一种木霉直接发酵作物秸秆制备木霉固体菌种的方法及制备的产品

摘要

本发明公开了一种木霉直接发酵作物秸秆制备木霉固体菌种的方法及制备的产品。该方法包括向作物秸秆中加入液体氨基酸调节起始pH为3.0-4.0，然后接种木霉液体菌种进行固体发酵获得木霉固体菌种。本发明通过调控固体材料的pH值，创造一个让木霉快速生长、繁殖和抑制其他杂菌生长的固体发酵材料的酸度，同时，筛选出最佳的木霉营养配方，创造性地建立了一种廉价的木霉固体菌种发酵专利技术工艺，在腐熟的堆肥中，添加按照本发明方法制备的1％的木霉固体菌种，就能使木霉生物有机肥中木霉孢子含量达到5×107个/g以上，施用该木霉生物有机肥产品后增产效果显著。

说明书

技术领域

本发明属于菌种发酵领域，涉及一种木霉直接发酵作物秸秆制备木霉固体菌种的方法及制备的产品。

背景技术

木霉属真菌(Trichodermaspp.)被广泛用于防治土传枯萎病，被认为是最理想的生防菌，具有分布广泛、极易分离和培养、可抑制多种土传病原菌生长的作用，而且兼具有多种生防机制，包括重寄生作用、抗生作用、竞争作用和诱导抗性等等。尤其是哈慈木霉属在黄瓜、西瓜、香蕉、山药、茄子、棉花等多种作物上均表现出很好的防治土传枯萎病或黄萎病的作用。木霉菌株在根际定殖能够与尖孢镰刀菌形成竞争关系，以此抑制尖孢镰刀菌的生长、快速降解尖孢镰刀菌释放的毒素、乃至分解尖孢镰刀菌菌丝体进而以这些菌丝体为营养吞食尖孢镰刀菌，从而减少多种作物的土传枯萎病发病。大量研究结果表明哈茨木霉与一定的有机载体制成的生物有机肥施入土壤后作物土传枯萎病的防控效果可达80％以上。

但是，为什么木霉生物有机肥产业始终发展不起来？其主要原因是木霉固体菌种难以制备，或者说制备的木霉固体菌种孢子密度不够，很难用于生产达到行业标准的木霉生物有机肥产品的孢子密度(2×10⁷个/g)，因为要达到这个最终产品中的孢子浓度，必须生产出木霉孢子密度为10⁹个/g以上的木霉固体菌种，然后以3％-5％的固体菌种加入量加到腐熟的堆肥中去。而过去生产木霉固体菌种的基本技术路线是：固体材料先灭菌，调节固体材料湿度，然后接种木霉菌种，维持固体发酵空间的湿度和温度，进行固体发酵(繁殖)。工厂化生产中往往会出现很多问题难以实现木霉菌的高密度固体发酵目标，例如，大规模固体发酵的固体材料难以达到彻底的灭菌，即便是固体材料灭菌很彻底，而固体发酵过程中也难以控制空气中的杂菌进入固体材料，而杂菌的快速生长往往使接种的木霉菌种难以快速生长和繁殖至10⁹个孢子/g以上；其次，工厂化生产中如此大量的固体材料灭菌大大增加了企业生产成本，再加上固体发酵过程中严格控制发酵空间的空气净化程度成本，成为木霉固体发酵经济可行性的最大瓶颈；第三，由于还没找到能够迅速使木霉生长和繁殖的最佳营养配方，木霉在固体材料中的生长和繁殖速度较慢，很难成为优势种群而快速繁殖、抑制杂菌生长。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种木霉直接发酵作物秸秆制备木霉固体菌种的方法。

本发明的另一目的是提供该方法制备的产品。

本发明的又一目的是提供该产品的在制备有机肥中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种木霉直接发酵作物秸秆制备木霉固体菌种的方法，包括向作物秸秆中加入氨基酸稀释液后调节起始pH为3.0-4.0，陈化后接种木霉液体菌种进行固体发酵获得木霉固体菌种；其中发酵室内温度为30±2℃，室内空气湿度65％±5％。

其中，所述的起始pH优选3.0-3.5。

所述的氨基酸稀释液由氨基酸水解液加水稀释所得；所述的氨基酸水解液优选通过以下方法制备而成：(1)在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭的水解罐后，在初始酸浓度c(1/2H₂SO₄)为3-5molL^-1、80-100℃和1-2个大气压下水解2-5小时；(2)水解结束待水解罐内溶液冷却至80℃以下时，静置分层，收集中层的氨基酸溶液即为所述的氨基酸水解液。氨基酸水解液含氨基酸和各种肽类物质约10％(g/100ml)及以上。

