一种中国被毛孢发酵滤液的回收利用方法

摘要

本发明提供了一种中国被毛孢发酵滤液的回收利用方法，所述方法为：以中国被毛孢经发酵培养获得的发酵液过滤后的滤液为进水，采用均相离子交换膜，在进水流量为200-400L/h、运行电压为20-30V的条件下进行电渗析处理，收集电渗析流出液，即为中国被毛孢发酵滤液回收水，回收利用；所述回收利用是将中国被毛孢发酵滤液回收水用于配制微生物培养基；本发明所选择的电渗析设备及参数不仅较进口的便宜，而且在相应的参数设置下脱盐率可达95％以上。经过电渗析后，水的收率约为90％。1000L发酵滤液，用电渗析法处理能耗成本大约是1.88元每吨，设备成本约0.5元每吨。因此，采用电渗析法处理发酵滤液并回收利用于培养基用水可以明显降低企业的生产成本。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及冬虫夏草生产菌中国被毛孢的发酵滤液的回收利用方法以及电渗析后滤液的 循环应用。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera) 蝙蝠蛾科昆虫(HepialusarmoricanusOberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括 子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍贵的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特 点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。

上世纪八十年代，本发明人之一的杭州中美华东制药有限公司完成人工生产冬虫夏草的 研究，即将冬虫夏草的产生菌中国被毛孢进行微生物液体发酵培养，并且利用菌丝体经干燥 制成药品——“百令”胶囊(批准文号：国药准字Z10910036)，能够部分地替代野生冬虫夏 草的功能，已经在临床上使用广泛并取得肯定的疗效。

在业内，考虑到生产成本，没有对中国被毛孢的发酵滤液和其中有效成分进行研究，发 酵滤液一般被当成废水处理。由于发酵滤液中含有少量的重金属离子等容易造成环境污染的 物质，若直接当废水排放会对环境造成一定的危害，因此必须经过废水处理达到行业废水排 放标准后直接排放。废水处理将产生不菲的费用，目前处理一吨中国被毛孢的发酵滤液，仅 能耗成本就超过5元，而1吨自来水的工业成本也高于6元；同时浪费了发酵滤液中含有的 大量的有用资源，如微量元素等。

发酵滤液的处理方法一般有物理处理法、化学处理法和生物处理法。物理处理法采用沉 淀、过滤、离心分离、气浮、蒸发结晶、反渗透等方法，化学处理法有中和、混凝、氧化还 原、萃取、汽提、吹脱、吸附、离子交换以及电渗透等，而生物处理法有活性污泥法、生物 滤池和氧化塘等，物理和化学处理法具有步骤繁琐和成本高的缺点，利用生物处理法不仅成 本低而且环保。

电渗析属于物理方法，一般用于海水的淡化、物料浓缩等。工业上利用电渗析脱盐原理， 对生产废水进行处理并回用。Yu-MeiChao等对电渗析技术用于工业废水回用处理进行了技 术和经济上的可行性研究(ChaoYM,LiangTM.Afeasibilitystudyofindustrialwastewater recoveryusingelectrodialysisreversal[J].Desalination.2008,221(1):433–439.)(ref)。T.Sirivedhin 等利用电渗析脱除生产废水中的盐分，力图达到饮用水、灌溉用水及牲畜饮水标准(Sirivedhin T,MccueJ,DallbaumanL.Reclaimingproducedwaterforbeneficialuse:saltremovalby electrodialysis[J].J.Membrane.Sci.2004,243(s1–2):335-343.)。但一直没有文献报导采用电渗 析技术进行发酵滤液的回收利用(ref)。

众所周知，有的发酵产品包含在发酵滤液中，而有的发酵产品则包含在菌体中，而且经 过滤去除菌丝体后的发酵滤液并不一定含有一定量的活性成分，更多的是含有危害的次级代 谢产物，不一定具有循环利用的价值。因此目前制药企业都将发酵滤液直接将其当成废水进 行处理。另外，电渗析前的发酵滤液预处理(过滤等)需要花费一定的费用，而浓度差的缘 故容易使电渗析设备结垢并发生反渗透，导致除盐效率不理想，因此，电渗析很少被制药企 业所利用。

(三)发明内容

本发明目的在于针对以上存在的不足，提供一种“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢深 层发酵滤液的再循环利用方法。

