与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记AAD及其应用

摘要

本发明涉及分子育种领域，具体涉及与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记AAD及其应用。所述番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记的物理位置为番茄2号染色体上第45339693碱基到第45343097碱基本发明可以替代传统的通过选择绿色植株以确保番茄育种材料含有花青素缺乏(aa)突变位点的方法。通过分子标记辅助选择表型正常育种材料中的aa位点杂合植株，可以缩短育种周期、提高育种效率。

说明书

技术领域

本发明涉及分子育种领域，具体涉及与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺 失分子标记AAD及其应用。

背景技术

番茄是中国乃至世界上最重要的蔬菜之一。番茄的杂种优势表现比较明显，目 前种植的品种多为杂交种。然而，目前番茄杂交种制种多采用人工去雄、授粉，比 较费时、费工，制种成本高；而且可能因为去雄不及时或不彻底，影响杂交种纯度。 另外，杂交种纯度检测不论是采用传统的表型鉴定方法，还是采用分子标记检测方 法，都比较费时、费钱。

番茄花青素缺乏突变体(anthocyaninabsent,aa)植株各个部位表面由于缺乏花 青素而呈现为绿色，而正常番茄植株表面由于积累花青素而呈现不同程度的紫色。 番茄花青素缺乏突变体是一个核基因隐性突变体，在种子发芽露出子叶后就可以观 察表型。因此，利用含aa突变位点的番茄亲本作为母本配制杂交种，在杂交种幼苗 阶段统计不同颜色(绿色或紫色)的幼苗数量，就可以检测杂交种纯度。检测成本 低，效率高。

番茄花青素缺乏突变位点aa还与雄性不育突变位点ms-10(malesterile10)紧 密连锁。含有ms-10的番茄材料几乎100％不育，柱头外露，可以不需要人工去雄而 直接授粉，大大降低了制种人工成本。然而，ms-10是一个核基因隐性突变位点。制 种时，作为母本的不育株需要通过杂合单株自交或者杂合单株与不育株测交来获得。 后代中，理论上只有25％或50％的植株为不育株。当作为杂交制种母本的番茄材料 同时含有aa和ms-10时，利用上述方法繁殖不育株，在后代中选择绿色小苗(含aa) 定植，可保证90％的植株为不育株。因此，通常ms-10与aa同时应用于杂种优势育 种。

aa是一个隐性突变位点，当该位点处于杂合状态时，其植株颜色与正常植株(野 生型)相同，无法区别于正常纯合植株。因此，将aa导入到优良番茄亲本中、或者 选育含有aa的优良番茄育种材料，如果采用传统的通过表型选育的方法，周期长、 效率低。分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，可 以缩短育种周期、提高育种效率。

发明内容

本发明的目的是提供与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记。

本发明的再一目的是提供上述与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子 标记的应用。

根据本法的番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记，其物理位置为 番茄2号染色体上第45339693碱基到第45343097碱基(SL2.50版本)，该片段缺失 导致的表型为番茄花青素缺乏。

根据本发明的具体实施方式，首先通过精细定位将番茄花青素缺乏突变位点 (aa)定位到96.3kb范围内。在这96.3kb范围内，发现番茄花青素缺乏突变体中 存在一个3.4kb的缺失。该缺失片段编码一个参与花青素运输的谷胱甘肽转移酶 (GlutathioneS-transferase,GST)。

本发明还提供了一套可以检测番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标 记的AAD特异性引物。正向引物(AAD-F)为5-GGGACAAAATACAACGACGAC-3， 反向引物1(AAD-R1)为5-GCTGATGTTGATGTGAAGGAA-3，反向引物2 (AAD-R2)为5-TAAAAGGGCTAGTGACTTGGTGT-3。

根据本发明的具体实施方式，还提供一种鉴定番茄花青素缺乏性状的方法，包 括以下步骤：

1)提取待测番茄的基因组DNA。采用常规的CTAB法提取基因组DNA。

2)PCR扩增。以待检测的番茄基因组DNA为模板，利用用于检测InDel标记 AAD的3条特异性引物进行PCR扩增。①PCR体系(20μl)：50-100ng/μlDNA模 板1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，2.5mMdNTPs0.8μl，10μM引物(3条)各0.3 μl，2.5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，ddH₂O15.1μl。②PCR扩增程序为：94℃预 变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min。

