猪AMPD1基因启动子区域SNP作为猪胴体性状的遗传标记及应用

摘要

本发明属于猪的遗传标记制备技术领域，具体涉及一种与猪胴体性状相关的分子标记制备及在标记辅助选择上的应用。所述的分子标记由AMPD1基因启动子序列克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。在序列表SEQIDNO：2所示序列的第103位碱基处有一个A103-G103的碱基突变，导致Hin1IPCR-RFLP多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为猪的标记辅助选择提供了新的遗传标记。

说明书

技术领域

本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪胴体性状相关基因AMPD1基因启动子片段的克隆，分子标记的制备及其在标记辅助选择上的应用。

背景技术

基于分子遗传学和分子数量遗传学的分子育种技术为动物育种提供了新的手段，使动物育种学家从根据数量性状表型转变到根据数量性状基因型出发，由表型选择转为标记辅助选择（MAS），从而实现分子育种，大大加快了育种进度。通过这种基因型的选择，即可实现对控制重要经济性状的遗传标记或基因的鉴别，完成早期的个体基因型选择，即分子育种。

根据现有的生理生化知识，选取一些功能已知、在目标性状表现过程中发挥重要作用，预计与目标性状紧密相关的基因作为研究对象，探寻真正决定目标性状基因的方法称为候选基因法。候选基因法是寻找影响猪重要经济性状候选基因强有力的工具，不仅能够寻找那些间接标记，而且还有可能所选候选基因就是影响性状的主效基因，也即直接标记。候选基因法具有应用广、费用低和操作简单等优点。在现代动物育种实验中，通过在分子水平上识别控制重要性状的遗传标记或者基因座，以便在早期或超早期直接对个体进行选择是一种极为重要的手段，也是为广大育种工作者广泛采用的一种方法。这种借助分子标记辅助选择（MAS）进行猪的遗传改良、提高猪的生产性能的方式的前提是必须找到尽可能多的合适的分子遗传标记信息。

腺苷一磷酸脱氨酶( adenosine monophosphate deaminase, AMPD)是只在真核生物中发现的一种酶，由多基因家族所编码，它是嘌呤代谢过程中的一种重要的酶。腺苷三磷酸(ATP)在ATP酶的作用下分解为腺苷二磷酸(ADP)，ADP在磷酸激酶的作用下，分解成腺苷一磷酸(AMP)，AMP再经AMPD脱氨生成肌苷酸(IMP)，在骨骼肌的能量代谢中起着非常重要的作用(Hancock et al., 2006)。AMPD1 在人、鼠上的研究较为深入，AMPD 是一个大的多基因家族,家族成员有3 种：AMPD1，AMPD2和AMPD3。这3 个成员是同功异构酶，其氨基酸与核苷酸序列都有一定的保守性，具有组织表达特异性。AMPD1 在所有的真核生物中都存在，但主要在肌肉中表达，在骨骼肌中高水平表达(M型) (Sabina et al., 1990)。AMPD2 存在于高等真核生物中，主要在平滑肌、胚胎和肝脏中表达(L型) (Bausch-Jurken et al., 1992)。AMPD3存在于人和啮齿类动物(如兔和鼠)，主要在血红细胞中表达(E1 和E2 型)。

通过连锁分析发现，猪AMPD1 基因与NGFB 基因紧密连锁，从而将猪AMPD1 基因定位于4q1.6-q2.3 (Stratil et al., 2000)。而在这一区域存在大量影响猪胴体性状(屠体重、肩肉重、眼肌面积、头重等) 的数量性状基因座位点（QTL），所以AMPD1 基因可以当作这些性状的候选基因进行研究。我们以前研究表明猪AMPD1 基因在肌肉中特异表达，并且随着肌肉的发育呈现上调表达模式 (Wang et al., 2008)。因此，我们推测猪AMPD1基因可能是一个影响猪肌肉生长发育的重要基因。另外，到目前为止仍没有见到研究猪AMPD1基因启动子SNP多态性与猪胴体性状关系的研究的相关报道。所以申请人将猪AMPD1基因作为影响猪胴体性状的重要侯选基因，研究该基因启动子区域突变位点在群体中的多态性，并对这些多态位点与猪生产性状的关系进行了进一步的分析，期望能够发现影响猪胴体性状的重要多态位点。

