识别HPV18阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用

摘要

本发明提供一种识别HPV18阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用，该抗体能够高特异性地检测肿瘤细胞中的宫颈癌生物标志HPV18E7蛋白，从而能够区分癌变的宫颈上皮细胞和宫颈异常或非癌变宫颈上皮细胞，为医生准确诊断HPV感染所导致的癌症带来依据，进而及时采取治疗，以防止癌症发生，或癌症扩散，及时减轻病人痛苦。

说明书

技术领域

本发明属于生物诊断及医药领域，具体地说，本发明涉及识别HPV18阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用。

背景技术

宫颈癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位。1949年，Sttauss首先在电镜下于疣体浸出液中观察到人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)颗粒。在1976年HaraldZurHausen提出HPV可能是性传播致癌因素之后，HPV感染与宫颈癌关系的研究成为肿瘤病毒病因研究的热门课题。大量研究发现,人乳头瘤病毒HPV是导致宫颈癌的元凶，还可以引起多种其它肿瘤,包括生殖道、乳腺、消化道及呼吸道癌症。HPV近年来在我国人群中的传播有增无减，故宫颈癌预防、治疗的研究工作非常重要。

大多数妇女在其一生中都会感染生殖器HPV，全世界生殖器HPV感染率高达10.4％。大多数HPV感染在1-2年内会被自身免疫系统所清除，而持续存在的HPV感染将会演变为高度宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia，CIN)损伤，如CIN2和CIN3，甚至进一步演变为宫颈癌。据统计，约20％的低度宫颈损伤将转变为高度损伤，如果不及时治疗，其中30％将会进一步转为为恶性肿瘤。因此，早期诊断和预防HPV感染是降低宫颈癌等相关疾病死亡率和减少宫颈癌治疗开支的重要突破口。目前宫颈癌筛查主要采用的是巴氏涂片检验，检测宫颈脱落细胞的细胞学形态。细胞形态学检测具有一定的主观性，制片困难，批内和批间重复性差，具有较高的假阳性和假阴性率，因此对早期癌症检测灵敏度低、漏诊率高，阳性检出率仅在30％～50％；在一些地区，巴氏涂片检验已经被液基细胞学(LBC)所取代，LBC是半自动或全自动标本处理新技术，能够自动分析检测样本并可提供剩余的细胞样本供其他HPV感染分析。另一种临床上使用广泛的分子检测——HPVDNA检测(如HC2)可以辅助细胞学检测高危HPV病毒的存在。虽然HPVDNA检测比细胞形态学检测灵敏，但是无法区分HPV是瞬时感染或是持续感染，而在肿瘤恶性演变进程中检测方法的灵敏度和特异性都是必须的。由于其不能准确的反映宫颈癌的发生因此不能用于检测癌症(美国和我国2012年底分别更新的宫颈癌筛查指南一致指出“不推荐在任何年龄段的人群中单独使用HPV检测进行筛查”)。

HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要。Ziegent(2003)等研究已证实HPVE6、E7基因具有细胞转化功能,是潜在的癌基因,编码HPVE6、E7蛋白为癌蛋白,在体外能转化小鼠上皮细胞,也能使人类上皮细胞发生永生化,而且HPVE6、E7蛋白的持续表达是维持体外培养细胞永生化所必需的。因此，高危型HPV的早期表达蛋白E6和E7在宫颈癌的发生中起着重要作用。癌症发生过程中病毒DNA整合入人体细胞基因组内，随着E6和E7蛋白表达控制的缺失，在高度宫颈非典型增生和宫颈癌病人的上皮细胞内持续表达E6和E7蛋白。E7是肿瘤原性蛋白，且具有较强的抗原性，能够使肿瘤抑癌基因pRb失活，最终引起细胞生长失控，导致细胞永生化而发生癌变。这使得E7可作为高度宫颈损伤和宫颈癌检测的一个肿瘤标志物。

