一种SiO2/GQDs–DNA–Au NPs纳米复合材料及其制备方法和应用

摘要

本发明属于纳米新材料领域，具体涉及一种SiO2/GQDs–DNA–Au？NPs纳米复合材料及其制备方法和应用。所述SiO2/GQDs–DNA–Au？NPs纳米复合材料中GQDs偶联在氨基化SiO2纳米球表面，并利用DNA两端的-NH2和-COOH使SiO2/GQDs和Au？NPs–DNA连接起来形成SiO2/GQDs–DNA–Au？NPs纳米复合材料。其中，GQDs具有稳定的光学性质，发光强度高，并且均匀分布在SiO2纳米球表面，提高了GQDs的化学生物修饰效率；SiO2球表面氨基化之后，将GQDs偶联在SiO2球表面，GQDs发光性能保持不变，SiO2/GQDs具有良好的生物相容性、合成简便、绿色无污染、表面易于修饰、发光稳定且容易分离，更有利于实际应用；并且SiO2/GQDs作为能量供体，DNA修饰的Au？NPs作为能量受体，使SiO2/GQDs–DNA–Au？NPs纳米复合材料可应用于生物体系。

说明书

技术领域

本发明属于纳米新材料领域，具体涉及一种SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料及其 制备方法和应用。

背景技术

纳米复合材料是使用两种及以上物理化学性质完全不同的物质进行耦合或者协同作用重 新组合得到的新用途的材料，它所变现的性质除具有本身各部分的性能外，还能表现出许多 新奇特性，突破了单一部分性能的局限性。纳米复合材料在新功能材料研发、生物医药、环 境保护与污染治理等方向都有显著地应用前景。

GQDs具有良好的生物相容性、优异的化学惰性、稳定的光学性质和较高的发光强度，在 生物医学工程、电子学、催化工程等方面一直被广泛应用。然而，由于GQDs的直径一般在1～ 2nm且溶解性好，与生物分子结合后不易分离，这限制了信号放大和检测灵敏度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种新型 SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料及其制备方法和应用。

本发明是采用以下技术方案实现的：

一种SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料，GQDs偶联在氨基化SiO₂纳米球表面， 并利用DNA两端的-NH₂和-COOH使SiO₂/GQDs和AuNPs–DNA连接起来形成 SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料。

所述GQDs的粒径为1～2nm，所述氨基化SiO₂纳米球的粒径为80nm～1.2μm，所述 AuNPs的粒径为10～30nm，所述DNA的序列为 5'-HS-(CH₂)₆-ATGCTATAATATTAAT-(CH₂)₆-NH₂-3'。

一种所述SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料的制备方法，包括如下步骤：

S01：将SiO₂纳米球分散到GQDs溶液中，搅拌反应；其中，所述SiO₂纳米球表面经氨 基化处理，所述GQDs溶液用EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N- 羟基丁二酰亚胺)活化；

S02：将80～100μLDNA慢慢加入1～2mLAuNPs中，4℃～8℃陈化15～20小时后， 每隔7～9小时加入PB缓冲液和NaCl溶液进行老化，直至磷酸盐终浓度为10～20mM，NaCl 终浓度为0.2～0.4M，所得溶液经离心分离后，用缓冲液清洗底部红色沉淀，然后将标记好 的AuNPs–DNA重新分散于PBS缓冲液中，保存备用；

S03：将步骤S01所得SiO₂/GQDs和步骤S02所得AuNPs–DNA复合材料室温下培养2～ 3小时后离心，得SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料。

步骤S01中，采用超声使100～120mg氨基化SiO₂纳米球和20～24mL浓度为1～4 mg/mL活化的GQDs溶液形成均匀分散液，在低速搅拌下室温避光反应20～25小时。

步骤S02中，所述DNA的浓度是10μM，所述NaCl溶液的初始浓度是2M，所述PB 缓冲液是0.1MNa₂HPO₄-KH₂PO₄，pH8.0，所述PBS缓冲液是含0.2MNaCl的10mM Na₂HPO₄-KH₂PO₄，pH7.4。

步骤S03中，所述SiO₂/GQDs纳米材料为80～120μL，所述AuNPs–DNA复合材料的 体积为80～100μL。

一种所述的SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料在荧光生物传感器上的应用。

所述荧光生物传感器用于灵敏检测BLM，即利用BLM·Fe(II)剪切DNA特定位点，使得 AuNPs远离SiO₂/GQDs，能量共振转移减弱，对体系的荧光信号变化进行测定。