本发明提供了一种中国被毛孢发酵滤液的回收利用方法，所述方法为：以中国被毛孢经 发酵培养获得的发酵液过滤后的滤液为进水，采用均相离子交换膜，在进水流量为200-400 L/h、运行电压为20-30V的条件下进行电渗析处理，收集电渗析流出液，即为中国被毛孢发 酵滤液回收水，回收利用。

其中所述的电渗析处理，具体的说，电渗析中所用膜为离子交换膜，优选均相离子交换 膜，更优选聚乙烯均相离子交换膜，可以采用国产膜。若选用其他膜，如异相离子交换膜， 脱盐率较低。比如选用浙江赛特膜技术有限公司提供的Ⅰ型异相离子交换膜，料液流量为300 L/h、运行电压为30V时，处理时间约为30分钟，其脱盐率为85％。选用浙江赛特膜技术有 限公司提供的Ⅱ型异相离子交换膜，料液流量400L/h、运行电压为30V时，处理时间约为 20分钟，其脱盐率为70％。

其中所述的电渗析条件为：进水流量为200-400L/h、运行电压为20-30V、处理时间为18-35 分钟。优选进水流量300L/h、运行电压为30V时，处理时间约为20分钟。

进一步，所述回收利用是将中国被毛孢发酵滤液回收水用于配制微生物培养基，替代蒸 馏水、自来水；所述微生物为真菌、细菌或放线菌，优选所述微生物为中国被毛孢L0106、 大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、毕赤酵母X-33、毕赤酵母GS115或犹他游动放线菌中的 一种。

本发明所述的中国被毛孢发酵滤液，可以现有技术制备得到。比如说：采用中国被毛孢 (Hirsutellasinensis)L0106，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大 学，430072，保藏编号CCTCCNo：M2011278，保藏日期2011年8月12日。将中国被毛孢 L0106在液体培养基上发酵，获得菌丝体，以及含有发酵上清液和其中的各种代谢产物的发 酵产物；将发酵产物经过固液分离，如采用板框过滤等方法，分离出菌丝体后得到发酵滤液。 这一滤液可后续利用电渗析装置进行脱盐处理。所述中国被毛孢经发酵培养方法为：将中国 被毛孢L0106接种于斜面培养基，于12～16℃条件下进行斜面培养，再取斜面菌接种于种子 培养基中，在15-18℃条件下进行种子培养，而后取种子液按体积浓度10％的接种量接入发 酵培养基，在15-18℃条件下进行发酵培养获得发酵液；所述的斜面培养基质量组成为：葡萄 糖1.8-2.2％、玉米粉0.8-1.2％、土豆汁0.4-0.6％(所述土豆汁是指以200g/L土豆跟水熬制成 糊浆液，八层纱布过滤后的滤液)、糊精0.4-0.6％、酵母粉0.4-0.6％、麸皮0.8-1.2％、蚕蛹粉 1.8-2.2％、蛋白胨0.8-1.2％、硫酸镁0.04-0.06％、磷酸二氢钾0.04-0.06％、琼脂粉0.8-1.2％， 溶剂为水，pH值自然，优选斜面培养基质量组成为：葡萄糖2.0％、玉米粉1.0％、土豆汁0.5％、 糊精0.5％、酵母粉0.5％、麸皮1.0％、蚕蛹粉2.0％、蛋白胨1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢 钾0.05％、琼脂粉1.0％，溶剂为水，pH值自然；所述的种子培养基和发酵培养基均为液体培 养基，所述的液体培养基质量组成为：葡萄糖0.8-1.2％、糖蜜0.8-1.2％、蚕蛹粉0.4-0.6％、 黄豆饼粉0.8-1.2％、酵母膏0.4-0.6％、硫酸镁0.01-0.015％、磷酸二氢钾0.015-0.025％，溶剂 为水，pH值自然；优选所述的液体培养基质量组成为：葡萄糖1.0％、糖蜜1.0％、蚕蛹粉0.5％、 黄豆饼粉1.0％、酵母膏0.5％、硫酸镁0.01％、磷酸二氢钾0.02％，溶剂为水，pH值自然。

