猪THRSP基因5'侧翼区的SNPs、启动子效率及其与猪背膘厚之关联性研究

摘要

本研究旨在对猪THRSP基因5’调控区TP526序列进行分析研究，以鉴别THRSP基因调控区的功能及其与猪产脂能力之关联性。试验所用的试验猪为胴体脂肪较多的中国地方猪种（定远猪、绩溪黑猪和皖南花猪）和瘦肉型猪（长白猪、大白猪、杜洛克及其杂种），提取猪耳组织基因组，利用PCR技术克隆THRSP基因5’调控区TP526序列，利用测序、结构预测、SNP检测、荧光素酶双报告基因验证以及与猪背膘厚的关联分析等方法进行TP526序列功能研究，结果表明：
　　 1．TP526序列长度484bp，与人和鼠相应序列的同源性分别为65.6％和58.9％，存在1个50bp大小的启动子序列；序列在20～24bp、42～51bp和447～450bp之间的平均弯曲指数分别为81.04±5.25、77.37±4.87和69.00±4.59，显示这些区域DNA弯曲可能具有功能上的特异性；该序列存在多处反向重复的现象。
　　 2．TP526序列的转录因子结合位点分析表明，该片段存在HSF2、C/EBPb、C/EBPa、SRY、CdxA、GR、AML-la、CRE-BP、CREB、S8、Nkx-2、GATA-1、MZF1、GATA-2，、MEF-2、TRE和RevREs等潜在调控元件。
　　 3．检测TP526序列的SNP发现该片段距离CDS起点上游第98位G→A突变(G98A)，第229位的C→T突变(C229T)，第376位的A→G突变(A376G)，第400位的T→C(T400C)以及外显子1中第9位的T→G突变(T+9G)。使用StyI对PCR产物实施酶切，共发现9种A376G-G98A的联合基因型，但当G98A位点发生G→A时，该处的StyI酶切位点消失，而在A376G处发生A→G时StyI酶切位点也消失；MwoI酶切PCR产物共发现7种C229T-T+9G的联合基因型，但当C229T位点发生C→T时，该处的Mwol酶切位点消失，而在T+9G处发生T→G时使得该处产生新的MwoI酶切点；Fnu4HI酶切PCR产物存在5个酶切点，但当T400C位点发生T→C时，该处的酶切位点消失。
　　 4．T400C位点的C基因在脂肪型猪群中频率高达0.6568，而在瘦肉型猪群中为0.3595:A376G位点的A基因在脂肪型和瘦肉型猪群中的频率分别为0.5571和0.4944;C229T位点的C基因在脂肪型猪群中的频率为0.7362，在瘦肉型猪群中的频率高达0.9607;G98A位点的G基因在脂肪型和瘦肉型猪群中的频率分别为0.6142和0.6629。
　　 5．利用双荧光素酶报告基因检测不同基因的表达调控效果，结果表明T400C位点以C基因的启动子效果最好，大约是T基因的3.3088倍(P＜0.01)；比较A376G位点的G和A基因发现，A基因的启动子效果显著地高于G基因(P＜0.01)；在G98A位点，以A基因的启动子效率最高(P＜0.01)。