本发明基于荧光能量共振转移(FRET)原理设计了一种新型荧光生物传感器用于灵敏检 测BLM(博来霉素)。其中，SiO₂/GQDs作为能量供体，DNA修饰的AuNPs作为能量受体。 当体系中不存在BLM·Fe(II)时，由于DNA的连接作用，使得SiO₂/GQDs和AuNPs–DNA相 互靠近，满足能量共振转移的条件，在SiO₂/GQDs的激发波长下激发，SiO₂/GQDs发射的荧 光被AuNPs吸收，显示为荧光猝灭。当加入BLM·Fe(II)时，BLM·Fe(II)和氧形成的加合物 BLM·Fe(III)OOH表现出断裂DNA的活性。BLM·Fe(II)剪切DNA特定位点，使得AuNPs 远离SiO₂/GQDs，能量共振转移消失，对SiO₂/GQDs的荧光信号变化进行测定。随着BLM·Fe (II)加入量的增加，AuNPs远离SiO₂/GQDs的量也随之增加。不同浓度BLM·Fe(II)所对应的 荧光信号也会随之发生变化。

与现有技术相比，本发明提供的SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs复合材料中，GQDs具有稳定 的光学性质，发光强度高，并且均匀分布在SiO₂纳米球表面，提高了GQDs的化学生物修饰 效率；SiO₂球表面氨基化之后，将GQDs偶联在SiO₂球表面，GQDs发光性能保持不变， SiO₂/GQDs具有良好的生物相容性、合成简便、绿色无污染、表面易于修饰、发光稳定且容 易分离，更有利于实际应用；并且SiO₂/GQDs作为能量供体，DNA修饰的AuNPs作为能量 受体，使SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料可应用于生物体系，该检测线性范围为0.5～ 1000nM，检测下限达0.2nM，相关系数为0.979。

附图说明

图1是本发明所述SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料制备及应用过程的示意图，其 中箭头所示位置为切割位点；

图2是本发明实施例1所制得材料的透射电镜图：(A)AuNPs；(B)GQDs；(C)SiO₂/GQDs； (D)SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料；(E)SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料加 入BLM后；

图3是本发明实施例1所得材料的荧光曲线图：(a)SiO₂纳米球；(b)SiO₂/GQDs纳米材 料；(c)SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料；(d)SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料 加入BLM后体系的响应曲线；

图4是本发明制备的不同GQDs溶液浓度与不同粒径SiO₂纳米球偶联合成的SiO₂/GQDs 纳米材料相应荧光变化值；

图5是本发明实施例1的AuNPs–DNA对SiO₂/GQDs信号猝灭随AuNPs–DNA体积变 化的荧光强度变化曲线；

图6A、6B是本发明实施例1的SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料制备的荧光传感 器对不同浓度BLM的荧光响应曲线；

图7是本发明制备的荧光传感器的选择性对照。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发 明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。

实施例1

将4mLTEOS加入3.3mL氨水和47mL无水乙醇的混合体系中，室温搅拌24小时，再 加入300μLAPTES，剧烈搅拌至少10小时，离心并用乙醇与去离子水洗涤多次，获得所述 氨基化80nmSiO₂纳米球。

20mL2mg/mL的GQDs溶液用EDC(50mM)和NHS(10mM)活化，称取100mg直径为 80nm的氨基化SiO₂纳米球分散到GQDs溶液中，GQDs溶液超声5分钟使其形成均匀分散 液，在低速搅拌下室温避光反应24小时，GQDs可在氨基与羧基偶联作用下形成SiO₂/GQDs 纳米材料。

将100μL10μMDNA慢慢加入1mL新制备的直径为15nm的AuNPs中。4℃陈化16 小时后，每隔8小时加入0.1M的PB(pH8.0)缓冲液和2M的NaCl溶液进行老化，直至 磷酸盐终浓度为10mM，NaCl终浓度为0.3M。所得溶液于12000rpm转速下离心20分钟， 小心除去上清液，底部红色沉淀用缓冲液清洗两次以移去未键合的DNA。最后将标记好的 AuNPs–DNA重新分散于0.2MPBS缓冲液中，置于4℃保存备用。其中，0.2MPBS缓冲液 为含0.2MNaCl的10mMNa₂HPO₄-KH₂PO₄，pH7.4；0.1MPB缓冲液为0.1M Na₂HPO₄-KH₂PO₄，pH8.0。