目前临床免疫组化检测HPV感染主要是采用HPVL1和其他一些辅助生物标志，如p16INK4A，Ki67,hTERT等(ValentinaF，RenzoB，SerenaB，等,DetectionofHPVE7Oncoviralproteinincervicallesionsbyanewantibody.ApplimmunohistochemMolMorphol,2013,21(4):341-350)。临床HPV检测没有合适的抗体主要有三个原因：1，HPV蛋白在临床组织或细胞样本中表达量较低，需要度高亲和力的抗体进行检测；2，HPV病毒在现有的标准组织培养技术下不能在实验室培养存活；3，E7蛋白本身存在免疫抑制，使得采用E7蛋白免疫动物不能获得很好的免疫反应，另外使制备得到的抗体往往与其他的HPV蛋白存在交叉反应对E7蛋白不具有特异性。

因此，需要提供一种简便的、客观的方法来检测高危型HPV感染的癌症(特别是宫颈癌)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够识别HPV18阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQIDNO.:4所示的CDR1，

SEQIDNO.:6所示的CDR2，和

SEQIDNO.:8所示的CDR3。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQIDNO.:10所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区，和

重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源。

本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQIDNO.:14所示的CDR1'，

SEQIDNO.:16所示的CDR2'，和

SEQIDNO.:18所示的CDR3'。

在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQIDNO.:20所示的氨基酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区，和

轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源或鼠源。

本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗HPV的抗体；优选地，所述抗体为特异性抗HPV18的抗体；更优选地，所述抗体为特异性抗HPV18E7蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。

在另一优选例中，所述抗体具有以下特性：

(1)与HPV18E7蛋白亲和力≤2.67nM；和

(2)不与HPV16E7蛋白结合。

所述“HPV18E7蛋白”可以为野生型HPV18E7蛋白，也可以为野生型HPV18E7蛋白的衍生蛋白。所述“HPV16E7蛋白”可以为野生型HPV16E7蛋白，也可以为野生型HPV16E7蛋白的衍生蛋白。

在另一优选例中，所述抗体为能够特异性区分HPV18E7蛋白和HPV16E7蛋白的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体不与其它HPV亚型结合或者与其它HPV亚型的亲和力较低。

在另一优选例中，所述抗体还具有以下特性：

(3)能够对包含HPV18E7的44-58位氨基酸的蛋白特异性结合。

在另一优选例中，所述抗体为IgG1型抗体。

本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗HPV；优选地，特异性抗HPV18；更优选地，特异性抗HPV18E7蛋白。

本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或

(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQIDNO.:3、5、7、9、13、15、17、或19所示的序列。

本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明本发明第七方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。

本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。

本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

所述试剂、检测板或试剂盒用于：

(1)检测样品中HPV18E7蛋白；和/或

(2)检测肿瘤细胞中内源性的HPV18E7蛋白；和/或

(3)检测表达HPV18E7蛋白的肿瘤细胞；和/或

(4)鉴别HPV的类型；

所述药剂用于治疗或预防表达HPV18E7蛋白的肿瘤。

在另一优选例中，所述样品中含有HPV18E7蛋白。

在另一优选例中，所述肿瘤包括：泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤或头颈肿瘤、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。

在另一优选例中，所述“泌尿生殖系统的肿瘤”包括：宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌或阴茎癌。

在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中HPVE7蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)将样品与本发明第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HPVE7蛋白。

在另一优选例中，在步骤(2)中通过ELISA法进行检测。

在另一优选例中，所述HPVE7蛋白包括HPV18E7蛋白。

在另一优选例中，在步骤(1)中，将样品与两种针对HPVE7蛋白的抗体接触，并且在步骤(2)中通过ELISA法进行检测，所述两种针对HPVE7蛋白的抗体中的至少一种为本发明第五方面所述的抗体。

在另一优选例中，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物，其中，所述第一抗体是本发明第五方面所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述第一抗体的结合表位不同。

在另一优选例中，所述第二抗体为杂交瘤细胞株CGMCCNO.5714产生的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述在步骤(1)中，将样品与本发明第五方面所述的抗体接触后，在反应体系中再加入抗所述第一抗体的第三抗体，并且在步骤(2)中检测“抗原-第一抗体-第三抗体”复合物的形成。

在另一优选例中，所述第一抗体、所述第二抗体或所述第三抗体上带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记为生物素标记、胶体金标记、辣根过氧化物酶标记、放射性核素标记、荧光素标记。