具体所述中国被毛孢经发酵培养方法为：将中国被毛孢L0106接种于斜面培养基，在 12～16℃培养25天，获得斜面菌体；斜面培养基质量组成为：葡萄糖1.8-2.2％、玉米粉0.8-1.2％、 土豆汁0.4-0.6％、糊精0.4-0.6％、酵母粉0.4-0.6％、麸皮0.8-1.2％、蚕蛹粉1.8-2.2％、蛋白胨 0.8-1.2％、硫酸镁0.04-0.06％、磷酸二氢钾0.04-0.06％、琼脂粉0.8-1.2％，溶剂为水，pH值 自然，优选斜面培养液质量组成为：葡萄糖2.0％、玉米粉1.0％、土豆汁0.5％、糊精0.5％、 酵母粉0.5％、麸皮1.0％、蚕蛹粉2.0％、蛋白胨1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、 琼脂粉1.0％，溶剂为水，pH值自然；然后将斜面菌体接种至液体培养基，在100rmp、15-18℃ 条件下，振荡培养30天，获得种子液；将种子液振荡破碎菌丝体制成种子悬浮液，然后按体 积浓度10％的接种量接入一级种子发酵罐内，15-18℃条件下培养5-15天，再由一级种子罐 按体积浓度10％的接种量压入二级发酵罐，15-18℃条件下培养5-15天后再按体积浓度10％ 的接种量压入三级发酵罐培养40天后放罐，获得发酵产物，将发酵产物分离，获得滤液；所 述的一级种子发酵罐、二级发酵罐、三级发酵罐内均为液体培养基，液体培养基质量组成为： 葡萄糖0.8-1.2％、糖蜜0.8-1.2％、蚕蛹粉0.4-0.6％、黄豆饼粉0.8-1.2％、酵母膏0.4-0.6％、硫 酸镁0.01-0.015％、磷酸二氢钾0.015-0.025％，溶剂为水，pH值自然，优选液体培养基质量 组成为：葡萄糖1.0％、糖蜜1.0％、蚕蛹粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母膏0.5％、硫酸镁0.01％、 磷酸二氢钾0.02％，溶剂为水，pH值自然；所述发酵液分离方法为采用板框压滤机过滤或利 用位差压力过滤，收集滤液。所述利用位差压力过滤是将发酵液打入高位储罐中，利用位差 的压力并通过控制阀门将发酵液以10吨/小时的速度打入转鼓，利用转鼓将发酵液进行固液 分离，获得滤液。

本发明还可以将中国被毛孢发酵获得的滤液进一步的高速离心，将其中的一些杂质微粒去 除，用于下一步的活性成分分析；部分活性成分需要经过高效液相色谱分析的，需要再次利 用0.25μm直径的膜过滤分离后进行。

众所周知，有的发酵产品包含在发酵滤液中，而有的发酵产品则包含在菌体中，而且经 过滤去除菌丝体后的发酵滤液并不一定含有一定量的活性成分，更多的是含有危害的次级代 谢产物，不一定具有循环利用的价值。例如培养基因工程菌后进行固液分离的发酵滤液，在 其中含有大量的抗生素等有害物质，由于这些抗生素很难从发酵滤液中有效地分离，如果对 这些发酵滤液进行循环利用，会使发酵滤液中的抗生素浓度积累，增加基因工程菌的耐抗生 素活性，从而会有生化危机的风险。

本发明通过对中国被毛孢的发酵滤液进行了成分检测分析，确定其中残留了一部分可利 用的活性成分，但这些活性成分的含量较低，一一分离提取这些活性成分的成本较高，但非 常适合于用作培养基用水促进菌体的积累。

以电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液作为培养基用水，配制LB培养基，考察对大肠 杆菌JM109和大肠杆菌BL21生长的影响(参见图3和图4)；以电渗析处理后的含中国被毛 孢发酵滤液作为培养基用水，配制YPD培养基，考察对毕赤酵母X-33和毕赤酵母GS115生 长的影响(参见图5和图6)；以含电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液作为培养基用水，配 制中国被毛孢和阿卡波糖产生菌犹他游动放线菌液体发酵培养基，考察对中国被毛孢和犹他 游动放线菌发酵的影响(参见图7和图8)。由于大肠杆菌为模式细菌，毕赤酵母为模式真菌， 本发明也可表明电渗析处理后的发酵滤液也可以用于大部分细菌和真菌的培养。

具体的，所述应用按如下步骤进行：

1、以含电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液作为培养基用水，配制LB培养基，培养基 成分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为7.0，考察对大肠杆菌JM109和大 肠杆菌BL21生长的影响。