发明内容

本发明的目的在于克隆与猪胴体性状相关的基因AMPD1基因的启动子区域，寻找基因突变位点，并建立相应的多态性检测方法进行性状关联分析，为猪的标记辅助选择提供一种有用的分子标记。

本发明通过以下技术实现：

一种作为分子标记应用的与猪胴体性状相关的AMPD1基因启动子区域序列，全长为808bp，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。依据获得的如序列表SEQ ID NO：1所述DNA序列设计引物，通过扩增和测序获得了AMPD1基因启动子部分核苷酸序列，该序列长度为401bp，其中第103bp处有一个A103-G103的碱基突变，导致BglII PCR-RFLP多态性。所述引物对的正向引物为：5' TCTAATTAGCATCCATGAGG 3'；反向引物为：5' AGCTCTGCAAAGTCAAGGT 3'。

一种制备所述的与猪胴体性状相关的AMPD1基因启动子序列的方法，按照以下步骤：

   （1）以猪AMPD1基因的cDNA为信息探针，在猪基因组数据库做同源序列筛选，获得一个包含猪AMPD1基因的一个BAC克隆子，以BAC克隆子序列作模板设计引物，以中国地方猪品种梅山猪的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得猪AMPD1基因启动子序列，如序列表SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

   （2）选择3头大白猪和3头梅山猪为试验材料，从血液中提取猪基因组DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化、克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所述的猪AMPD1基因启动子部分核苷酸序列。

在本发明的实施例中申请人已将制备的与猪胴体性状相关的分子标记应用在猪分子标记辅助育种的关联分析中。

本发明的效果是：发现了一个与猪胴体性状相关的分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

更详细的技术方案请参见《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪生长性状相关基因AMPD1基因的启动子核苷酸序列。

序列表SEQID NO：2是本发明克隆的猪生长性状相关基因AMPD1基因的启动子区域部分核苷酸序列。

图1：本发明的技术流程图。

图2：是本发明中猪AMPD1基因用于性状关联分析的DNA序列扩增电泳结果，图中泳道M：DNA分子量标准（DL2000 ladder）。

图3：是本发明中猪AMPD1基因启动子序列的BglII-RFLP三种基因型电泳图谱。图中：M：DNA分子量标准（DL2000 ladder）。

图4：是本发明所扩增得到的猪AMPD1基因启动子部分核苷酸序列，片段大小为401bp，图中下划线分别为正、反向引物序列。括号内所显示的是碱基突变。

具体实施方式

实施例1: （一）猪AMPD1基因启动子区域DNA序列扩增

（1）引物设计：

用猪AMPD1基因的cDNA （GenBank登录号：EU 606354）为信息探针，利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST工具在Genomic Biology猪基因组数据库中做同源序列筛选。获得一个包含猪AMPD1基因的一个BAC克隆子（GenBank登录号：CU393558），以该BAC克隆子序列作模板设计引物，以中国地方猪品种梅山猪的基因组DNA为模板，获得猪AMPD1基因启动子序列。用Primer Premier 5.0 软件设计1对引物扩增SEQ ID NO：1，所述的序列，它们的序列大小分别为808bp。

所述1对引物的DNA序列如下：

正向引物（F1）：5’- TCTAATTAGCATCCATGAGG-3’

反向引物（R1）：5’- GGAAGTTTCAACAGAGGCAT-3’。

（2）PCR扩增反应

PCR反应体系为25μL，其中模板为猪DNA为100ng，dNTPs浓度为10mmol/L，每条引物浓度为10mmol/L，2U的Taq DNA聚合酶，加去离子水至总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后94℃变性40s、59℃退火40s、72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）PCR产物的回收、纯化、克隆和测序