在另一优选例中，所述样品包括：人或动物组织样品、肿瘤切除样品、脱落细胞样品。

在另一优选例中，所述方法用于非诊断性的目的。

本发明的第十四方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的免疫偶联物。

在另一优选例中，所述的测试条还含有抗原点样区。

在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。

本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明第五方面所述的抗体；和/或

(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第五方面所述的抗体的二抗；和/或

(3)第三容器，所述第三容器中含有细胞裂解试剂；

或者，

所述试剂盒含有本发明第十四面所述的检测板。

在另一优选例中，所述第一容器中的抗体带有可检测标记。

在另一优选例中，所述第二容器中的抗体带有可检测标记。

本发明的第十六方面，提供了一种制备重组多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为HPV18E7单克隆抗体MAB-MAB-F2抗原结合特异性ELISA检测结果，具体实验细节见实施例1,2.2小节：MAB-F2能够特异的结合HPV18E7重组蛋白而与HPV16E7重组蛋白无结合。

图2为HPV18E7单抗结合抗原表位氨基酸序列区域ELISA检测结果,具体实验细节见实施例1,2.3小节：图2A为HPV18E7氨基酸序列示意图，图2B为ELISA检测结果图。MAB-F2能够结合His-HPV18E7重组蛋白以及多肽HPV18E7-1和HPV18E7-2，而不结合多肽His-HPV16E7重组蛋白。

图3为HPV18E7单克隆抗体蛋白结合亲和力分析ELISA检测结果图，具体实验细节见实施例1,2.4小节：His-HPV18E7包被浓度分别为8μg/ml、2μg/ml、0.5μg/ml、0.125μg/ml，MAB-F2孵育浓度从8μg/ml做倍比稀释，共七个梯度，代入K_aff＝(n-1)/2(n[Ab′]-[Ab])，共计算出六个K值，求平均值，最后算得MAB-F2蛋白水平亲合力为2.67nM。

图4为采用HPV18E7单克隆抗体MAB-F2对Hela细胞内源HPV18E7进行IP-WB检测的结果图，具体实验细节见实施例1，2.5小节：mIgG为阴性对照不能与肿瘤细胞裂解液中的HPV18E7结合。mAbMAB-F2能够与肿瘤细胞裂解液中的HPV18E7结合，因此在15KDa处有明显条带。其中50KDa和25KDa左右的条带是IP过程中使用抗体的重链和轻链。

图5为HPV18E7单抗免疫细胞化学染色检测结果图，具体实验细节见实施例1,2.6小节：A为C-33A细胞染色结果,B为Hela细胞染色结果，C为CaSki细胞染色结果，单克隆抗体MAB-F2与Hela细胞有的强的染色反应，而与C-33A细胞和CaSki细胞无染色。

图6为不同固定液固定的宫颈癌细胞株C-33A和Hela细胞采用HPV18E7特异性单克隆抗体MAB-F2的染色的免疫细胞化学染色结果图；具体实验细节见实施例2；C-33A细胞与HPV18E7单抗MAB-F2无免疫反应；两种细胞混合后，HPV18E7单抗MAB-F2使占细胞总数10％的Hela色(红色箭头处)而阴性细胞C-33A无染色；悬浮固定的100％的Hela细胞与HPV18E7单抗MAB-F2有强免疫反应。4％多聚甲醛和LBC固定液对HPV18E7单克隆抗体MAB-F2在ICC检测中的特异性无影响。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种抗HPVE7单克隆抗体MAB-F2，实验结果表明，该针对HPVE7蛋白的单克隆抗体，特异性高，亲和力强,能够显著区分出细胞中的HPV18E7蛋白。该单克隆抗体能够特异性地与HPV18E7蛋白进行结合，但是与HPV16E7蛋白无结合活性，因此该抗体不仅能够用于检测HPV18E7蛋白，还能够用于鉴别不同的HPV类型。本发明还提供了检测和/或鉴定HPV18E7蛋白的方法，该方法稳定性好，检测灵敏度极高。本发明还提供了包含上述抗体的试剂盒以及检测板。

具体地，本发明采用重组GST-HPV18E7融合蛋白免疫小鼠，使用另一种融合蛋白His-HPV18E7做为筛选检测抗原。筛选出阳性杂交瘤克隆株，均可分泌抗体IgG，并且均可结合重组蛋白His-HPV18E7，在ELISA检测中呈特异性结合HPVE7融合蛋白。

