一种基于代谢组学鉴别霍山米斛与霍山铁皮石斛品种的方法

摘要

本发明公开了一种基于代谢组学鉴别霍山米斛与霍山铁皮石斛品种的方法，具体步骤包括：(1)石斛样品的采集；(2)石斛代谢组学样品的制备；(3)石斛样品代谢产物的检测；(4)代谢组学数据的处理与分析。本发明的优点在于：采用代谢组学方法获得石斛大量的内源性代谢物信息，并从中筛选出鉴别霍山米斛与霍山铁皮石斛的特征性代谢产物，进而从整体上区别这两种石斛品种，技术方法先进、实验结果可靠，为石斛的品种鉴定和质量评价提供了一种优良方法。

说明书

技术领域

本发明涉及中药材分析检测领域，具体地说涉及一种基于代谢组学鉴别霍山米斛与霍山 铁皮石斛品种的方法。

背景技术

石斛是一种常用的名贵中药材，具有滋阴清热、益胃生津、清音明目、消炎止痛等功效。 石斛属植物化学成分复杂，含有多糖、生物碱、菲类、联苄类、氨基酸以及其他一些药用活 性成分。但由于石斛属种类丰富、形态相似度高，导致市场石斛来源复杂，以次充好、以假 乱真现象常有发生，对石斛的临床疗效和用药安全造成严重影响。

经典中药石斛的鉴别方法有基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别等。这些鉴定特 征基本上为生物体的遗传性表现型，受到遗传、环境条件、加工炮制等因素的影响，具有很 大的变异性和随意性，难免存在一定的主观性和经验依赖性，给鉴定结果的可靠性带来一定 的影响。因此，急需一种快速、有效的分析方法，用于石斛品种的鉴别及质量评价。

代谢组学是20世纪90年代中期发展起来的一门新的学科，是系统生物学的一部分，可 对某一生物或细胞在某一特定生理时期内所有低分子量代谢产物进行定性和定量研究。代谢 组学研究能够检测到主要的活性物质以及一些中间代谢产物的变化，不仅反映植物基因型的 差异，而且反映了环境因素的作用。由此可见，可以利用代谢组学技术来进行石斛品种的鉴 别及质量评价。

目前基于代谢组学法方法来鉴定不同石斛品种的研究未见报道，尤其是基于GC-MS技 术鉴定不同石斛品种的代谢组学研究方法更是闻所未闻。

发明内容

为了解决上述背景技术提出的技术问题，本发明旨在提供一种基于代谢组学鉴别霍山米 斛与霍山铁皮石斛品种的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于代谢组学鉴别霍山米斛与霍山铁皮石斛品种的方法，包括以下步骤：

(1)石斛样品的采集；

(2)石斛代谢组学样品的制备；

(3)石斛样品代谢产物的检测；

(4)代谢组学数据的处理与分析。

作为一种优选方案，本发明所述的步骤(1)石斛样品的采集包括霍山米斛和霍山铁皮 石斛样品的采集，所述样品液氮速冻后放-70℃超低温下保存。

作为本发明实施例的一种优化方案，所述的步骤(2)的过程包括石斛样品代谢物的提 取及衍生化，具体步骤如下：

a)石斛样品代谢物的提取：采用液氮研磨的方法将石斛样品磨至粉末状，每种石斛样 品取六次重复。然后称取100～150mg石斛样品置于10mL离心管中，加入1.5mL预冷至-20℃ 的甲醇，涡旋震荡1min后，加入60μL的核糖醇(0.2mg/mL，用甲醇溶解)作为甲醇/水相 的内标，再涡旋震荡30s，然后用石腊膜封住离心管口，于40～45℃条件下超声处理30min， 8000rpm/min离心15～20min，取1mL上层溶液置于1.5mL离心管中，得到石斛样品代谢物 的甲醇/水相提取溶液。

b)石斛样品代谢物的衍生化：用氮气吹干石斛样品代谢物的甲醇/水相提取溶液，加入 60μL盐酸羟胺吡啶溶液(20mg/mL，盐酸羟胺溶于吡啶中)，涡旋震荡30s后40℃温浴 120min。随后加入60μLBSTFA(含体积分数1％TMCS)，密封后置37℃下反应120min，即 得所述石斛代谢组学样品。

