一种快速高分离度液相色谱检测金银花和山银花药材的方法

摘要

本发明提供了一种利用快速高分离度液相色谱(RRLC)检测金银花和山银花药材的方法。金银花具有显著的抗菌、抗炎、抗病毒等生物活性，被广泛添加到复方药物、食品、饮料等相关产品中。由于金银花和山银花的价格差距较大，市场上存在将山银花作为金银花的主要代替品用于金银花产品的掺假。本发明方法能够在8分钟内同时分析出金银花和山银花所含的绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙等4种化合物，可用于鉴定金银花和山银花药材，以监控金银花原料及产品的质量，具有良好的精密度、可重复性和准确性。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及中药材检测方法，具体涉及中药材金银花和山银花的 检测方法。

背景技术

金银花为忍冬科(Caprifoliaceae)植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干 燥花蕾或带初开的花，原产于亚洲东部，包括中国、日本、韩国。金银花具有清热解毒、凉散 风热及抗菌消炎等功效，被广泛用于治疗痈、急性痢疾、咽炎以及由病毒或细菌感染引发的 上呼吸道系统疾病。此外，金银花还具有抗菌、抗炎及抗病毒(如：甲型H1N1流感病毒)等药 理作用。双黄连口服液是一种传统的复方中药，金银花作为其主要原料之一，主要用于治疗 上呼吸道感染、急性支气管炎以及轻度肺炎。金银花还广泛应用于食品、饮料以及其他相关 产品。因此，金银花获得了广泛的关注和市场需求，其结果不可避免的是市场上发现了大量 金银花掺假产品，主要是掺入不同种类的山银花。山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬 LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.、华南忍冬LoniceraconfusaDC.、红腺忍冬 LonicerahypoglaucaMiq.或黄褐毛忍冬LonicerafulvotomentosaHsuetS.C.Cheng的干 燥花蕾或带初开的花，摘自《中国药典》。虽然这两种草药外观形态和化学成分不同，但其药 材特性和适应症类似。按《中国药典》采用高效液相色谱法测定，山银花含绿原酸 (C16H18O9)不得少于2.0％，含灰毡毛忍冬皂苷乙(C65H106O32)和川续断皂苷乙 (C53H86O22)的总量不得少于5.0％。金银花含绿原酸(C16H18O9)不得少于1.5％，含木犀草 苷(C21H20O11)不得少于0.050％。绿原酸(3-O-咖啡酰奎宁酸)是金银花中的主要化合物， 可作为重要的标志物用于检测。大量研究表明，绿原酸有潜在的抗炎、镇痛、退热、抗诱变和 抗癌活性[3]。文献报道，HPLC法与UV-LESD[4]或者MS[5]联用可用于分析金银花的活性成 分。然而，这些方法不仅分析时间长，而且需使用大量有机溶剂作为流动相。目前，尚未发现 有相对LC更简便的方法可从金银花中区分出山银花，尤其是RRLC法。

发明内容

本发明的任务是提供一种快速高分离度液相色谱检测金银花和山银花药材的方 法。

实现本发明的技术方案是:

本发明提供的这种快速高分离度液相色谱检测金银花和山银花药材的方法，其特 征在于，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以含 0.1％甲酸的乙腈溶液为流动相B对待检药材样品检测。该方法的色谱条件为：柱温为40℃， 流速为1.0ml/min，进样量为1μl，按下表进行梯度洗脱:

检测波长为327nm(0～3min)、350nm(3～5min)，用蒸发光散射检测器检测皂苷类 化合物(5～8min)。

本发明提供的这种快速高分离度液相色谱检测金银花和山银花药材的方法，包括 制备待测样品溶液、色谱检测、结果判断三个步骤，各步骤的具体方法是：

步骤一、制备待测样品溶液：取待测样品，用研钵磨成细粉，取细粉0.10g，精密称 定，然后加70％甲醇水溶液10ml，并在37℃超声处理15min，超声处理后，放冷至室温，用 70％的甲醇水溶液调整至10ml，制得待测样品溶液；