除了ELISA结合重组蛋白抗原的鉴定，阳性单克隆抗体进一步经过抗原结合表位分析，Affinitybindingcharacterization，WesternBlot，免疫沉淀，免疫细胞化学染色(ImmunocytochemistryICC)，组织切片免疫染色(ImmunohistochemistryIHC)方法鉴定。通过以上鉴定试验,1株抗体克隆株MAB-F2通过了检验要求，显示了蛋白分子水平、细胞水平、组织水平特异性结合高危型HPVE7癌蛋白的功能。

为筛选出具有临床检验价值的抗体试剂，该单克隆抗体又进一步经过用于宫颈癌细胞株的检测试验。最终获得了一株能够特异性识别HPV18E7阳性宫颈上皮细胞的单克隆抗体，基于该抗体的特异性开发了能够区分宫颈上皮癌细胞和正常细胞的方法，这些方法就灵敏度而言足以鉴定那些早期宫颈癌患者，就特异性而言足以区分正常和恶性肿瘤细胞。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV16E7蛋白的氨基酸序列如下：

HGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQIDNO.:1)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV18E7蛋白的氨基酸序列如下：

MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQIDNO.:2)。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIHPubl.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本发明还包括具有所述的抗HPV18E7蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗HPV18E7蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的HPV16E7蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗HPV18E7蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')₂片段；抗体重链；抗体轻链。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementaritydeterminingregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括以下三个互补决定区CDR：

CDR1，其氨基酸序列为GFTFNRYD(SEQIDNO.:4)，其编码核苷酸序列为，ggattcactttcaatagatatgac(SEQIDNO.:3)；

CDR2，其氨基酸序列为IRNDGSKT(SEQIDNO.:6)，其编码核苷酸序列为，atcagaaatgatggtagtaagact(SEQIDNO.:5)；

CDR3，其氨基酸序列为TRDSYGTVFAY(SEQIDNO.:8)，其编码核苷酸序列为，acaagggactcctatggtaccgtgtttgcttac(SEQIDNO.:7)。

在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：

LVQSGGGSVKPGGSLKLSCAASGFTFNRYDMSWFRQSPEKRLEWVAEIRNDGSKTHYSDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCTRDSYGTVFAYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO.:10)；

其编码核苷酸序列为：

Ctggtgcagtcagggggaggctcagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcaatagatatgacatgtcttggtttcgccagtctccagagaagaggctggagtgggtcgcagagatcagaaatgatggtagtaagactcactattcagacactgtgacgggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctggaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtacaagggactcctatggtaccgtgtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcag(SEQIDNO.:9)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：

CDR1'，其氨基酸序列为QSLLYSNGKTY(SEQIDNO.:14)，其编码核苷酸序列为，cagagcctcttatatagtaatggaaaaacctat(SEQIDNO.:13)；

CDR2'，其氨基酸序列为LVS(SEQIDNO.:16)，其编码核苷酸序列为，ctggtgtct(SEQIDNO.:15)

CDR3'，其氨基酸序列为VQGTHFPQT(SEQIDNO.:18)，其编码核苷酸序列为，gtgcaaggtacacattttcctcagacg(SEQIDNO.:17)

在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：

VMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFPQTFGGGTKLEIK(SEQIDNO.:20)，

其编码核苷酸序列为：

gtcatgacccagactccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctctatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttatatagtaatggaaaaacctatttgaattggttattacagaggccaggccagtctccaaagcgcctaatctatctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcaggaacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttattactgcgtgcaaggtacacattttcctcagacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaac(SEQIDNO.:19)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合HPV18E7蛋白的抗体，例如具有重链可变区(如SEQIDNO.:10的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQIDNO.:20的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

在另一优选例中，所述的抗体为抗HPV18E7蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有HPV18E7蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO.:3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQIDNO.:3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO.:10和/或SEQIDNO.:20所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancermetastasisreviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(CancerImmunologyandImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(CancerImmunologyandImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(CancerResearch)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancerletters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(JournaloftheAmericanChemicalSociety)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Genetherapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancerresearch)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合HPV16E7蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

杂交瘤细胞株

本发明还提供了可生产本发明针对HPVE7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的针对HPV18E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在获得生产本发明的HPVE7蛋白单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。