作为本发明方法的一种优选，以氨基酸水解液为基准，氨基酸稀释液的加入量为每100g晒干后的秸秆加入10-20ml氨基酸水解液；进一步优选每100g晒干后的秸秆加入10ml氨基酸水解液。

如果加入氨基酸稀释液后pH不在3.0-4.0范围内需用碱或酸进行调节。

作为本发明的一种优选方式，所述的作物秸秆选自玉米秸秆，玉米秸秆晒干后含水量为约15％，含有机碳量为66％，当每100g晒干后的玉米秸秆加入10-20ml氨基酸水解液后能够使发酵材料的C/N比较合适，满足木霉生长的喜好。

作为本发明的一种优选方式，所述的玉米秸秆的细度为3-4mm，优选3mm。

本发明方法中，木霉液体菌种在秸秆中的接种量优选10％(ml/100g)。木霉液体菌种中木霉浓度为10⁸cfu/ml。所述的木霉液体菌种无需孢子液体，发酵的木霉新鲜液体即可。

本发明方法中，所述的固体发酵时间优选7-10天，进一步优选9天。

本发明方法中所述的木霉包括用于防治土传枯萎病的一切木霉属真菌，优选哈茨木霉。并不局限于某个特定的木霉菌株。

本发明没有做详细说明之处，均可通过现有技术或本领域公知常识实现。

按照本发明所述的方法制备的木霉固体菌种。

本发明所述的木霉固体菌种在生产生物有机肥中的应用。

一种含木霉的生物有机肥，在腐熟的堆肥中，添加1％本发明所述的木霉固体菌种所得。

本发明的发明点在于：

1、发明了既能控制杂菌生长、又能促进木霉生长的固体材料的最佳pH值

将没有灭菌的玉米秸秆与不同pH值的酸解性氨基酸按200g秸秆20ml氨基酸水解液的比例加入氨基酸稀释液，充分混匀后静置6小时，然后按10％(ml/100g)的接种量接种木霉液体菌种(无需孢子液体，发酵的木霉新鲜液体即可)，此时堆体的含水量为60％，然后在发酵室内温度为30±2℃，室内空气湿度65％±5％和黑暗条件下进行固体发酵，在不同发酵时间段采集样品，测定木霉孢子密度。

表1不同pH值对木霉和杂菌生长的影响

从表1可看出，当固体材料开始发酵时的pH为2.5及以下时，木霉和杂菌生长繁殖的速度均很慢，固体发酵9天后菌含量比开始时略有增加，但均没有超过一个数量，尤其是杂菌含量几乎没怎么增加，说明开始发酵时的pH太低，均抑制了木霉和杂菌的生长。当固体材料开始发酵时的pH为3.0、3.5和4.0时，木霉生长和繁殖速度显著加快，其中固体材料开始发酵时的pH为3.5时，木霉生长和繁殖的速度最快，发酵9天后木霉菌的含量达到5.8×10⁹个/g，而杂菌生长繁殖的速度在pH值为3.0、3.5和4.0时仍然生长很慢。当固体材料开始发酵时的pH超过4.5时，杂菌的生长繁殖速度明显加快，而木霉的生长繁殖速度明显被降下来，在所试验的pH4.5和6.5之间，杂菌的生长繁殖速度随着pH增加而迅速加快，例如，当固体材料开始发酵时的pH为6.5时，发酵9天后杂菌含量达到4.0×10⁹个/g，而木霉含量只有1.9×10⁸个/g。显而易见，木霉含量的下降是由于杂菌生长速度太快造成的。

上述结果表明，只要将一开始发酵的固体材料pH控制在3.0-4.0，特别是将一开始发酵的固体材料pH控制在3.0-3.5，就能有效抑制固体材料中杂菌的生长，而这个pH值不影响木霉的生长繁殖，使最终固体材料中木霉菌含量达到4.6×10⁹个/g及以上，如果用这个固体菌种按1％的比例加入到腐熟的有机肥料中，就可以获得至少4.6×10⁷个/g含量的木霉生物有机肥产品，超过了生物有机肥的行业标准(2×10⁷个/g)。

