水稻几丁质激发子结合基因启动子及其应用

摘要

本发明公开了水稻几丁质激发子结合蛋白（Chitin？elicitor？binding？protein）基因启动子（OsCEBiPP），属于植物基因工程技术领域。本发明启动子来源于SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列，控制水稻几丁质激发子结合蛋白基因仅在水稻维管束或维管束韧皮部细胞中特异表达。比较分析发现，CGTCA-motif功能元件可能调控了基因在韧皮部细胞中的特异表达，5UTR？Py-rich？stretch和GT1GMSCAM4功能元件影响了全长启动子的转录活性。本发明启动子可以用于外源基因在水稻维管束或维管束韧皮部中特异表达。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；具体涉及一种水稻几丁质激发子结合基因启 动子的分离鉴定和应用。

背景技术

水稻是目前农业生产和科学研究的热点植物，在完成水稻全基因组计划之后，其 功能基因组的研究得到越来越多的广泛关注，特别是对一些调控水稻重要农业性状基因的 研究日益受到研究人员的重视。

几丁质激发子蛋白(OsCEBiP)是定位于水稻细胞膜表面的受体，具有胞外LysM受 体结构域，该蛋白识别真菌几丁质信号从而激发水稻的免疫反应。Kaku等人第一个克隆了 OsCEBiP基因，证明它在植物的抗病反应中发挥重要作用(Kaku等，2006Plantcells recognizechitinfragmentsfordefensesignalingthroughaplasmamembrane receptor.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences103:11086-11091)。而 该基因启动子的功能尚未研究，尤其是其作用方式尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有维管束组织表达特异性的水稻几丁质激发子结 合蛋白基因启动子及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸,位于水稻几丁 质激发子结合蛋白基因OsCEBiP的起始密码子ATG上游1807bp的范围，序列如SEQIDNO:1； 根据植物顺式调控元件数据库(NEWPLACE和PLACE)的搜索，本发明所提供的启动子区域含 有多个组织特异性的顺式作用元件(如图1、图2所示)。启动子含有1个脱落酸和钙离子响应 的顺式作用元件ABRERATCAL，3个抗病反应应答元件BIHD1OS，2个茉莉酸应答元件CGTCA- motif，1个抗病反应应答元件GT1GMSCAM4，1个抗旱应答元件MBS，1个伤信号应答元件WUN- motif，10个抗病应答元件WRKY71OS，1个转录活性调控元件5UTRPy-richstretch等8个主 要的顺式作用元件。

在本发明实施例中，利用所述启动子OsCEBiPP构建得到6个包括全长及截短启动 子片段的植物表达载体pCAMBIA1391Z-OsCEBiPP(如图3所示)，分别命名为C0.2，C0.4， C0.6，C0.9，C1.3和C1.8，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述载体转化水稻品种，各长 度启动子在愈伤时期和幼叶时期观察到报告基因β-葡萄糖苷酶GUS的表达(如图4所示)； C0.2，C0.4可以在植物的维管束中观察到报告基因GUS的表达，C0.6，C0.9，C1.3可以在植物 的维管束韧皮部中观察到报告基因GUS的表达(如图5所示)，C0.2，C0.4，C0.6，C0.9，C1.3和 C1.8的表达强度依次降低(如图6所示)。

因此，本发明提供以下多核苷酸：

(1)SEQIDNO：1中第1-164位所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(2)SEQIDNO：1中第1-372位所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(3)SEQIDNO：1中第1-556位所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(4)SEQIDNO：1中第1-883位所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(5)SEQIDNO：1中第1-1282位所示的核苷酸序列的多核苷酸；

本领域技术人员应当理解根据(1)、(2)、(3)、(4)、(5)所示的核苷酸序列，对其替 换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，也可以获得具有维管束组织表达特异性的核苷酸序 列，例如，在非应答原件或作用原件，替换一个或几个碱基。另外，本领域技术人员还可以根 据SEQIDNO.1的序列获得其它具有控制基因时空特异表达的DNA功能片段，这种功能片段 是能受褐飞虱取食诱导，增强基因表达，并且具有维管束组织表达特异性的核苷酸序列。

本发明的另一方面，提供(1)、(2)、(3)、(4)、(5)所述的多核苷酸的用途，用于指导 目的基因在植物维管束中特异表达。

本发明的另一方面，提供(3)、(4)、(5)所述的多核苷酸的用途，用于指导目的基因 在植物维管束韧皮部中特异表达。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的(1)、(2)、(3)、(4)、 (5)多核苷酸的任一个，作为启动子元件。

在本发明的一个优选例中，将目的基因可操作地连接到本发明的启动子之下，构 建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，获得组织特异表达的重组表达载 体。因此，本发明还包括由上述启动子构建的表达盒，以及含有上述启动子或表达盒的表达 载体或重组表达载体。

