一种基于SMAD7基因的猪活体背膘厚标记辅助选择方法

摘要

本发明公开了一种基于SMAD7基因的猪活体背膘厚标记辅助选择方法。本发明的方法为如下：检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸是C还是T还是C和T。通过试验证明：本发明用SMAD7基因第四内含子的第244位单核苷酸多态性来鉴定猪活体背膘厚的方法与猪活体背膘厚实际测定结果一致，对选择优良猪种有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于SMAD7基因的猪活体背膘厚标记辅助选择方法，属于生物 技术领域。

背景技术

猪为六畜之首，养猪业在世界尤其是中国国民经济中占有重要地位。猪肉在诸多 肉类产品中的比重一直保持在三分之一左右，是人们比较喜爱的副食之一。人们的生 活不断改善，传统的养殖技术已经不能满足人们对猪肉的需求量。随着现代育种技术 的发展，猪的生产性能显著提高，猪的健康养殖和育肥就显得格外重要。然而猪活体 背膘厚不仅关系到种猪的选育、生猪的生长发育、死亡率，而且还直接影响后期育肥 效果。背膘厚度直接反应猪脂肪含量的高低，对于校正到同一个体重标准下的猪群， 背膘厚度数值越大，则瘦肉率越低，骨骼肌含量越少，效益越低。因此，如何有效的 降低猪活体校正背膘厚，是每个猪场经营者及育种学家追求的目标。

随着分子生物学的发展，分子标记辅助选择在猪育种中发挥越来越重要的作用， 大大加快了育种进程。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是育种 中运用较多的分子标记方法。

Smad(mothersagainstdecapentaplegic-likeprotein)家族存在于细胞质中，它最初 是在研究果蝇BMP配体突变的时候发现的。Smad作为TGF-β受体激酶的底物存在， Smad家族主要可以分为3类：抑制型(inhibitorySmads，I-Smads)、激活型 (receptor-regulatedSmads，R-Smads)、公共介导型(commonpatrnerSmads，Co-Smads)。 SMAD7(Smadfamilymember7)是Smad家族成员之一，属于抑制型在人当中定位 于染色体18q21，长度为3111bp。SMAD7蛋白是TGF-β(transforminggrowthfactor-β) 转化生长因子的抑制物，竞争性抑制R-Smads的磷酸化，从而发挥它对TGF-β的信号 通路的抑制作用。还有研究初步表明SMAD7可能与转录因子协作加强MyoD的功能 影响肌肉增殖分化。SMAD7主要是作为一个抑制因子调节TGF-β-SMAD2/3通路。 SMAD7通过直接结合在受体复合物的胞质尾区阻止SMAD2/3不被TGF-βI型受体 (ALK5)磷酸化，从而SMAD7发挥了抑制了SMAD2/3和SMAD4复合物的形成作 用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪活体背膘厚性状的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪活体背膘厚性状的方法是检测猪个体的基因型 是CC基因型还是TT基因型还是CT基因型，根据所述猪个体的基因型确定所述猪活 体背膘厚：TT基因型的猪个体的活体背膘厚高于CC基因型的猪个体或CT基因型的 猪个体；

所述CC基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为C的纯合 体；

所述CT基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为C和T的 杂合体；

所述TT基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体。

上述方法中，所述检测猪个体的基因型是CC基因型还是TT基因型还是CT基因 型为如下A)或B)：

A)直接测序猪个体的SMAD7基因；

B)测序含有SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸的PCR扩增产 物；

所述PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：

1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA 分子组成的引物对A；

2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对 B；

所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相 同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相 同功能的核苷酸。

本发明的另一个目的是提供检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱 氧核糖核苷酸的基因型的物质的新用途。

本发明提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸 的基因型的物质在鉴定猪活体背膘厚性状中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷 酸的基因型的物质在制备鉴定猪活体背膘厚性状的产品中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷 酸的基因型的物质在选育猪活体背膘厚度值小和/或瘦肉率高和/或骨骼肌含量高的种 猪中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷 酸的基因型的物质在制备选育选育猪活体背膘厚度值小和/或瘦肉率高和/或骨骼肌含 量高的种猪的产品中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷 酸的基因型的物质在猪育种中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷 酸的基因型的物质在制备猪育种的产品中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪活体背膘厚性状的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪活体背膘厚性状的产品为检测猪个体的SMAD7 基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质。

上述应用或产品中，所述检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧 核糖核苷酸的基因型的物质为如下1)或2)或3)或4)：

1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA 分子组成的引物对A；

2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对 B；

所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相 同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相 同功能的核苷酸；