PCR产物经纯化（按照上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书操作）。载体连接体系组成：10×buffer，1μL；pMD18-T Vector（50ng），1μL；回收的PCR扩增片段，8μL；总体积为10μL并混和均匀，于16℃连接4小时或者4℃过夜连接。将10μL的连接产物与100μL感受态细胞混匀，在冰上放置30min，然后于42℃的循环水浴中热击90s。迅速将管转移到冰浴中5min。加入400μL LB液体培养基，37℃复苏培养1h。4000r/min离心6分钟后弃部分上层液，取100μL转移到LB培养基平板上。待液体被吸收后，倒置平皿，于37℃培养12-16h。挑取单个菌落加入含有氨苄青霉素的LB培养基中培养6h以上，然后进行PCR扩增，电泳检测，挑取阳性克隆子。鉴定正确的菌液送北京奥科生物技术有限责任公司进行序列测定。

（二）PCR-RFLP诊断方法建立

（1）引物序列和PCR扩增条件

选择3头大白猪和3头梅山猪，通过实施例1获得的AMPD1基因启动子序列为试验材料，设计了以下引物，引物序列如下：

正向引物F1：TCTAATTAGCATCCATGAGG；

反向引物R1：AGCTCTGCAAAGTCAAGGT。

用该引物分别在3头“大白猪”和3头“梅山猪”基因组DNA中进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为10mmol/L，每条引物浓度为10mmol/ L，1U的TaqDNA聚合酶，加去离子水至总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后94℃变性40s、61℃退火40s、72℃延伸25s，共35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

（2）RFLP检测

PCR产物酶切反应体积是10μL，其中PCR产物6μL，双蒸水2.7μL，1×buffer Tango 1μL，限制性内切酶BglII为0.3μL (10U/μL) ，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置6h，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

用引物扩增猪基因组DNA得到了401bp特异性扩增片段，该片段的第103位是1个A-G碱基转换，该突变位点能导致BglII酶切位点的变化。酶切产生三种基因型，AA基因型只有401bp一条带，GG基因型有298bp和103bp两条带，杂合子AG基因型有401bp，298bp和103bp的三条带。

实施例2：分子标记在不同猪群中的多态性分布

利用PCR-BglII-RFLP的方法，在3个外来引进猪种（大白，长白和杜洛克）和3个中国地方猪种（梅山、通城和清平）猪群中检测猪AMPD1基因多态性，检测结果如表1所示。AMPD1基因各基因型在在大白，长白和杜洛克猪中A等位基因占优势，在梅山、通城和清平猪中G等位基因占优势。

表1  不同血缘猪品种中AMPD1基因BglII多态性的基因型和基因频率

实施例3：分子标记在生产性状中的应用

用于统计分析的试验猪群为农业部猪遗传育种重点实验室组建的大白×梅山F2代资源群体，用于关联分的主要胴体性状包括皮率，骨率，肥肉率，瘦肉率，瘦肥肉比例，胴体重，屠宰率，板油重，花油重，内脂率，至第一颈椎胴体长，至第一肋胸胴体长，6-7腰椎间背膘厚，肩部背膘厚，胸腰椎间背膘厚，臀部背膘厚，平均背膘厚，腿臀比率，眼肌高，眼肌宽，眼肌面积。

    申请人采用SAS统计软件（SAS Institute Inc, Version 8.0）glm程序进行单标记方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：

Yijkl=μ+Gi +Sk+Yl(+bijklXijkl)+eijkl

Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应；Sk、Yl为固定效应，分别为性别、年度效应，bijkl为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰日龄为协变量；eijkl为残差效应。