3)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶浓度为1.5％。含有番茄花 青素缺乏(aa)纯合突变位点的植株可以检测到一条363bp的条带；aa位点为正常 纯合(野生型)的植株可以检测到一条487bp的条带；aa位点为杂合状态的植株可 以同时检测到上述2条条带。

本发明可以替代传统的通过选择绿色植株以确保番茄育种材料含有花青素缺乏 (aa)突变位点的方法。通过分子标记辅助选择表型正常育种材料中的aa位点杂合 植株，可以缩短育种周期、提高育种效率。

附图说明

图1为番茄花青素缺乏基因AA的精细定位。a基因AA的初步定位；b基因AA 的精细定位；c基因AA定位区域中基因编码情况。

图2为番茄花青素缺乏(aa)突变体中的DNA片段缺失(deletion)示意图。

图3为分子标记AAD检测aa突变体，野生型及其杂交后代的琼脂糖凝胶电泳 图。M为100bpDNAmarker，1为aa突变体，2，为野生型，3为F₁，4–15为F₂植株。

图4为分子标记AAD检测aa突变体和表型正常番茄育种材料的琼脂糖凝胶电 泳图。M为100bpDNAmarker，LA3132为aa突变体，从152-1192到YellowPear 为表型正常的樱桃番茄(Solanumlycopersicumvarcerasiforme)，从AilsaCraig到 ZhongshuNo.4为表型正常的普通栽培番茄(S.lycopersicum)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步阐明说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 若未特别指出，实施方式均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1番茄花青素缺乏基因位点InDelAAD的确定

以含有花青素缺乏突变位点aa的番茄材料为母本，植株表面呈紫色的醋栗番茄 材料为父本，两者杂交获得F₁。F1单株自交，其种子繁殖成F₂代分离群体近6000 株，常规水肥管理。观测幼苗下胚轴的颜色(紫色或绿色)，共挑出下胚轴呈绿色的 含花青素缺乏纯合突变位点的植株。对母本、父本、F1、和F2群体中下胚轴呈绿色 的幼苗，分单株采用常规的CTAB法提取基因组DNA。

比对番茄国际基因组计划测序的番茄品种Heinz1706序列和醋栗番茄LA1589序 列，开发与番茄花青素缺乏突变体aa位点连锁的分子标记。根据前期番茄花青素缺 乏突变体aa位点遗传定位所在的染色体区域范围，有间隔的比对Heinz1706和 LA1589的序列，找出所含InDel的位置及其侧翼序列，设计引物。分别扩增父本、 母本及其F1的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测，发现了10个具有多态性的InDel 分子标记。利用上述10个InDel分子标记，分别对F₂群体中挑选的下胚轴呈绿色的 植株进行分子检测。统计结果表明番茄花青素缺乏突变体AA基因位于分子标记 HP523和HP527之间，物理区段为番茄2号染色体上第45272582碱基到第45368897 碱基(SL2.50版本)，物理距离约96.3kb。物理位置为番茄2号染色体上第45320525 碱基(SL2.50版本)的分子标记AAM1与AA基因共分离(图1)。

进一步确定上述96.3kb内的Solyc02g081340编码一个谷胱甘肽转移酶 (GlutathioneS-transferase,GST)，是番茄花青素缺乏基因AA。

基于番茄花青素缺乏基因AA优化引物设计，利用正向引物 5-GAATAAGGGGACAAAATACAACGACGAC-3，和反向引物 5-GGAGTAGTTTACAGCCACAGAGGTT-3，对含有aa位点的番茄母本材料进行PCR 扩增，PCR扩增得到单一条带。测序后得到一段877bp的序列(序列如下)。将该 序列与番茄参考基因组Heinz1706的序列比对，发现在番茄2号染色体上第45339693 碱基到第45343097碱基(SL2.50版本)位置处存在一个约3.4kb的DNA片段缺失 (Deletion)(图2)，此DNA片段缺失被命名为AAD(AADeletion)。