这个发明点(控制杂菌生长、而又能促进木霉生长的固体材料开始发酵时的pH值为3.0-4.0)，使企业无需对固体材料进行灭菌，只要控制好固体材料开始发酵时的pH值就可以了，这为大规模工厂化生产木霉生物有机肥提供了经济有效的技术工艺。

2、发明了适合于木霉固体菌种发酵的最佳营养配方

木霉喜欢C/N比较高的发酵材料，但由于作物秸秆碳的有效性差异很大，人为添加无机氮以调节发酵材料的C/N需要获得大量的数据，如果简单的用化学测定作物秸秆的总有机碳，来计算和添加部分无机氮，很难获得一个木霉生长最佳的营养配方，本发明采用玉米秸秆与不同比例的无机氮、氨基酸氮进行固体发酵，测定不同处理下木霉含量，力求获得一个木霉生长的最佳营养配方。

表2不同营养配方对木霉含量的影响

注：发酵开始时固体材料的pH为3.0-3.5，发酵室内温度为30±2℃，室内空气湿度65％±5％，硫酸铵的含氮量为21％，氨基酸水解液的含氮量为1.2％，玉米秸秆的含有机碳量为66％。

从表2可看出，玉米秸秆与硫酸铵混配，能使木霉进行一定的生长繁殖(见图1硫铵拌+木霉)，例如，作物秸秆200g与2g硫酸铵混配后发酵9天，木霉含量能达到7-9×10⁸个/g，但如果用这个固体菌种按1％的比例加入到腐熟的有机肥料中，木霉生物有机肥产品中木霉含量为7-9×10⁶个/g，达不到生物有机肥的行业标准(2×10⁷个/g)。从表2可看出，玉米秸秆与氨基酸水解液混配，可显著加速木霉的生长繁殖，尤其是在200g作物秸秆与40ml氨基酸水解液混配后发酵9天，木霉含量可达到5.9×10⁹个/g，生长后期已全部转化成绿色的木霉孢子(见图1氨基酸拌+木霉)，如果用这个固体菌种按1％的比例加入到腐熟的有机肥料中，木霉生物有机肥产品中木霉含量为5.9×10⁷个/g，产品储存半年后木霉含量还显著高于产品标准(见表3第三行)。我国在生物有机肥产品管理方面，要求产品储存半年后，其功能菌含量仍然超过2×10⁷个/g，因此，在木霉固体菌种制造时必须使木霉菌含量超过5.9×10⁹个/g，否则，在木霉生物有机肥产品制造时就得相应增加木霉固体菌种的加入量，这会增加生物有机肥企业的生产成本。

本发明点找到了一种能使木霉高密度固体发酵的营养配方，即晒干后的秸秆(含水量15％)与氨基酸稀释液液按100(g)晒干后的秸秆:10(ml)氨基酸水解液的比例直接混合后接种即可。在确保每100g晒干后的秸秆加10ml氨基酸水解液的情况下，一般100g晒干后的秸秆添加200-210ml氨基酸稀释液，即可实现家中10％木霉菌种后堆体的含水量在60-70％。

表3木霉生物有机肥储存过程中木霉菌含量的变化

注：产品I是指木霉生物有机肥，是将木霉液体菌种按照5％的接种量加入到腐熟猪粪有机肥中经过二次发酵所得；产品II是指本发明固体木霉菌种按1％的比例加入到腐熟猪粪有机肥中经过二次发酵所得。

生物有机肥产品中功能菌含量的行业标准为：2×10⁷个/g。

3、发明了用于木霉固体发酵的秸秆细度

木霉固体发酵需要一定的氧气，但在固体发酵过程中又不能通过翻动来补充氧气，因为翻动就会折断木霉菌丝体而产生孢子，从而抑制木霉菌丝体的生长，为了保证固体发酵基质中有一定的氧气浓度，生产上往往将固体材料弄的粗一点，但如果固体材料太粗，一是木霉较难利用而又影响其生长繁殖，二是太粗的固体菌种后续拌入生物有机肥后很难做成品相和质量更高的生物有机肥产品。本发明获得了一个既能让木霉最有效利用作物秸秆、又能使木霉固体菌种拌入生物有机肥后的细度达到产品要求。