单克隆抗体的制备

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstituteCellDistributionCenter，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自AmericanTypeCultureCollection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodiesProductionTechniquesandApplications)，51-63页(MarcelDekker，Inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(PrinciplesandPractice)，AcademicPress(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(proteinA-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

本发明提供了一种针对HPVE7蛋白的单克隆抗体，特别是针对HPV16E7蛋白的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(ProteinG-Sephrose)纯化。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(ProteinG-Sephrose)纯化。

标记的免疫球蛋白

在本发明的一个优选例中，所述免疫球蛋白带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，HPV18E7蛋白的单克隆抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单克隆抗体。

本发明的HPV18E7蛋白单克隆抗体具有很好的特异性，很高的效价。

检测板及其材料

本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制成。

本发明检测HPV18E7蛋白的免疫检测板，包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记的HPVE7蛋白单克隆抗体或多克隆抗体，优选被胶体金标记的HPVE7蛋白单克隆抗体，硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；

在一个优选的方案中：层析材料上预包被胶体金标记的HPVE7蛋白单克隆抗体是采用浓度为0.5-1.5mg/ml胶体金标记的HPVE7蛋白单克隆抗体溶液进行预包被的，包被量为50μl/cm²；优选的浓度为0.5或1.5mg/ml，50μl/cm²；

检测方法与结果判定

平放检测板，将试样滴在滤样纸上，试样约120μl，3～5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。

阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；

阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；

无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。

方法和样本

本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测宫颈癌的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中HPV癌蛋白的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本，正如在液基细胞检测法中所使用的。

本发明可以用于HPV感染相关癌症中HPV癌蛋白的检测，其中HPV感染相关的癌症例如宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤以及这些癌症的前期阶段。

根据本发明，使用HPV癌蛋白分子标记可以支持或甚至取代细胞学和/或组织学检测方法。在特殊病例中，蛋白分子标记可以被用作诊断工具而不需要进一步的基于细胞的形态检测的支持。在没有基于细胞信息支持的情况下，仅仅在蛋白分子水平上对癌症的诊断方法受限于病例，其中标记或标记的水平应该对将要检测的情况有特异性。本发明所采用的生物标记是HPV癌蛋白，该生物标记来源于病毒，因为组织中病毒存在的标记特性不会发生在未感染的人组织中，因此对HPV感染的检测可以在样本溶液中完成。

本发明中所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本可以包括固定的或保存的细胞或组织样本。细胞或组织样本可以例如被保存在标准的样本收集、储存或运输介质中，例如那些本领域技术人员已知的商业可以获得保存介质(福尔马林、Cytyc“PreservCyt”或TripathImaging“Cytorich”等)。合适的细胞保存介质可以包括一个或多个选自醇、醛、酮、酸、金属离子或汞、醚等的用于保存细胞组分的混合物。醇包括甲醇、乙醇、(正或异)丙醇、(正、异或叔)丁醇或高支链或无支链的醇。醛包括甲醛、乙醛、戊二醛等。也可以使用诸如丙酮的酮类。在标准的样本介质中使用的酸包括有机酸(乙酸、三氯乙酸、水杨酸和苦味酸)或诸如铬酸的无机酸。标准的样本溶液中可以包括金属例如银、铜、铬、汞、锇和铀。诸如乙酸铀酰、二铬酸钾、硫酸铵等的盐溶液可以是保存介质的组分。

另外，在本文公开的方法中可以使用获得后立即进行细胞裂解的样本。样本获得后立即进行裂解，在此过程中形态学信息已丢失，而样本的蛋白分子信息被保存。样本可以直接从个体的躯体转移到含有合适的去垢剂和保存剂的溶液中。在裂解介质中使用合适的试剂，可以保存原材料的分子组分，并且不发生降解。例如通过使用酶抑制剂而是酶活力降解最小化。因此，在该裂解介质中的检测样本的溶液可以在溶解时显示检测样本的蛋白分子特性。