本发明启动子可以用于制备转基因植物。比如，通过农杆菌介导、基因枪法以及花 粉管通道等方式获得转基因植物。从而可以通过引入重要的农艺性状基因，培育出高效特 异表达的植株，从而达到改良品种的目的，例如引入抗性基因在维管束中表达，用来提高植 物抗刺吸式昆虫的能力。

通过定量PCR和半定量PCR，检测水稻根、茎和叶片组织几丁质激发子结合蛋白基 因OsCEBiP在根、茎、叶中都有表达，其中在幼叶中表达量最高。

通过定量PCR技术，检测水稻几丁质激发子结合蛋白基因OsCEBiP受褐飞虱取食时 间的相对表达量，可以看到随着褐飞虱取食时间的增加，OsCEBiP的表达量逐渐升高(如图8 所示)。

本发明的优点和效果：

1、本发明的启动子为组织特异表达，可以用于基因在植株维管束和维管束韧皮部 细胞中的特异表达的研究。

2、本发明的启动子与植物的抗病抗虫相关，可以用于提高植物抗病抗虫反应的研 究。

附图说明

图1.启动子序列，下划线表示5’UTR区，方框表示启动子基本元件TATA-box或 CAAT-box。

图2.根据顺式作用元件在启动子序列上的分步构建了6个全长及截短启动子载体 的示意图，该启动子含有8个功能元件。

图3.各长度表达载体pCAMBIA1391Z-OsCEBiPP的物理图谱，该载体含有潮霉素抗 性筛选基因，启动子被融合到GUS基因5’端转录非翻译区。

图4.GUS活性检测，图A：愈伤时期，B：种子时期，C：6天的苗期，D：20天的苗期等生 长。如图显示，在愈伤组织，6天苗期的幼根幼芽，20天苗期的幼叶中有蓝色。

图5.20天苗期的转基因叶片GUS染色后的石蜡切片观察，A-F依次为C0.2、C0.4、 C0.6、C0.9、C1.3和C1.8叶片GUS染色后的石蜡切片。如图显示，C0.2、C0.4可以在植物的维 管束中观察到报告基因GUS的表达，C0.6、C0.9、C1.3可以在植物的维管束韧皮部中观察到 报告基因GUS的表达，C1.8没有观察到报告基因GUS的表达。GUS染色的位置用箭头表示。

图6.蛋白杂交分析C0.2、C0.4、C0.6、C0.9、C1.3和C1.8叶片报告基因GUS表达量。 如图显示，C0.2、C0.4、C0.6、C0.9、C1.3、C1.8表达强度依次降低。

图7.定量PCR和半定量PCR检测OsCEBiP基因在水稻各组织器官中的表达。actin为 对照基因，YR：生长18天的幼根，YS：生长18天的幼茎，YL：生长18天的幼叶，MR：生长67天的 成熟根，MS：生长67天的成熟茎，ML：生长67天的成熟叶。数据显示OsCEBiP基因在幼叶中表 达最高。

图8.定量PCR检测OsCEBiP受褐飞虱取食诱导表达。actin为对照基因，接种褐飞虱 0h、6h、24h、48h、72h、96h后基因的表达量，SPSS的单因素方差分析数据显著性水平，任意两 组数据进行比较，具有显著性差异的数据用不同的字母标示。数据显示OsCEBiP在接种褐飞 虱后，表达量明显上调，这些说明OsCEBiP确实受褐飞虱取食诱导。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

【实施例1】启动子的分离和鉴定

发明人选取水稻几丁质激发子结合蛋白基因OsCEBiP的起始密码子ATG上游 1807bp的范围作为候选启动子区域进行PCR扩增。根据顺式作用元件的位置，设计引物用于 载体构建，见表所示：

以水稻材料B5的基因组DNA(CTAB法抽提，ZhangQF等，1992，Geneticdiversity anddifferentiationofindicaandjaponicaricedetectedbyRFLP anaysis.Theor.Appl.Genet.83，495-499)为模板进行PCR扩增，采用高保真酶KOD-Plus- Neo(TOYOBO，日本)50μl反应体系扩增。PCR条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，68℃退 火延伸30s/kb，40个循环。PCR体系如下：

PCR产物回收后连入pGEM-T载体上，连接反应：PCR产物1μl，pGEM-T0.5μl，1UT4 ligase，5×buffer2μl，总10μl体积，4℃连接过夜；连接产物与大肠杆菌TOP10混匀，42℃ 热激90s，加500μlLB，复苏45min，取200μl涂于含氨苄霉素的LB平板，37℃，过夜。筛选阳性 克隆并测序。结果如SEQIDNo.1所示。将该序列输入NEWPLACE和PLACE数据库，即给出了该 启动子包含多个具有时空表达特异性以及抗病反应应答元件(图1和图2)，根据各功能元件 的分布扩增另外5个截短启动子片段(图2)。

【实施例2】启动子表达活性鉴定

本发明的实施例构建启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻品种，GUS显色观察 该启动子的组织特异表达活性。具体操作如下：