3)含有1)所述引物对A或2)所述引物对B的PCR试剂；

4)含有1)所述引物对A或2)所述引物对B或3)所述PCR试剂的试剂盒。

本发明的最后一个目的是提供一种选育猪活体背膘厚度值小和/或瘦肉率高和/或 骨骼肌含量高的种猪的方法。

本发明提供的选育猪活体背膘厚度值小和/或瘦肉率高和/或骨骼肌含量高的种猪 的方法包括选择CC基因型或CT基因型的猪进行育种；

所述CC基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为C的纯合 体；

所述CT基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为C和T的 杂合体。

上述方法或应用或产品中，所述SMAD7基因第四内含子的序列如序列1所示。

上述方法或应用或产品中，所述SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷 酸也即为猪SMAD7基因(NC_010446.4)第28948位核苷酸。

本发明发现了猪SMAD7基因的第四内含子的C244T位点对猪活体背膘厚有显著 影响，并基于上述SNP位点提供了一种基于SMAD7基因的猪活体背膘厚标记辅助选 择方法。通过试验证明：本发明用SMAD7基因第四内含子的第244位单核苷酸多态 性来鉴定猪活体背膘厚的方法与猪活体背膘厚的实际测定结果一致，对选择优良猪种 有重要意义。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、一种鉴定猪活体背膘厚性状的方法

一、猪SMAD7基因的SNP位点的筛选

1、猪耳组织样品DNA的提取

分别采集来自河北种猪场的323头大白猪的血液样品，样品采集后，保存于75％ 酒精中，并于-20℃保存。采用苯酚-氯仿抽提法提取血液样品的基因组DNA，具体步 骤如下：

(1)耳组织样的准备：剪取大小适中的耳组织样，用生理盐水冲洗掉表面的杂质 和血污，放于1.5mL离心管中，用眼科剪剪碎，并向其中加入500μL的组织裂解液 (北京百泰科生物技术有限公司；产品编号：AU19011)；

(2)根据所剪取的耳组织样的大小，向离心管中加入15～25μL的蛋白酶K (SIGMA-ALDRICH；产品编号：SRE0005)；

(3)放于水浴摇床上，55℃消化过夜，确保耳组织样消化完全，得到消化彻底的 耳组织；

(4)将上述消化彻底的耳组织样于室温放置，加入等体积的Tris-饱和酚(江苏 宝莱生物科技有限公司)，翻覆颠倒混匀5min；

(5)14000rpm/min离心10min，离心管中会出现分层现象，上层为含有核酸的 水相，下层为含有其他杂质的有机相。

(6)利用微量移液器小心吸取上层含核酸的水相，放置于一个新的1.5mL离心 管中(为了避免吸起下层的有机相，最好用去除尖头的蓝枪头)，弃下层有机相；

(7)重复步骤(4)～(6)；

(8)向含有水相的离心管中加入等体积的饱和酚：氯仿＝1：1，反复颠倒混匀5min， 14000rpm/min离心10min，然后吸取上层液体，放于一个新的1.5mL离心管中；

(9)重复步骤(8)；

(10)向其中加入饱和酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1，翻覆颠倒混匀， 14000rpm/min离心10min；

(11)吸除上层液体，加入2倍体积的无水乙醇(事先放于-20℃冰箱内预冷)沉 淀DNA，此时会在离心管内出现丝状或絮状DNA沉淀；

(12)用黄色枪头小心的挑出丝状或絮状DNA沉淀，放于一个新的1.5mL的EP 管，向其中加入70％乙醇(-20℃预冷)500μL，洗涤DNA沉淀，温和颠倒30s，弃 70％乙醇；

(13)重复步骤(12)；

(14)将含有DNA沉淀的离心管放于室温环境中，干燥20～30min；

(15)加入60～80μL的TE缓冲液或双蒸水溶解DNA沉淀(勿剧烈振荡或离心)， 将其保存于-20℃冰箱内。

2、目的片段的扩增及测序

(1)PCR扩增

以步骤1获得的基因组DNA为模板，采用引物对F1和R1进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。引物对F1和R1扩增得到SMAD7基因第四内含子(序列1)，引物序 列如下：

F1：GTCATCGTAGCCCTTAGTAG(序列2)；

R1：GGTACCTTGGGTTACATGG(序列3)；

PCR扩增体系：10×LAPCRBuffer2μL，10mMdNTPMix1.6μL，上下游引物(10 pmol/L)各1μL，LATaqDNA聚合酶(5U/μL)，基因组DNA1μL，ddH₂O13.2μL。

PCR反应程序：94℃预变性，5min；94℃变性，30s，58℃退火，30s，72℃延 伸，30s，72℃延伸，10min。

(2)PCR产物的回收纯化

利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)，回收纯化PCR 产物，具体操作步骤按照该试剂盒所附带的说明书。

(3)连接反应

将上述纯化回收的PCR扩增产物与pMD18-T载体进行连接。连接反应体系为5 μL：PCR回收产物2μL、pMD18-T载体0.5μL、SolutionI2.5μL，4℃连接过夜， 得到连接产物。

