一种检测秦川牛FGF13基因拷贝数变异的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种检测秦川牛FGF13基因拷贝数变异的方法及其应用：基于实时定量PCR，以秦川牛基因组DNA为模板，利用一对特异性PCR引物扩增牛FGF13基因的拷贝数变异区域，同时利用另外一对特异性PCR引物扩增牛通用转录因子3基因作为对照，最后利用2

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学研究领域，具体涉及一种检测秦川牛FGF13基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组DNA实时定量PCR，以BTF3基因为参照，根据2^-ΔΔCt值从而确定个体的拷贝数类型。

背景技术

在中国的肉牛业发展当中，肉牛的生长率和肉品质是两个主要的制约因素。而研究调控肉牛生长和肌肉发育的分子机制，可以为中国肉牛业的发展提供理论依据。众多的研究表明，生长因子在调节机体生长发育的过程当中，起着至关重要的作用，而成纤维细胞生长因子(FibroblastGrowthFactor,FGF)就起着这样一个作用。该家族蛋白参与多种生理过程，如胚胎的发育、细胞的生长、形态发生和组织修复。作为FGF家族的重要成员之一，FGF13位于X染色体上，作为一个微管结合蛋白调节神经系统的发育，以及参与丝裂原活化蛋白激酶(MitogenActivatedProteinKinase,MAPK)信号通路。然而，FGF家族蛋白特别是FGF13蛋白在牛的生长发育过程中的详细机制尚未研究清楚。

近十年，随着生物技术的飞速发展，拷贝数变异的研究进入了蓬勃发展的时期。所谓的拷贝数变异指的是一个物种两个个体之间的大于50bp基因组序列的插入或缺失变异，是一种基因组结构变异类型。他可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。随着牛全基因组测序工作的完成，牛基因组CNVs研究也成为热点。研究表明，有些CNV位点位于功能基因内部，有些与牛的各种经济性状相关，或与健康性状相关的QTL位点重合。这些研究说明CNV与牛的正常生长发育息息相关。在检测已知CNV的各种方法中，qPCR是使用比较广泛的一种技术。该方法操作简单，敏感性高，速度快。PCR中选取单拷贝的基因，如参考Liu等验证发现的牛单拷贝基因BTF3基因，作为内参基因，然后利用2^-ΔΔCt的方法判定个体的拷贝数变异类型以及相对拷贝数。

但目前为止，尚未见到关于检测秦川牛成纤维细胞生长因子13(FibroblastGrowthFactor13,FGF13)基因拷贝数变异(CopyNumberVariations,CNVs)的基因组DNA实时定量PCR(quantitiveReal-TimePCR,qPCR)的方法报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测秦川牛FGF13基因拷贝数变异的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测秦川牛FGF13基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以秦川牛基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增FGF13基因的拷贝数变异区域以及作为对照的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定秦川牛FGF13基因的拷贝数变异类型。

所述的FGF13基因的拷贝数变异区域位于FGF13基因参考基因组序列AC_000187.1的621003位至622778位。

所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，-ΔΔCt>0.5；缺失型，-ΔΔCt<-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-AAGAGGGTGTTTGCTAT-3’

下游引物R1：5’-CAGTAACGCTGAAGAAG-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

所述的实时定量PCR所用的扩增体系以25μL计包括：50ng/μL模板DNA2μL、10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各1μL以及PremixExTaq^TMII12.5μL。

所述的实时定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃预变性1min；(2)95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。

基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为236bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

上述检测秦川牛FGF13基因拷贝数变异的方法在秦川牛分子标记辅助选择育种中的应用。

所述拷贝数变异类型中，具有插入型拷贝数变异类型的个体在生长性状上显著优于具有正常型拷贝数变异类型的个体。

所述生长性状为体长或坐骨端宽。

本发明公开的检测秦川牛FGF13基因拷贝数变异的方法，与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，快速简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数类型。

本发明对秦川牛FGF13基因(FGF13基因的拷贝数变异区域)的CNV类型进行了检测和类型频率统计，并将该位点与秦川牛的生长性状进行关联分析。结果表明该位点中，Loss类型的频率最高，而且该位点的Gain类型对秦川牛的体长和坐骨端宽有显著的正效应。

附图说明

图1为FGF13基因CNV检测引物PCR扩增产物电泳图；图1中：泳道1为DNAmarkerI，泳道2和3为FGF13基因特异性引物(引物对P1)PCR产物，片段大小为236bp。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