2、以含电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液作为培养基用水，配制YPD培养基，培养 基成分为葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH为7.0，考察对毕赤酵母X-33和 毕赤酵母GS115生长的影响。

3、以含电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水，配制中国被毛孢液 体发酵培养基，培养基配方为葡萄糖0.8-1.2％、糖蜜0.8-1.2％、蚕蛹粉0.4-0.6％、黄豆饼粉 0.8-1.2％、酵母膏0.4-0.6％、硫酸镁0.01-0.015％、磷酸二氢钾0.015-0.025％，pH值自然，优 选为：葡萄糖1.5％，玉米粉1.0％，糊精0.5％，麸皮1.5％，酵母粉0.5％，蚕蛹粉1.5％， 蛋白胨1.0％，MgSO₄,0.01％，KH₂PO₄0.02％，pH值自然。在配制的过程中，先将蚕蛹粉、 玉米粉和麸皮加入到适当的中国被毛孢发酵滤液中液化，灭菌，取上清，然后再溶解其他培 养基组分，再灭菌，以体积浓度10％的接种量，考察对中国被毛孢发酵的影响。

4、以含电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水，配制犹他游动放线 菌发酵培养基，培养基配方为：麦芽糖43-46g/L，葡萄糖39-41g/L，黄豆饼粉16-18g/L， 谷氨酸单钠2.5-3.5g/L，CaCO₃2.4-2.6g/L，CaCl₂2.4-2.6g/L，FeCl₃0.4-0.6g/L，K₂HPO₄0.9-1.1 g/L，甘油0.9-1.1g/L，pH7.5，pH值自然，优选为：麦芽糖45g/L，葡萄糖40g/L，黄豆饼 粉17g/L，谷氨酸单钠3g/L，CaCO₃2.5g/L，CaCl₂2.5g/L，FeCl₃0.5g/L，K₂HPO₄1.0g/L， 甘油1.0g/L，pH7.5，pH值自然，将各组分混溶于适量的中国被毛孢发酵滤液和蒸馏水中， 煮沸后均匀分装至500mL的三角摇瓶中，每瓶分装50mL，115℃条件下灭菌30min后待用。 以10％的接种量，考察对阿卡波糖产生菌A.utahensisZJB-08196发酵的影响。

本发明的有益效果主要体现在：从原理上对中国被毛孢发酵滤液中的有效活性成分进行 了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢发酵滤液中有效成分的含量，通过 电渗析的方法去除其中的微量有害矿质元素以及一定浓度的金属离子，赋予中国被毛孢发酵 滤液的循环可利用性，并且用于培养其他微生物的培养基用水，为扩大中国被毛孢发酵滤液 的生物应用提供了有效途径。有效的节约了水资源，降低了排污压力，减少了污染的可能， 绿色环保。用发酵滤液替代培养基用水所进行的微生物发酵，其发酵单位优于蒸馏水或自来 水。不仅可以解决后续的废水处理所产生的成本，还可以节省培养基所用水的成本。本发明 所选择的电渗析设备及参数不仅较进口的便宜，而且在相应的参数设置下脱盐率可达95％以 上。经过电渗析后，水的收率约为90％。1000L发酵滤液，用电渗析法处理能耗成本大约是 1.88元每吨，设备成本约0.5元每吨。因此，采用电渗析法处理发酵滤液并回收利用于培养 基用水可以明显降低企业的生产成本。

本发明对中国被毛孢发酵滤液进行开发利用，对资源的有效利用和环境保护将有非常积 极的意义。

(四)附图说明

图1为电渗析装置及工作原理图；

图2为电渗析处理过程中电流及电导率的变化图；

图3为中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基用水的大肠杆菌JM109生长曲 线；

图4为中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基用水的大肠杆菌BL21生长曲线；

图5为中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基用水的毕赤酵母X-33生长曲线；

图6为中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基用水的毕赤酵母GS115生长曲 线；

图7为中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基用水对中国被毛孢生长的影响；

图8为中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基用水对犹他游动放线菌生长的 影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的培养

菌株来源：首先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到了L0106 菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢(Hirsutellasinensis)，该菌种保藏在中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中 披露。