本发明所述的步骤(3)的具体检测条件为：

色谱条件：DB-5石英毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)；进样体积为1μL；分流进样， 分流比为20：1；进样口温度280℃；载气为氦气，流速1mL/min；程序升温：初始温度为 100℃，保持2min，以4℃/min升温到260℃，保持1min，再以20℃/min升温到280℃， 保持3min；

质谱条件：接口温度和离子源温度均为250℃；电子轰击离子源(EI)；全扫描方式， 电子能量70eV，质量检测范围m/z40-600。

本发明所述的步骤(4)的具体过程为：

将获得的霍山米斛与霍山铁皮石斛GC-MS原始数据用AgilentMSD工作站打开，并转 换成CDF格式文件，然后导入R2.7.2软件加载XCMS程序包进行数据的预处理(包括保留 时间的校准、滤躁和峰匹配)，获得物质的保留时间和峰面积数据文件。用内标物质进行数 据的归一化处理，归一化处理后数据导入simca-p11.5软件进行多元统计学分析，选取PCA 和OPLS-DA模型进行主成分分析以及差异性代谢物筛选(VIP>1且p<0.05)。对所获得的 差异性代谢物利用NIST11数据库进行鉴定，即获得用于鉴定霍山米斛和霍山铁皮石斛的特 征性代谢产物。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

(1)本发明首次采用代谢组学方法来鉴别石斛品种，尤其是基于GC-MS技术平台。同 时，对石斛代谢组学样品的制备方法进行了优化，能够最大限度地检测石斛大量内源性代谢 产物，避免了传统分析手段的片面性，提高了结果的准确性，为石斛品种的鉴别提供了新方 法。

(2)本发明将获得的霍山石斛与霍山铁皮石斛GC-MS原始数据与多元统计学方法相结合，获得用于 鉴别这两种石斛品种的特征性代谢产物，为石斛品种的鉴定及质量控制提供了科学依据。

附图说明

图1是实施例1中一年生霍山米斛和霍山铁皮石斛PCA得分图(A)和载荷图(B)， 其中(Fe)表示霍山铁皮石斛，(M)表示霍山米斛。

图2是实施例1中一年生霍山米斛和铁皮石斛OPLS-DA得分图(A)和载荷图(B)， 其中(Fe)表示霍山铁皮石斛，(M)表示霍山米斛。

图3是实施例2中第一组试验得到的TIC谱图。

图4是实施例2中第二组试验得到的TIC谱图。

图5是实施例2中第三组试验得到的TIC谱图。

图6是实施例2中第四组试验得到的TIC谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：

本部分对本发明实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本 发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描 述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料、设备和操作方法 是本领域公知的。

实施例1

一种基于代谢组学鉴别霍山米斛与霍山铁皮石斛品种的方法，包括以下步骤：

1.仪器与试药

1.1仪器：Agilent7890A-5975C气相-色谱质谱仪。

1.2试药：霍山米斛和霍山铁皮石斛栽培苗由安徽农业大学生命科学学院提供，甲醇、吡啶 为色谱级，其他试剂为分析纯。

2.石斛代谢组学样品的制备：

2.1石斛样品代谢物的提取

取一年生霍山米斛和霍山铁皮石斛栽培苗叶作为实验材料，用液氮研磨的方法将其磨至 粉末状，每种石斛样品取六次重复。然后称取100～150mg石斛样品置于10mL离心管中， 加入1.5mL预冷至-20℃的甲醇，涡旋震荡1min后，加入60μL的核糖醇(核糖醇浓度0.2 mg/mL，用甲醇溶解)作为甲醇/水相的内标，再涡旋震荡30s，然后用石腊膜封住离心管口， 于40～45℃条件下超声处理30min，8000rpm/min离心15～20min，取1mL上层溶液置于1.5mL 离心管中，得到石斛样品代谢物的甲醇/水相提取溶液。