步骤二、色谱检测：

取待测样品溶液用0.20μm的滤膜过滤，取1μl进样，记录色谱，

色谱条件为：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(LunaC18-HST(2)柱(2.5μm,100mm× 3.0mm))；

以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以含0.1％甲酸的乙腈溶液为流动相B，柱温为40 ℃；

流速为1.0ml/min；

进样量为1μl；梯度洗脱见表1。

表1梯度洗脱

检测波长为327nm(0～3min)、350nm(3～5min)，用蒸发光散射检测器检测皂苷类 化合物(5～8min)；

步骤三、结果判断：将所得色谱图与金银花及山银花指纹图谱比较，主峰即为绿原 酸，金银花及山银花都有此主峰，所述的主峰具体为2.295min处的色谱峰；6min处出现两个 色谱峰即判断样品为山银花，具体是6.021min和6.341min处有两个色谱峰即判断样品为山 银花，此两个色谱峰分别为灰毡毛忍冬皂苷乙峰和川续断皂苷乙峰。6min处无特征色谱峰 即判断样品为金银花。

本发明提供的快速高分离度液相色谱检测金银花和山银花药材的方法具有操作 简单，方法可靠，重现性好等特点，可用于绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂 苷乙的含量测定。此外，该方法可以很容易地在8分钟内通过检测出皂苷类化合物而区分出 山银花。

本发明方法的具体色谱条件为：Agilent1200SL型高效液相色谱仪(MW检测器、自 动进样器)；色谱柱：LunaC18-HST(2.5μm，100×3.0mm)；流动相：流动相A(H₂O+0.1％ HCOOH)；流动相B(CH₃CN+0.1％HCOOH)；梯度洗脱见表1；流速：1.0ml/min；检测波长：UV检测 器：327nm(0～3min)、350nm(3～5min)；ELSD检测器(5～8min)；柱温：40℃；进样量：1μl；总 分析时间：8min。

实验资料

1.实验材料和方法

灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、华南忍冬分别从重庆、贵州、广州收集，并通过psbA- trnH基因间的间距器^[6]确定山银花样品的产地。

2.1.试剂与材料

甲醇：色谱纯，FisherScientific(Ottawa,加拿大)

乙腈：色谱纯，FisherScientific(Ottawa,加拿大)

纯水：Nanopure超纯水系统(Barnstead,美国)

甲酸：色谱纯，J.T.BakerChemicalCompany(London,英国)

川续断皂苷乙(96％)对照品：TauToBioTech(上海,中国)

绿原酸、木犀草苷(91.5％)、毡毛忍冬皂苷乙(93.3％)对照品：中国药品生物制品 检定所(北京,中国)

金银花：山东、河南、湖南、贵州、湖北、河北、四川、山西。

绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙等活性成分的化学结构见图 1。

2.2.溶液的制备

单一对照品溶液储备液：

分别取绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对照品适量，以甲醇 为溶剂，制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液储备液，保存于4℃。

分别精密量取上述对照品溶液储备液适量，稀释至0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml备用。

供试品溶液：

供试品灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、华南忍冬等山银花品种药材和金银花药材被保 存在干燥器中。

取5g样品磨成细粉，取细粉0.10g，精密称定，然后用10ml70％甲醇水溶液提取并 在37℃超声处理15分钟。

超声处理后，用70％的甲醇水溶液调整至10ml。在进样之前，所有液体样品用0.20 μm的滤膜(VWRInternational：Mississauga,Canada)过滤，滤过，取续滤液作为供试品溶 液。

2.3.实验仪器和色谱条件

Agilent1200SL型高效液相色谱仪(MW检测器、自动进样器)；

色谱柱：LunaC18-HST(2.5μm，100×3.0mm)；

流动相：流动相A(H₂O+0.1％HCOOH)；

流动相B(CH₃CN+0.1％HCOOH)；

梯度洗脱见表1；

流速：1.0ml/min；

检测波长：UV检测器：327nm(0～3min)、350nm(3～5min)；ELSD检测器(5～8min)