将该菌种接种于斜面，培养基配方(此为固化之前的液体配方，按下述比例配制好之后 再制成斜面)为：葡萄糖2.0％(w/v，1％表示100mL培养基中含有1g，下同)、玉米粉1.0％、 土豆汁0.5％(所述土豆汁是指以200g/L土豆跟水熬制成糊浆液，八层纱布过滤后的滤液)、 糊精0.5％、酵母粉0.5％、麸皮1.0％、蚕蛹粉2.0％、蛋白胨1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢 钾0.05％、琼脂粉1.0％，溶剂为水；在12～16℃培养25天；然后从斜面菌种中挑4～5块黄豆 粒大小的含有菌丝体的培养基，接入已经灭菌而盛有100ml液体培养基的500ml三角瓶内， 在15-18℃条件下，在摇床上振荡培养30天(100rmp)。将已培养好的摇床菌种，注入装有 小玻璃珠的无菌瓶中进行剧烈振荡，以便将菌丝体打碎制成种子悬浮液。然后按体积浓度10％ 的接种量接入一级种子发酵罐内，100rmp、15-18℃条件下培养10天左右，再由一级种子罐 按体积浓度10％的接种量压入二级发酵罐，100rmp、15-18℃条件下培养10天左右后再压入 三级发酵罐培养40天后放罐，获得发酵液。所述的一级种子发酵罐、二级发酵罐、三级发酵 罐内均为液体培养基，液体培养基质量组成为：葡萄糖1.0％、糖蜜1.0％、蚕蛹粉0.5％、黄 豆饼粉1.0％、酵母膏0.5％、硫酸镁0.01％、磷酸二氢钾0.02％，溶剂为水，pH值自然。

实施例2：中国被毛孢发酵滤液中活性成分的检测分析

1、中国被毛孢发酵滤液的制备

实施例1发酵结束后，发酵液放罐分离，先采用板框压滤机分离后获得本发明的发酵滤 液。获得的发酵滤液为棕黄色透明液体。pH值为6.0-7.0。

2、发酵滤液中活性成分的检测分析

精确吸取经分离的中国被毛孢发酵滤液0.2mL，超纯水定容至20mL，充分混匀后取1mL 于洁净试管中，同时加入1mL高碘酸钾溶液，25℃反应10min，再加入0.1wt％L-鼠李糖 水溶液2mL，振荡均匀，加入4mL新鲜配制Nash溶液，53℃显色15min，快速冷却至室 温。用超纯水做空白，取200μL显色后冷却至室温的反应液于96孔酶标板内，每种反应液3 个复孔。在380nm-450nm的波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长。经过检测，中国被 毛孢发酵滤液中的虫草酸的含量为3.16mg/mL。

中国被毛孢发酵滤液经过0.25μm微孔膜过滤，滤液采用高效液相色谱检测。条件如下， 色谱柱：依利特C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：35℃；进样体积：20μL；流速1mL/min； 检测波长260nm；流动相：A：超纯水；B：甲醇。洗脱梯度：0min，15％B，保持3min； 3.0-3.5min，15-24％B；3.5min，24％保持5min；8.5-9.0min，24-35％B；35％B保持6min； 15.0-16.0min，35-85％B；85％B保持6min；22.0-22.5min，85％-15％B；15％B保持5min。 经过检测，中国被毛孢发酵滤液中虫草素的含量为0.56μg/ml，尿苷的含量为16.4μg/ml，鸟 苷的含量为7.9μg/ml，腺苷的含量为0.069μg/ml，胸苷的含量为4.0μg/ml。

中国被毛孢发酵滤液中蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法，经过检测，中国被毛孢发酵 滤液中的粗蛋白含量为3.1mg/mL。取3mL中国被毛孢发酵滤液，加4倍体积的95％(v/v) 的乙醇水溶液沉淀提取多糖，4℃静置1小时，12000rpm离心20min去除上清，尽量去除 干净，向沉淀中加入15mL的蒸馏水并且震荡，使得沉淀完全溶解，得粗多糖溶液，用于发 酵滤液中胞外多糖的测定。胞外多糖的测定采用苯酚-硫酸法进行，经检测，中国被毛孢发酵 滤液中的总糖含量为11.2mg/mL，胞外多糖的含量为2.8mg/mL。

经检测，中国被毛孢发酵滤液中的天冬氨酸含量为0.97μg/mL，苏氨酸含量为2.04 μg/mL，丝氨酸含量为1.43μg/mL，甘氨酸含量为1.55μg/mL，丙氨酸含量为1.075μg/mL， 半胱氨酸含量为6.495μg/mL，异亮氨酸的含量为5.295μg/mL，亮氨酸的含量为7.94μg/mL， 苯丙氨酸的含量为74.255μg/mL，组氨酸的含量为90.855μg/mL，赖氨酸的含量为28.58 μg/mL，精氨酸的含量为24.69，氨基酸的总含量为245.18μg/mL。