2.2石斛样品代谢物的衍生化

用氮气吹干石斛样品代谢物的甲醇/水相提取溶液，加入60μL盐酸羟胺吡啶溶液(盐酸 羟胺溶于吡啶中，盐酸羟胺浓度20mg/mL)，涡旋震荡30s后40℃温浴120min。随后加入 60μLBSTFA(含体积分数1％TMCS)，密封后置37℃下反应120min，即得所述石斛代谢组 学样品。

3.石斛样品代谢产物的检测

色谱条件：DB-5石英毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)；进样体积为1μL；分流进样， 分流比为20：1；进样口温度280℃；载气为氦气，流速1mL/min；程序升温：初始温度为 100℃，保持2min，以4℃/min升温到260℃，保持1min，再以20℃/min升温到280℃， 保持3min；

质谱条件：接口温度和离子源温度均为250℃；电子轰击离子源(EI)；全扫描方式， 电子能量70eV，质量检测范围m/z40-600。

4.代谢组学数据的处理与分析

将步骤3获得的GC-MS原始数据用AgilentMSD工作站打开，并转换成CDF格式文件， 然后导入R2.7.2软件加载XCMS程序包进行数据的预处理(包括保留时间的校准、滤躁和 峰匹配)，获得物质的保留时间和峰面积数据文件。用内标物质进行数据的归一化处理，归 一化处理后数据导入simca-p11.5软件进行多元统计学分析，选取PCA和OPLS-DA模型进 行主成分分析以及差异性代谢物筛选(VIP>1且p<0.05)。对所获得的差异性代谢物利用 NIST11数据库进行鉴定，即获得用于鉴定霍山米斛和霍山铁皮石斛的特征性代谢产物。由 PCA和OPLS-DA得分图(图1A和图2A)可知，在第一和第二主成分的分值图上，霍山米 斛和霍山铁皮石斛呈现较明显的分离趋势，说明这两种石斛在代谢成分上存在明显的差异， 可以利用代谢组学技术区分不同石斛品种。进一步运用PCA和OPLS-DA载荷图(图1B和 图2B)，筛选出VIP>1组分(表1)并结合统计学t检验，其中有统计学差异(p<0.05)的 6种物质为：蔗糖、D-(+)-甘露糖、D-(-)-果糖、1-环己烯-1-羧酸、D-(+)-葡萄糖和L-苏糖酸， 即可作为鉴定霍山米斛和霍山铁皮石斛的特征性代谢产物。

当然本发明步骤4仅提供一种代谢组学数据的处理与分析方法，本领域技术人员也可以 通过其它现有公知方法获得霍山米斛和霍山铁皮石斛的特征性代谢产物。

表1霍山米斛和霍山铁皮石斛一年生叶的甲醇水相VIP组分

实施例2

不同衍生化反应条件对石斛代谢组学检测的影响试验

1.仪器与试药

1.1仪器：Agilent7890A-5975C气相-色谱质谱仪。

1.2试药：霍山铁皮石斛栽培苗由安徽农业大学生命科学学院提供，甲醇、吡啶为色谱级， 其他试剂为分析纯。

2.不同衍生化反应条件对石斛代谢组学检测的影响

试验分为四组，四组采用的均是根据与实施例1相近的方法制得霍山铁皮石斛一年生叶 甲醇/水相代谢组学样品，该四组试验用的方法与实施例1的不同点仅在于衍生化反应条件 的差异，本实施例四组试验的衍生化反应条件如下表2所示。

表2四组试验的衍生化反应条件

表2中的肟化试剂为盐酸羟胺吡啶溶液(盐酸羟胺溶于吡啶中，盐酸羟胺浓度 20mg/mL)；硅烷化试剂为BSTFA(含体积分数1％TMCS)；

本实施例对四组试验均采用与实施例1相同的GC-MS检测方法对石斛代谢组学样品进 行检测。

结果参见图3至图6，由检测所得的TIC谱图可以看出，不同的衍生化反应条件对霍山 铁皮石斛代谢物的检测效果影响较大，其中第一组到第四组获得的代谢物峰的个数分别为 153、156、248、481个，结果表明，选用第四组的衍生化反应条件，能够使更多的代谢物 被检测出来，尽可能整体全面进行代谢组学分析。