GAATAAGGGGACAAAATACAACGACGACAAAGTAGCTTACTACATGGGAGGCACTGATACAGCCAAATTTTT TATTACAAGAATTTAAAAATATAAATACACAAACAAATAAACAACAATTTTTTACTTAAAAAAATATATATA AAAAAAATATTAATTTTTTAAGTACCCTTTCATGATACCCATCTGGATGAATCACTCCCATATCCCCTGTGA AAAACCAACCATTCTTGAATACTTCTGAATTTGCTTTTTCATTTTTTAAGTACCCTTTCATGATACTGCTTC CCCTCAGGCATATTTCCCCTGCTGTTTTCCCATCACGAGGCACACTTTCCATATTCTTGAATTCCTTCACAT CAACATCAGCAAGTGTTAGTATGCCCAGCCCTTGTCTTGCCTTTAACCTGGCTTGTTCTTCCCTTGGTAATT TGTTCCAATTGGCTTGAAACTCGCATATCAGGGCTGGTCCAGTGGCCTCCGTGAGCCCATAGGCGTGGACCA CGCGGAACCCCACCCTTTCGATTTTTTCGAGTAGTGGTGCTGGTGGGGGTGCACCCCCTACAAGAACTTGTA CTGGGGTCGTTATTCGGCGCTGCTCGTGTGGCTTGGCCTCAAGGATTATGCTGAGAACTATTGGTGCAGCAC ACATATGCGTTACTTTGTGTAACGCTATGTTGGAGTAGATTTCTTGGGCTGTTGTATTGCGGATACAAATAT TTGTGCCACCCCTTGCAGCTATTCCCCATGTGAAAGTCCAACCATTGCAGTGAAACATTGAGAGGGACCATA AGTAGACAGGCTCAGTACCCATCTCCCATCCCAAAATCAAACTCGAAGTGCTCAAAAAAGCACCTCTGTGGC TGTAAACTACTCC

实施例2InDel分子标记AAD的开发与验证

InDel分子标记AAD的引物设计

根据AAD及其侧翼序列，设计了3条引物。正向引物(AAD-F)为 5-GGGACAAAATACAACGACGAC-3，反向引物1(AAD-R1)为 5-GCTGATGTTGATGTGAAGGAA-3，反向引物2(AAD-R2)为 5-TAAAAGGGCTAGTGACTTGGTGT-3。

InDel分子标记AAD的多态性检测

PCR扩增。

以母本、父本及其F₁的基因组DNA为模板，利用用于检测InDel标记AAD的 3条特异性引物进行PCR扩增。含有番茄花青素缺乏(aa)纯合突变位点的母本植 株可以检测到一条363bp的条带；aa位点为正常纯合(野生型)的父本植株可以检 测到一条487bp的条带；aa位点为杂合状态的F₁植株可以同时检测到上述2条条带 (图3)。

InDel分子标记AAD的F₂群体验证

利用InDel分子标记AAD对F₂群体中下胚轴呈绿色的植株进行分子检测。发现 都只扩增出一条363bp的条带，表明InDel分子标记AAD与aa突变等位基因共分 离。从F2群体中挑选一些下胚轴呈紫色的植株用InDel分子标记AAD进行分子检 测，约1/3的植株只扩增出一条487bp的条带，其余的植株可以同时检测到上述2 条条带(图3)。

InDel分子标记AAD的广适性验证

利用InDel分子标记AAD对含有番茄花青素缺乏(aa)突变位点的材料、8份 下胚轴呈紫色的樱桃番茄品种或育种材料、8份下胚轴呈紫色的普通栽培番茄品种或 育种材料进行分子检测。发现含有番茄花青素缺乏(aa)突变位点的材料只扩增出 一条363bp的条带，其它的番茄材料只扩增出一条487bp的条带，PCR扩增条带的 大小与表型一致。上述结果表明，当将aa突变等位基因导入到表型正常的番茄育种 材料时，AAD可以作为分子标记辅助选择工具。