柱温：40℃

进样量：1μl

总分析时间：8min

表1梯度洗脱

3.实验结果和讨论

3.1.实验方法的建立

流动相和检测波长的确定是RRLC法最重要的两点。实验中曾对多种流动相进行考 察，如以0.1％磷酸水溶液为流动相A。需用ELSD来检测山银花中的皂苷类化合物，因此，流 动相A选用具有挥发性的溶剂甲酸来代替磷酸。通过比较对照品溶液的紫外吸收，发现绿原 酸在327nm处具有特征吸收，木犀草苷最大吸收在350nm处，而灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂 苷乙均没有紫外吸收。因此，检测波长被确定为327nm(0～3min)，350nm(3～5min)和ELSD 检测器(5～8min)，来同时分析金银花中的目标化合物。

3.2.方法学验证

3.2.1线性和范围、检测限和定量限、回收率实验

以峰面积(y)对浓度x(mg/ml)进行线性回归，计算线性回归方程，结果见表2。相关 系数均高于0.99，可知绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙质量浓度在相 应范围内与峰面积均呈良好的线性关系，可以满足测定要求。

图2为“2.3.实验仪器和色谱条件”项下色谱条件进样分析的混合对照品溶液的 RRLC色谱图(绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙)；

信噪比(S/N)为3：1计算，绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙检 测限分别为0.08、0.16、0.25、0.24ug/ml；

信噪比(S/N)为10：1计算，定量限分别为绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川 续断皂苷乙0.28、0.50、0.85、0.85ug/ml；

回收率实验可对方法的准确度进行评价。正品金银花和黄褐毛忍冬、华南忍冬等 山银花品种的粉末提取物中分别掺入已知量的四个对照。然后将样品以一式三份进行提取 分析。并将结果与原来未掺入对照品的样品进行比较。4种生物活性化合物的回收率为 95.5-99.5％，4种对照品的RSD值均小于2.35％。

表24个对照品化合物的回归方程，检测限和定量限，保留时间，回收率

(绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙)

3.2.2精密度实验

由两名实验人员提取分析3批金银花和黄褐毛忍冬、华南忍冬等山银花品种的药 材，进行重现性实验。每位实验人员用各自制备的流动相溶液制备一式两份的样品溶液进 行提取分析。所有待测样品中的绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的RSD 值均小于1.8％，表明该实验方法具有良好的重现性。

3.2.3耐用性实验

研究不同的色谱参数对分离的影响可以评价方法的耐用性，可通过系统地改变下 列因素：流动相A的pH值设置为1.8、2.0和2.2，流速设置为为0.95、1.0和1.05ml/min，柱温 设置为38、40和42℃。只有一个因素改变而其他参数保持恒定，使样品在各种条件下进行分 析。所有关键分离均实现了与指定的最低基线分离。此外，样品在任何上述条件下分离度均 符合要求，这表明该方法在测定范围内具有良好的耐用性。

3.3.样品分析

用上述已验证的RRLC法对4个忍冬物种和6批商业金银花药材和1批忍冬叶的生物 活性化合物进行定性分析。通过比较相同条件下洗脱的对照品和加入对照品的样品各色谱 峰的保留时间，进一步证实了所有研究的化合物的色谱峰。相应的RRLC色谱图如图3～13所 示(0～5.5minUV检测；5.5～8minELSD检测)。

RRLC色谱图结果表明，可以通过6分钟出峰的皂苷部分将具有显著差异的金银花 和山银花区分开来。忍冬叶中的木犀草苷含量明显高于金银花。结果还表明，通过ELSD检测 这些金银花样品中的皂苷类化合物，可知这些来自湖北、贵州、山西、湖南等不同的省份的 商业金银花药材，并不像供应商所说的已鉴定为正品金银花。具体而言，这6个商业样品中， 来自湖南的两个样本实际上是灰毡毛忍冬，它是山银花的主要品种之一。