中国被毛孢发酵滤液与各金属元素标准液分别进样，火焰原子吸收光谱法测定其吸光度， 经检测，中国被毛孢发酵滤液中Na元素的含量为399.05μg/mL，K元素的含量为172.02 μg/mL，Mg元素的含量为0.822μg/mL，Ca元素的含量为41.22μg/mL，Fe元素的含量为1.15 μg/mL，Zn元素的含量为0.029μg/mL，Cu元素的含量为0.014μg/mL，Ni元素的含量为0.12 μg/mL，未发现Mn、Pb、Co元素。

经分析，中国被毛孢发酵滤液中的虫草酸、核苷类物质、粗蛋白和氨基酸等活性成分对 菌体的生长不具有负面影响或者具有积极影响，而发酵滤液中积累的矿质元素可能会对所培 养的菌体渗透压具有一定的影响，需排除积累的矿质元素的负面影响。

实施例3：中国被毛孢发酵滤液的制备

将实施例1方法培养好的78吨冬虫夏草中国被毛孢发酵液打入6吨的高位储罐中，利用 位差的压力并通过控制阀门将发酵液以10吨/小时的速度打入转鼓，利用转鼓将发酵液进行 固液分离，获得约75吨发酵滤液。在实验过程中，分别收集发酵滤液原液、活性炭脱色后离 心分离所得发酵滤液和电渗析后发酵滤液淡水(用于对比其循环利用效果，取蒸馏水作为实 验对照)。

实施例4：中国被毛孢发酵滤液的电渗析处理

电渗析装置(电渗析装置原理图如图1所示)，膜为聚乙烯均相离子交换膜，阳膜和阴膜 的型号分别为LE-HeM-CM01和LE-HeM-AM01，由浙江千秋环保水处理有限公司生产，以 实施例3制备的75吨发酵滤液为进水，最优电渗析条件为：料液流量为300L/h、运行电压 为30V时，处理时间约为20分钟，脱盐率达95％；经处理后，75吨发酵滤液可获得再利用 的水67吨(即发酵滤液回收水)。若选用其他电渗析条件，脱盐率及水回收率较低。比如选 用料液流量为200L/h、运行电压为20V时，处理时间约为80分钟，其脱盐率为92％；经处 理后，75吨发酵滤液可获得再利用的水64吨。选用料液流量400L/h、运行电压为30V时， 处理时间约为18分钟，其脱盐率为88％；经处理后，75吨发酵滤液可获得再利用的水65吨。

稳压条件下电渗析处理过程中电流及电导率的变化如图2所示。通过图2可以看出：在 稳压状态下，发酵滤液中的电流逐渐降低，电导率也逐渐降低，处理完毕后，其电导率基本 和蒸馏水的电导率接近，说明处理后的发酵滤液中的大部分金属离子被去除。

同样条件下，将聚乙烯均相离子交换膜改为浙江赛特膜技术有限公司提供的Ⅰ型异相离 子交换膜，料液流量为300L/h、运行电压为30V时，处理时间约为30分钟，其脱盐率为85％。 选用浙江赛特膜技术有限公司提供的Ⅱ型异相离子交换膜，料液流量400L/h、运行电压为30 V时，处理时间约为20分钟，其脱盐率为70％。

实施例5：中国被毛孢发酵滤液作为培养基用水在大肠杆菌培养上的循环应用

以实施例4电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水，分别考察了其 对大肠杆菌JM109和大肠杆菌BL21生长的影响，并且与以蒸馏水作为培养基用水进行了对 比。

以含电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水，配制LB培养基，培 养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为7.0，分别接种大肠杆菌JM109 和大肠杆菌BL21，在37℃培养11小时，考察对大肠杆菌JM109和大肠杆菌BL21生长的影 响，实验结果如图3和图4所示，可以看出中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基 用水对大肠杆菌JM109和大肠杆菌BL21生长的影响基本相同，生长曲线基本相似。因此， 中国被毛孢可以作为大肠杆菌JM109和大肠杆菌BL21的培养基用水加以循环应用。由于大 肠杆菌为模式细菌，本实施例的结论也可表明电渗析处理后的发酵滤液回收水也可以用于大 部分细菌的培养。