表2 猪AMPD1基因BglII酶切基因型与胴体性状的关联分析

^*表示差异显著（p < 0.05），^**表示差异极显著（p < 0.01）

不同基因型个体生产性状之间的关联分析结果表明(表2)，BglII位点的不同基因型组合间的瘦肉率存在极显著相关（p < 0.01），平均背膘厚和臀部背膘厚存在显著差异（p < 0.05）。GG基因型的瘦肉率极显著高于AA 和AG基因型（p<0.01），同时GG基因型的平均背膘厚和臀部背膘厚显著低于AA 和AG基因型（p<0.05）。

参考文献：

1. Hancock C R, Brault J J, Terjung R L. Protecting the cellular energy state during contractions: role of AMP deaminase. J Physiol Pharmacol, 2006, 57, Suppl 10: 17-29.

2. Sabina R L, Morisaki T, Clarke P, Eddy R, Shows T B, Morton C C, Holmes E W. Characterization of the human and rat myoadenylate deaminase genes. J Biol Chem, 1990, 265: 9423-9433.

3. Bausch-Jurken M T, Mahnke-Zizelman D K, Morisaki T, Sabina R L. Molecular cloning of AMP deaminase isoform L. Sequence and bacterial expression of human AMPD2 cDNA. J Biol Chem, 1992, 267: 22407-22413.

4. Stratil A, Knoll A, Moser G, Kopecny M, Geldermann H. The porcine adenosine monophosphate deaminase 1 (AMPD1) gene maps to chromosome 4. Anim Genet, 2000, 31: 147-148.

5. Wang L, Mo X, Xu Y, Zuo B, Lei M, et al. Molecular characterization and expression patterns of AMP deaminase1 (AMPD1) in porcine skeletal muscle. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2008, 151: 159-166.

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  四川农业大学

 

<120>  猪AMPD1基因启动子区域SNP作为猪胴体性状的遗传标记及应用

 

<130>  2013

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  808

<212>  DNA

<213>  猪（Sus scrofa）

 

<400>  1

tctaattagc atccatgagg gcagattcca tctctgccct tgctccgtgg gttaaggatc     60

 

tggcattgct gagagctgtg gtgtaggttg tagacatggc tcagatctcg agttgctgtg    120

 

actgtggtgt aggctggcag ctgcagctct gattcaaccc ctggcctggg aacctccata    180

 

tgctgtggat gcagccctaa aaagatacac acaaaacaag tgtgacttaa ccattaaata    240

 

aattctatca ggtgagtttc tgccaagtca gggatatttc ttatgaggtg tgtgtgtgtg    300

 

tgtgtgtgtg ttgagagctt gattaatgta ccagcatatt caccaaccct ggttagccgt    360

 

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aatgctaaag ctataaatag gtctaaagct catctctctc cttttagcag agaagggtca    660

 

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agtcatcctc acagtctcct gtctcttcct ttctactgtg ctatcctaga accaaggatc    780

 

ccagcacaat gcctctgttg aaacttcc                                       808

 

 

<210>  2

<211>  401

<212>  DNA

<213>  猪（Sus scrofa）

 

 

<220>

<221>  mutation

<222>  (103)..(103)

 

<400>  2

tctaattagc atccatgagg gcagattcca tctctgccct tgctccgtgg gttaaggatc     60

 

tggcattgct gagagctgtg gtgtaggttg tagacatggc tcagatctcg agttgctgtg    120

 

actgtggtgt aggctggcag ctgcagctct gattcaaccc ctggcctggg aacctccata    180

 

tgctgtggat gcagccctaa aaagatacac acaaaacaag tgtgacttaa ccattaaata    240

 

aattctatca ggtgagtttc tgccaagtca gggatatttc ttatgaggtg tgtgtgtgtg    300

 

tgtgtgtgtg ttgagagctt gattaatgta ccagcatatt caccaaccct ggttagccgt    360

 

actcaggatt aaaatcctga ggaccttgac tttgcagagc t                        401