(4)转化

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。具体操作步骤：从-80℃超低温冰箱 内取1支DH5α感受态细胞(100μL)，迅速放于冰上，使其融化；将连接产物(体积 5μL)加入感受态细胞中，用移液器轻轻反复吹打，使其混匀，放置于冰上，静置30 min；放置于42℃水浴中，热击90s，然后立即冰浴2～3min；向其中加入600μL的 液体LB培养基(不含氨苄青霉素)；放置于37℃恒温摇床中，以170～200r/min的转 速培养1h，使细菌复苏。

(5)阳性克隆鉴定

用移液器吸取50～100μL经过复苏的菌液，均匀涂布于含有氨苄青霉素的琼脂平 板上，待菌液完全被吸收后，放于37℃恒温培养箱内30min，使菌液完全被吸收，然 后将琼脂平板倒置放于恒温培养箱内，37℃培养过夜。

根据琼脂平板上的菌落生长情况，进行挑菌。向1.5mLEP管中加入1mL液体 LB培养基，同时向每个EP管中加入2μL的氨苄青霉素，然后用10μL枪头挑取琼脂 平板上的白色菌落(选择形状完整，呈圆点形的菌落)共20个，分别放于盛有1mL 液体培养基的1.5mLEP管中，放于37℃摇床内，以220r/min的转速扩大培养3～4h， 待EP管内出现浑浊现象或者白色丝状沉淀时，采用采用引物对F1和R1进行菌液PCR 鉴定。

PCR反应体系如下：10×LABuffer1μL，dNTPMix(2.5mM)0.8μL，上下游引 物(pmol/L)各0.5μL，LA聚合酶0.1μL，菌液0.5μL，ddH₂O6.6μL，总体系为 10μL。

PCR反应结束后，吸取1μLPCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝 胶成像仪拍照，初步确定阳性克隆。

(6)测序验证

将经过PCR扩增初步鉴定为阳性克隆的菌液送交上海英潍捷基有限公司进行测 序。

(7)SNP位点C244T的获得

根据上述多个测序结果，利用DNAman软件进行比对，得到差异位点：C244T 位点为猪SMAD7基因第四内含子(序列1)的第244位核苷酸，也即为猪SMAD7基 因(NC_010446.4)第28948位核苷酸。

在猪SMAD7基因第四内含子(序列1)的第244位的碱基均为C的个体，该个 体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合CC基因型；猪SMAD7基因第四内含 子(序列1)的第112位的碱基均为T的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基 因型命名为纯合TT基因型；猪SMAD7基因第四内含子(序列1)的第112位的碱基 均为C和T的个体，该个体为杂合型个体，将该个体的基因型命名为杂合CT基因型。

二、猪SMAD7基因的C244T位点与猪活体背膘厚的相关性分析

为确定猪SMAD7基因的C244T位点与猪活体背膘厚是否相关，以河北种猪场的 296头大白猪为实验材料，按照上述步骤一中的方法确定每个猪个体的基因型为CC 基因型、TT基因型还是CT基因型，并根据猪的基因型确定猪活体背膘厚：TT基因 型的猪个体的活体背膘厚高于CC基因型的猪个体或CT基因型的猪个体。

1、基因型

296头猪个体的基因型检测结果表明：91头猪的基因型为CC基因型，53头猪的 基因型为TT基因型，152头猪的基因型为CT基因型。猪SMAD7基因在检测猪群中 的基因型频率及等位基因频率结果如表3所示：由表3可以看出：CT基因型频率明显 高于CC基因型和TT基因型。

表3、猪SMAD7基因在检测猪群中的基因型频率及等位基因频率

2、猪基因型与猪活体背膘厚的关联性分析

利用SPSS20.0软件对C244T位点基因型和猪活体背膘厚进行统计分析，并做样 本间多重比较。

结果如表4所示：SNP(C244T)位点对猪活体背膘厚有显著影响，TT基因型的 猪活体背膘厚显著高于CC基因型和CT基因型。

表4、猪SMAD7基因的C244T位点与猪活体背膘厚的关联性分析

备注:表中用不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，数值用最小二乘均值±标准误。

综上所述，可以通过确定猪SMAD7基因第四内含子的C244T位点的核苷酸来确 定猪个体为CC基因型还是TT基因型还是CT基因型，从而辅助鉴定猪活体背膘厚： TT基因型的猪个体的活体背膘厚高于CC基因型的猪个体或CT基因型的猪个体。

CC基因型为猪SMAD7基因第四内含子的第244位的核苷酸为C的纯合体；

TT基因型为猪SMAD7基因第四内含子的第244位的核苷酸为T的纯合体；

CT基因型为猪SMAD7基因第四内含子的第244位的核苷酸为C和T的杂合体。

所述SMAD7基因第四内含子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。