将上述制得的100μLSiO₂/GQDs和80μLAuNPs–DNA复合材料室温下培养2小时，所 得溶液于8000rpm转速下离心15分钟，小心除去上清液以移去未键合的AuNPs–DNA，底 部沉淀用缓冲液分散后得到SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料。将50μL不同浓度的 BLM·Fe(II)加入SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs体系中，记录荧光强度的变化。

实施例2

9mL28％氨水、16.25mL无水乙醇与24.75mL水混合均匀，4.5mLTEOS与45.5mL的 无水乙醇混合均匀，将上述两种混合溶液充分混合快速搅拌，1分钟之后转速降低到360rpm， 室温下搅拌2小时，再加入300μLAPTES，剧烈搅拌至少10小时，离心并用乙醇与去离子 水洗涤多次，获得所述氨基化360nmSiO₂纳米球。

20mL4mg/mL的GQDs溶液用EDC(50mM)和NHS(10mM)活化，称取100mg粒径为 360nm的氨基化SiO₂纳米球分散到GQDs溶液中，GQDs溶液超声5分钟使其形成均匀分散 液，在低速搅拌下室温避光反应24小时，GQDs可在氨基与羧基偶联作用下形成SiO₂/GQDs 纳米材料。

将100μL10μMDNA慢慢加入1mL新制备的粒径为15nm的AuNPs中。4℃陈化16 小时后，每隔8小时加入0.1M的PB(pH8.0)缓冲液和2M的NaCl溶液进行老化，直至 磷酸盐终浓度为10mM，NaCl终浓度为0.3M。所得溶液于12000rpm转速下离心20分钟， 小心除去上清液，底部红色沉淀用缓冲液清洗两次以移去未键合的DNA。最后将标记好的 AuNPs–DNA重新分散于0.2MPBS缓冲液中，置于4℃保存备用。其中0.2MPBS缓冲液为 含0.2MNaCl的10mMNa₂HPO₄-KH₂PO₄，pH7.4；0.1MPB缓冲液为Na₂HPO₄-KH₂PO₄， pH8.0。

将上述制得的100μLSiO₂/GQDs和100μLAuNPs–DNA复合材料室温下培养2小时， 所得溶液于4000rpm转速下离心10分钟，小心除去上清液以移去未键合的AuNPs–DNA， 底部沉淀用缓冲液分散后得到SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料。将50μL不同浓度的 BLM·Fe(II)加入SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs体系中，记录荧光强度的变化。

由图2A可以看出，AuNPs本身为球形，粒径约为15nm；由图2B可以看出，GQDs粒 径约为1～2nm；由图2C可以看出，GQDs偶联在氨基化80nmSiO₂纳米球表面，形成 SiO₂/GQDs纳米材料；由图2D可以看出，SiO₂/GQDs纳米材料分散到AuNPs–DNA溶液中， 室温下培养2小时，得到SiO₂/GQDs–DNA–AuNPs纳米复合材料；由图2E可以看出，体系 中加入BLM后，AuNPs数量明显减少。

由图4可以看出，GQDs溶液浓度为2mg/mL，SiO₂纳米球粒径位80nm时，SiO₂/GQDs 纳米材料的荧光变化值最优。

由图5可以看出，随着AuNPs–DNA加入体积的增大，AuNPs对SiO₂/GQDs纳米材料的猝 灭效率增强，当体积达到70μL时，猝灭效率达到最优。

图6A中荧光曲线对应的浓度是0，0.5，0.8，1，2，4，15，30，50，100，300，500， 800，1000，3000，5000，8000，10000nM。图6B显示荧光值随着BLM的浓度升高而增大， 由图可知，该实施例展现的检测有良好的线性范围，线性结果y＝212.78+0.72C_{[BLM·Fe(II)]}(nM)， R²＝0.973，最低检测下限为0.2nM。

图7是本发明制备的荧光生物传感器的选择性对照，为了证明本发明实施例设计的荧光 传感器对BLM的选择性，设计了2种对照组，1μM的BLM和10μM的干扰物质下分别存 在和混合存在的情况下测定BLM的荧光值变化。结果表明，体系只有在BLM存在下才会升 高，其他各种干扰物质不会影响荧光值的变化，从而证明本发明对BLM的选择性。

为了评估荧光传感器的临床应用潜能，在人血清中对BLM进行了检测，不同浓度的BLM 加入到人血清样本中，运用所述荧光传感器检测，该传感器测得的样品回收率为91.7％～ 99.44％，结果令人满意。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。