4.结论

金银花和山银花具有不同的外观和化学成分，但其药材特性和适应症类似。其中， 金银花被广泛添加到复方药物、食品、饮料等相关产品中。并且它具有显著的抗菌、抗炎、抗 病毒等生物活性。由于二者价格差距较大，在目前的市场上山银花作为金银花的主要代替 品，广泛用于金银花产品的掺假。在本研究中，我们已经成功地建立了一个RRLC方法来控制 金银花产品及金银花原料的质量。这种RRLC方法能够在8分钟内同时分析4种生物化合物， 如绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙。此外，这种方法得到了充分验证， 具有良好的精密度、可重复性和准确性。

附图说明

图1：绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙等活性成分的化学结 构；

图2：为“2.3.实验仪器和色谱条件”项下色谱条件进样分析的混合对照品溶液的 RRLC色谱图(绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙)；

图3：金银花RRLC色谱图(湖南)；

图4：忍冬叶RRLC色谱图(湖南)；

图5：华南忍冬RRLC色谱图(湖南)；

图6：黄褐毛忍冬RRLC色谱图(湖南)；

图7：灰毡毛忍冬RRLC色谱图(重庆)；

图8：金银花RRLC色谱图(河南)；

图9：金银花RRLC色谱图(湖北)；

图10：金银花RRLC色谱图(贵州)；

图11：金银花RRLC色谱图(山西)；

图12：灰毡毛忍冬RRLC色谱图(湖南)；

图13：灰毡毛忍冬RRLC色谱图(湖南)；

图14：为金银花与山银花标准品溶液RRLC色谱图，色谱图中1为绿原酸，2为木犀草 苷，3为灰毡毛忍冬皂苷乙，4为川续断皂苷乙；

图15：图15色谱图与图14标准品色谱图比较可知6.021min和6.341min处有两个色 谱峰3、4，可判断样品为山银花；

图16：图16色谱图与图14标准品色谱图比较可知2.295min处色谱峰1为主成分， 6min处无特征色谱峰，可判断样品为金银花。

具体实施方式

实施例1金银花与山银花的鉴定检测

1.制备待测样品溶液：取待测样品5g，用研钵磨成细粉(过2号筛)，取细粉0.10g， 精密称定，然后加70％甲醇水溶液10ml，并在37℃超声处理15min。超声处理后，放冷至室 温，用70％的甲醇水溶液调整至10ml。在进样之前，待测样品溶液用0.20μm的滤膜过滤，取 1ul进样，记录色谱。

2.色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(LunaC18-HST(2)柱(2.5 μm,100mm×3.0mm))；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以含0.1％甲酸的乙腈溶液为流动相 B，柱温为40℃；流速为1.0ml/min；进样量为1μl；采用梯度洗脱，见表1；检测波长为327nm(0 ～3min)、350nm(3～5min)，皂苷类化合物(5～8min)用蒸发光散射检测器检测。将所得色谱 图与金银花及山银花指纹图谱比较，主峰即为绿原酸，其余成分一一对应，可对药材进行鉴 别，见图14、图15、图16。

表1梯度洗脱

3.结果

本RRLC方法用于鉴定待测样品是金银花还是山银花：

见图14、图15、图16。

图14色谱图为金银花与山银花标准品溶液RRLC色谱图，色谱图14中1为绿原酸，2 为木犀草苷，3为灰毡毛忍冬皂苷乙，4为川续断皂苷乙；图15色谱图与图14标准品色谱图比 较可知6.021min和6.341min处有两个色谱峰3、4，可判断样品为山银花。图16色谱图与图14 标准品色谱图比较可知2.295min处色谱峰1为主成分，6min处无特征色谱峰，可判断样品为 金银花。

参考文献：

[1]TheStateCommissionofChinese.PharmacopoeiaofPeople’sRepublic ofChina(Chineseversion),VolumeⅠ,ChemicalIndustryPress,Beijing,2010, PP.205-206.

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