在前期的黄牛基因组重测序研究当中，发现牛FGF13基因组序列的621003位至622778位发生了拷贝数变异，因此，基于FGF13基因的生理作用以及CNV的调节机制，研究FGF13基因的拷贝数变异与生长性状的关联性是十分必要的，可为黄牛分子育种提供重要的理论依据。

本发明根据重测序得到的秦川牛FGF13基因组序列中发生拷贝数变异的区域为模板设计特异性引物，然后以秦川牛基因组DNA为模板，进行qPCR扩增，并以BTF3基因为内参基因，利用2^-ΔΔCt方法，判定个体的拷贝数类型。

本发明于利用qPCR技术，检测秦川牛FGF13基因的拷贝数变异情况，并将不同的拷贝数变异类型与生长性状进行关联分析，寻找具有优势生长性状的拷贝数类型，从而为秦川牛的分子育种工作提供基础资料，加快中国秦川牛的种质资源改良工作。

1.样品的采集及基因组DNA提取

(1)血样的采集

本发明中采集的秦川牛来自于陕西秦川牛原种牛保种场，均为24月龄，共计132个个体，血液的采集方法为颈静脉采血。并记录它们的生长性状数据，如体高、体长、胸围、尻长、坐骨端宽、十字部高等，以用于后续的关联分析。

(2)血样DNA的提取

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃，12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。

②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K至5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。

④将反应液冷却至室温，加入500μLTris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次。

⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

⑧4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

⑨4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的TE溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存。

2.目的基因及内参基因的扩增用特异性引物的设计

以NCBI所公布的牛FGF13基因(AC_000187.1)为参考序列，查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列，即FGF13基因(目的基因)组序列的621003位至622778位，利用Prime5.0软件设计被包含在此区域的引物，并在NCBI_BLAST中进行比对。其引物序列如下(引物对P1)：

上游引物F1：5’-AAGAGGGTGTTTGCTAT-3’(SEQ.ID.NO.1)

下游引物R1：5’-CAGTAACGCTGAAGAAG-3’(SEQ.ID.NO.2)

同时，以NCBI所公布的牛BTF3基因序列(AC_000177.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增该内参基因(BTF3基因序列)中特定片段(166bp)的引物，其引物序列如下(引物对P2)：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’(SEQ.ID.NO.3)

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’(SEQ.ID.NO.4)

利用普通PCR扩增和1％的琼脂糖电泳验证了引物对P1和P2扩增产物的特异性，例如，参见图1。

3.实时定量PCR

qPCR反应体系如下表1所示。

表1qPCR的反应体系

PCR反应程序为：

(1)95℃预变性1min，然后按照(2)进行扩增反应；

(2)95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。

4.个体CNV类型判定

实验结果采用2^-△△Ct方法进行计算，具体的计算方法为：ΔΔCt＝ΔCt_(实验组)-ΔCt_(参照组)，ΔCt_(实验组)＝Ct_{(实验组目的基因)}-Ct_{(实验组内参基因)}，ΔCt_(参照组)＝Ct_{(参照组目的基因)}-Ct_{(参照组内参基因)}

公式中，实验组即为待检测有无拷贝数变异的个体样本。参照组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序试验中所选择的参照组秦川牛个体。

根据公式计算得出每个待测个体的-△△Ct，并根据CNV类型的判定标准：-△△Ct>0.5为Gain类型(插入型)；-0.5≤-△△Ct≤0.5为Median类型(正常型)，-△△Ct<-0.5为Loss类型(缺失型)，判定检测的秦川牛个体的拷贝数类型。

5.数据处理

统计检测群体中各种类型(Gain,Median和Loss)的个体数，并统计各种类型的频率。计算公式如下：

P_C＝N_C/N

其中，P_C代表某种拷贝数类型的频率；N_C代表群体中具有C这种CNV类型的个体数；N代表检测群体的总数量。

利用SPSS(18.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响体尺性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、性别、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中，Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的拷贝数类型；E_ijk为随机误差。

数据处理的结果如表2所示。

表2秦川牛FGF13基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。^*P<0.05。括号里面的数值表示拷贝数类型的频率。

结果表明，秦川牛FGF13基因的拷贝数变异位点与体长和坐骨端宽这两个生长性状具有显著的关联性。其中，Gain类型的生长性状显著优于Median类型个体。因此，FGF13基因的Gain拷贝数类型可以作为秦川牛体长和坐骨端宽性状早期选择的分子标记，用于秦川牛的快速选育。