体疫苗菌种菌液10ml于离心管中,配平,10000rpm4℃离心20min,弃去上清,沉淀加1ml缓冲液(含1MTris、0.5MEDTA和5MNaCl溶液)溶解,转移到1.5mleppendorf管中,6000rpm离心5分钟。倾去上清。根据钩体菌的浓度加400μl缓冲液将沉淀溶解混匀取200μl细菌悬浮液置于1.5mleppendorf管中,37℃孵育5分钟。加等量1%金牌琼脂糖溶液(购自美国Lonza公司),混匀后加入模具中,室温凝固15分钟左右得到细菌PFGE胶块。
2.细菌PFGE胶块的处理
取1中制备得到的细菌PFGE胶块放入3ml0.5mg/ml蛋白酶K(购自德国Merck公司)溶液中,用于去除胶块中残留的细菌蛋白;50℃水浴以100转/分钟轻摇,孵育3h。胶块分别用蒸馏水洗2次、TE(含1MTris和0.5MEDTA溶液)洗3次,每次洗涤是在50℃水浴中进行15分钟。取出胶块,切下2mm宽胶块放入含150μl酶切缓冲液(含0.01%TritonX-100、0.01%BSA缓冲液)的1.5mleppendorf管中,37℃水浴15分钟,吸出酶切缓冲液,加入200μlNotI酶切液(购自大连宝生物),用于酶切细菌DNA,37℃水浴孵育至少2h。
3.脉冲场电泳和染色
将小胶块放在梳子齿上,待干后从胶槽下部中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃-60℃平衡的1%琼脂糖液,在室温下凝固20min左右。取出凝固好的胶块放入装有0.5×Tris-硼酸(TBE)溶液的电泳槽中电泳,电压6v/cm,电场夹角120°,初始脉冲5s,终脉冲65s,电泳液恒温系统温度14℃,电泳时间20h。电泳结束应用溴化乙锭(EB)溶液中染色在凝胶成像仪上拍摄并保存备用,并将图像转换成*.GIFF格式,用于后续处理分析。
实施例2
对以下的钩端螺旋体疫苗菌种(均来自武汉生物制品研究所有限责任公司)进行如实施例1所述的PFGE分析方法:MarkerH9812;黄疸出血群(赖株);秋季群(临4株);流感伤寒群(临6株);MarkerH9812,获得图1所示的结果。
这一结果说明,不同血清群钩体疫苗菌种DNA酶切片段的数量、大小和分布特征不同,呈现不同的PFGE图谱。
实施例3
对一种钩端螺旋体疫苗菌种流感伤寒群(临6株)的不同代次(钩体临6株在动物传代前及经动物传代第一代菌株来自武汉生物制品研究所有限责任公司;而后的钩体菌株在体外人工培养基-兔血清磷酸培养基上每隔7天左右进行传一代,共计20代)进行如实施例1所述的PFGE分析方法,获得图2所示的结果。
这一结果说明,流感伤寒群(临6株)在动物传代前以及经动物传代后20代次内菌种DNA条带完全一致,具有相同PFGE图谱。这些不同代次菌株在兔血清磷酸培养基上的培养特性、生长形态相同,不同代次的菌株血清型分析结果也相一致,进一步支持PFGE分析结果。
综上所述,以上仅为本申请的较佳实施例而已,并非用于限定本申请的保护范围,因此,凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
机译: 至少向婴儿家庭提供相同量的烟碱核糖化合物或盐的方法,将一种有益细菌的菌种繁殖为饮料型啤酒的方法,一种减少细菌性胃肠道感染的方法
机译: 疫苗,吸入器,细胞的组成,用于抵抗动物感染的动物疫苗接种,制备血纤维细胞系以及制备细菌性肺炎疫苗的方法,包括化合物,马匹,人的细胞,纤维素活性结合片段,血清,生产疫苗的程序以及细菌细胞培养
机译: 疫苗诱导的乙型肝炎病毒株,核酸编码的分子编码丙型肝炎病毒的突变株主要表面抗原,用于制备多肽的矢量和矢量系统,一种用于制备多肽(多肽)(多变体)的方法寡核苷酸,一种抗体(变体)的制备方法,抗体(多种),一种测定治疗乙型肝炎病毒感染的化学成分的方法,一种成分,一种制备方法,一种方法乙型肝炎病毒的有机液体筛查,一种抗体使用方法,疫苗接种疫苗