实施例6：中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水在毕赤酵母培养上的循环应用

以实施例4电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水，分别考察了其 对毕赤酵母X-33和毕赤酵母GS115生长的影响，并且与以蒸馏水作为培养基用水进行了对 比。

以含电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水，配制YPD培养基，培 养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH为7.0，考察对毕赤酵母X-33 和毕赤酵母GS115生长的影响，培养条件为30℃培养27小时。实验结果如图5和图6所示， 可以看出中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基用水对毕赤酵母X-33和毕赤酵母 GS115生长的影响基本相同，生长曲线基本相似。因此，中国被毛孢发酵滤液回收水可以作 为毕赤酵母X-33和毕赤酵母GS115的培养基用水加以循环应用。由于毕赤酵母为模式真菌， 本实施例的结论可表明电渗析处理后的发酵滤液回收水也可以用于大部分真菌的培养。

实施例7：中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水在中国被毛孢培养上的循环应用

以实施例4电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水，考察了其对中 国被毛孢L0106生长的影响，并且与以蒸馏水作为培养基用水进行了对比。

以含电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水，配制中国被毛孢液体 发酵培养基，培养基配方为：葡萄糖1.5％，玉米粉1.0％，糊精0.5％，麸皮1.5％，酵母粉0.5％， 蚕蛹粉1.5％，蛋白胨1.0％，MgSO₄,0.01％，KH₂PO₄0.02％，pH值自然。在配制的过程中， 先将蚕蛹粉、玉米粉和麸皮加入到适当的中国被毛孢发酵滤液回收水中液化，灭菌，取上清， 然后再溶解其他成分，再灭菌。斜面培养基配方为在液体培养基基础上加质量浓度2％的琼脂 粉。用灭菌的接种铲从斜面培养基上一并挑取大约2cm²菌块连同部分培养基到种子液体培 养基中，16℃培养30天(100rpm)。以体积浓度10％的接种量，接种种子液体培养基至摇瓶 发酵液体培养基中，15-18℃培养约10天(100rpm)，并考察对中国被毛孢L0106发酵的影响。 实验结果如图7所示，可以看出中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基用水对中国 被毛孢发酵后菌丝体干重的影响基本相同，经过7天的发酵后，对照组的中国被毛孢菌丝体 干重为18g/L，而以电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基培养的中国被毛 孢菌丝体干重为27.1g/L。因此，中国被毛孢发酵滤液回收水作为中国被毛孢的培养基用水具 有提高中国被毛孢菌丝体量的作用，可以加以循环应用。

实施例8：中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水在犹他游动放线菌上的循环应用

以实施例4电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水作为培养基用水，考察了其对阿 卡波糖产生菌ActinoplanesutahensisZJB-08196(参见中国专利201010605912.3发明名称：α- 淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法)生长的影响，并且与以蒸馏水作为培养基用水进行了对 比。

以含电渗析处理后的中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水作为培养基用水，分别配制A. utahensisZJB-08196液体发酵培养基，培养基配方为：麦芽糖45g/L，葡萄糖40g/L，黄豆饼 粉17g/L，谷氨酸单钠3g/L，CaCO₃2.5g/L，CaCl₂2.5g/L，FeCl₃0.5g/L，K₂HPO₄1.0g/L， 甘油1.0g/L，pH7.5，将各组分混溶于适量的中国被毛孢发酵滤液回收水和蒸馏水中，煮沸后 均匀分装至500mL的三角摇瓶中，每瓶分装50mL，115℃条件下灭菌30min后待用。斜面 培养基配方为在液体培养基基础上加质量浓度2％的琼脂粉。用灭菌的接种铲从斜面培养基上 一并挑取大约2cm²菌块连同部分培养基到种子液体培养基中，26℃培养15天(100rpm)。 以体积浓度10％的接种量，接种种子液体培养基至摇瓶发酵液体培养基中，26℃培养约15 天(100rpm)，并考察对犹他游动放线菌ZJB-08196发酵的影响。结果如图8所示，可以看 出中国被毛孢发酵滤液和蒸馏水作为培养基用水对犹他游动放线菌生长的影响基本相同，菌 种的生长过程基本相似。因此，中国被毛孢发酵滤液可以作为犹他游动放线菌的培养基用水 加以循环应用。