首先将PCR产物用HindIII/BamHI和EcoRI双酶切，pCAMBIA1391Z载体也用同样 的酶切，试剂盒纯化回收，连接，测序。将正确的克隆电转农杆菌EHA105。采用农杆菌EHA105 介导的遗传转化方法(Hiei等，1994，Efficienttransformationofrice(Oryzasativa L.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthe T-DNA.PlantJournal6:271-282)将基因组载体导入水稻品种。

将获得的转基因繁殖后得到单拷贝纯合阳性植株，对其愈伤、种子、苗期叶片等组 织分别进行GUS活性染色(LagardeD等，1996，Tissue-specificexpressionof ArabidopsisAKT1geneisconsistentwitharoleinK⁺nutrition.PlantJ.9,195– 203)。染色后材料在体视镜观察拍照。观察结果表明，在愈伤组织，6天苗期的幼根幼芽，20 天苗期叶片都有蓝色(图4)；对20天苗期的水稻叶片组织进行石蜡包埋切片，载玻片置于显 微镜下(OlympusBX51)镜检拍照，结果表明，C0.2和C0.4可以在植物的维管束中观察到报 告基因GUS的表达，C0.6、C0.9和C1.3可以在植物的维管束韧皮部中观察到报告基因GUS的 表达(图5)；取植物100mg叶片组织在液氮中研磨成粉末，加入750μlUgp蛋白提取液 (Ciereszko等，2001，Phosphatestatusaffectsthegeneexpression,protein contentandenzymaticactivityofUDP-glucosepyrophosphorylaseinwild-type andphomutantsofArabidopsis.Planta212:598-605.)，以GUS抗体进行蛋白杂交。观 察结果表明，C0.2、C0.4、C0.6、C0.9、C1.3、C1.8表达强度依次降低(图6)。比较分析发现， CGTCA-motif功能元件可能调控了基因在韧皮部细胞中的特异表达，5UTRPy-rich stretch和GT1GMSCAM4功能元件影响了全长启动子的转录活性。

实施例3：水稻几丁质激发子结合蛋白基因OsCEBiP的组织特异性表达

以受体材料合江19(又名H1493，购自国家水稻种质资源库)为研究材料，对其生长 18天苗期和生长67天抽穗期，分别取根、茎和叶片组织2g立即浸入液氮中保存。用RNAiso Plus(TaKaRa)提取总RNA，再用RevertAid^TMfirststrandcDNAsynthesiskit (Fermentas)反转合成cDNA第一链。用CFX96TouchTMReal-TimePCRDetectionSystem (Bio-Rad)对不同组织的OsCEBiP进行定量PCR检测。PCR的8ul反应体系为：DNase/RNase- FreeddH₂O2.9μl，2×Supermix4μl，引物(5mM)0.6μl，cDNA模板0.5μl。反应条件：95℃变 性2min；95℃变性5-10s，TM退火延伸10-60s，40个循环；65-95℃，每步增加0.5℃，5s做溶解 曲线以确定扩增产物的特异性。

OsCEBiP定量引物：

F:CCACGCTTCTCACCAGAAAT

R:CTGATTGATGAACGGCACAC产物大小97bp。

用BIO-RADMyCylerThermalCyler对不同组织的几丁质激发子结合蛋白基因 OsCEBiP进行半定量PCR检测。PCR的10μl反应体系：cDNA模板0.3μl,1XPCRbuffer(Mg²⁺)， dNTP1mM，引物2μM，FermentasTaqDNAPolymerase0.3U，加灭菌水至10ul。反应条件是： 94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40个循环。以actin为参照基因，同样的PCR体系以及 反应条件。

OsCEBiP半定量引物：

F:GGGTGACGGAGTCCACGCTTCT

R:CAGGCTGTTGTCTGATTAGTTGC产物大小394bp。

数据显示OsCEBiP基因在根、茎、叶中都有表达，其中在幼叶中表达量最高。

【实施例4】水稻几丁质激发子结合蛋白基因OsCEBiP受褐飞虱诱导表达

以受体材料H1493为研究材料，播种至两叶一心时接种褐飞虱，并以不接种作为对 照。0h、6h、24h、48h、72h、96h后，取叶鞘2g并封于液氮以便保存。同上述方法提取RNA，反转 录，定量PCR。结果显示OsCEBiP受褐飞虱取食后表达明显上调，该基因可能参与了水稻对褐 飞虱的应答反应(图8)。推论水稻几丁质激发子结合蛋白基因启动子(OsCEBiPP)中抗病反 应应答元件BIHD1OS和受胁迫诱导上调的顺式作用元件WUN-motif和WRKY71OS，使得CEBiP 基因在抗病反应及抗虫反应中发挥了作用。

SEQUENCELISTING

<110>武汉大学

<120>水稻几丁质激发子结合基因启动子及其应用

<160>12

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1807

<212>DNA

<213>Oryzasativa

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