表4秸秆细度对木霉固体发酵的影响

注：发酵开始时固体材料的pH为3.0-3.5，发酵室内温度为30±2℃，室内空气湿度65％±5％，

从表4可看出，玉米秸秆细度为3mm时，木霉发酵最好，到第9天时木霉孢子含量达到5.9×10⁹个/g，而秸秆细度小于2mm时，由于太细影响了发酵基质的通气性能，发酵9天时木霉孢子含量只有5-7×10⁸个/g，而当秸秆细度大于5mm时，由于水分散失太快和秸秆利用程度下降，也影响木霉的生长繁殖，到发酵9天时，其木霉孢子含量为9.9×10⁸个/g，也不能作为木霉固体菌种备用。

本发明点确定了用于木霉固体菌种发酵的秸秆细度应为3-4mm，优选3mm，这个秸秆细度工厂化生产时比较容易做到。

有益效果：

本发明针对工厂化木霉固体发酵存在的上述瓶颈问题，一改传统的固体材料灭菌之思路，通过调控固体材料的pH值，创造一个让木霉快速生长、繁殖和抑制其他杂菌生长的固体发酵材料的酸度，同时，筛选出最佳的木霉营养配方，创造性地建立了一种廉价的木霉固体菌种发酵专利技术工艺，在腐熟的堆肥中，添加按照本发明方法制备的1％的木霉固体菌种，就能使木霉生物有机肥中木霉孢子含量达到5×10⁷个/g以上，施用该木霉生物有机肥产品后增产效果显著。可见，本发明方法适合于普通生物有机肥企业生产合格的木霉生物有机肥产品。

附图说明

图1秸秆添加不同液体后木霉发酵后的结果图

其中：水拌+木霉：先用水拌秸秆后再接种木霉菌；硫铵拌+木霉：先用硫酸铵水溶液拌秸秆后再接种木霉菌；氨基酸拌+木霉：先用氨基酸稀释液拌秸秆后再接种木霉菌。

生物样品保藏信息

SQR-T037，分类命名为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年9月22日，保藏地址为北京市朝阳区大屯，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCCNO.3308。

具体实施方式

以下实施例以哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SQR-T037为例举例说明本发明的技术方案，但并不因此限定本发明的保护范围。实际上，发明人按照本发明方法，以多种自行分离及市售的木霉生防菌株进行固体发酵，均获得了与实施例1相似的效果，但鉴于专利公开充分的要求，以下仅以哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SQR-T037为例，说明本发明的木霉固体菌种发酵方法。

实施例1

一种木霉直接发酵作物秸秆制备木霉固体菌种的方法，向细度3mm的晒干玉米秸秆(含水率15％，含有机碳量为66％)中加入氨基酸稀释液，氨基酸稀释液的加入量为每100g晒干后的秸秆加入200ml氨基酸稀释液(相当于每100g晒干后的秸秆加入10ml氨基酸水解液)，调节起始pH为3.5，陈化12小时，然后接种10％哈次木霉SQR-T037液体菌种，此时堆体的含水量为60-70％，将堆体进行固体发酵，发酵室内温度为30±2℃，室内空气湿度65％±5％，发酵9天后获得木霉固体菌种，其中木霉菌的含量达到5.8×10⁹个/g，杂菌含量为5.1×10⁶个/g。

实施例2

在腐熟的猪粪堆肥中，添加按照本发明方法制备的1％的木霉固体菌种进行固体发酵，固体发酵过程中每天翻堆1～2次，使固体发酵温度不超过60℃，发酵6-7天后结束，获得木霉生物有机肥。分别在江苏南京和江苏南通两地进行了田间大白菜的生物效果试验，大田结果表明，在等养分输入情况下，在南京黄棕壤蔬菜地土壤上，木霉生物有机肥比化肥增产23.4％(见表5)、比氨基酸有机肥增产9.3％(见表5)；在南通的滨海轻盐渍化土壤上，木霉生物有机肥比化肥增产5.6％(见表6)、比氨基酸有机肥增产10.5％(见表6)。上述田间结果表明均木霉生物有机肥的增产作用比化肥还要显著，这为木霉生物有机肥的推广奠定了物质基础。

表5施用木霉生物有机肥对大白菜产量的影响(南京蔬菜所，南京横溪，2015)

CF：施用化肥

OF：施用氨基酸有机肥，与化肥处理等养分

BIO：施用木霉生物有机肥，与化肥处理等养分

表6施用木霉生物有机肥对大白菜产量的影响(南通海安，2015)

CK：空白，不施肥

CF：施用化肥

OF：施用氨基酸有机肥，与化肥处理等养分

BIO：施用木霉生物有机肥，与化肥处理等养分。