根据本发明，样本可以溶解在任何合适的裂解介质中。该裂解介质例如可以是尿素、甲酰胺，去垢剂的水溶液，例如阴离子去垢剂(如SDS，N-十二烷醇肌酸钠，去氧胆酸钠，烷芳基磺酸盐，长链(脂肪族)醇硫酸盐，烯烃硫酸盐和磺酸盐，α-烯烃硫酸盐和磺酸盐，硫酸盐甘油—酸酯，硫酸醚，硫代琥珀酸盐，链烷基磺酸盐，磷酸酯，烷基异硫代硫酸盐，蔗糖酯)，阳离子去垢剂(如，氯化十六烷基三甲基铵)，非离子去垢剂(如，吐温20，NonidetP-40，TritonX-100，NP-40，lgepalCA-630，N-辛基-配糖物)或两性去垢剂(如，CHAPS，3-十二烷基-二甲基胺-丙烷-1-磺酸，十二烷醇二甲基胺氧化物)和/或氢氧化物碱，例如氢氧化钠或氢氧化钾。通常任何合适的液体可以用作本发明裂解介质的溶剂。液体可以是有机或无机的，并且可以是纯液体，液体混合物或含物质溶液的液体并可以含有其他物质以增强溶剂的性质。在本发明的实施方案中，裂解介质的配方是50mMTris-HCl,150mMNaCl,1％NP-40,0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS。

根据本发明用于溶解样本的裂解介质可以进一步含有一个或多个防止原材料中组分降解的试剂。该组分例如包括酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂。在本发明的实施方案中，样本直接裂解。蛋白酶抑制剂例如可以包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，天门冬氨酸蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，酸性蛋白酶抑制剂，碱性蛋白酶抑制剂或中性蛋白酶抑制剂。在本发明的实施方案中，蛋白酶抑制剂采用的是Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)，Leupeptin(亮抑制肽)，(抑蛋白酶肽)以及100μg/mlPMSF(苯甲基磺酰氟)。

试剂盒

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明进一步设计用于检测HPV癌蛋白水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别HPV癌蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPVE7抗体，更优选是抗HPV16E7抗体。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

本发明进一步设计开发用于对来自溶液样本的HPV感染相关情况诊断评估的试剂盒，该试剂盒可以检测存在于样本溶液中的HPV癌蛋白，其中保存样本的细胞保存液可以是诸如液基细胞检测法中的细胞保存液。将细胞溶解在合适的裂解介质中，并且被用于开发在基于非细胞分析基础上的对来自溶解的样本的HPV感染相关肿瘤进行检测的检测试剂盒和体外诊断装置。

本发明的目的之一在于提供一种检测HPV18E7蛋白表达的方法，并且所述的方法可用于检测HPV感染相关癌症特别是宫颈癌的检测。

本发明的发明人等制作了针对人乳头瘤病毒HPV18E7蛋白质的单克隆抗体MAB-F2并研究其反应性，该单克隆抗体的抗原结合表位肽为氨基酸44-58位之间,其中包括氨基酸序列VNHQHLPARRAEPQR。使用此抗HPV18E7单克隆抗体MAB-F2对不表达HPV的宫颈癌细胞株C-33A及表达HPV16E7的人宫颈癌细胞系CaSki和表达HPV18E7的人宫颈癌细胞株Hela进行免疫细胞化学染色，结果发现：MAB-F2与HPV18E7阳性细胞Hela表现出了强的染色反应，与HPV16E7阳性细胞CaSki及不表达HPV蛋白的C-33A细胞反应。

进而，本发明的发明人等使用所制作的抗HPV18E7单抗MAB-F2对4％多聚甲醛或LBC固定液固定数日的宫颈癌细胞系进行免疫细胞化学染色。在不含有HPVDNA的人宫颈癌细胞株C-33A中未检测到HPV18E7的表达，当Hela细胞和C-33A细胞按比例(1:9)混合后，当阳性肿瘤细胞比例低至10％时，通过检测肿瘤细胞内部的HPV18E7，MAB-F2也可特异性地检测出阳性肿瘤细胞的存在，并且两种固定液对阳性和阴性结果的判断无影响。根据该发现结果，本发明的发明人完成了本发明。

也就是说，本发明的方法是检测肿瘤标记物的方法，其特征在于：包括检测样本中的HPV18E7的步骤。

在本发明的方法中，所述检测样本优先是从检体采集的脱落细胞、或该组织的培养物或该组织的切片，也可以是由从检体采集的组织或该组织的培养物所制备的悬浮细胞。另外，所述细胞优选的是宫颈脱落细胞。

本发明的方法中，所述检体优选是有可能患宫颈病变的患者，也可以是宫颈已经发生病变的患者。

所述HPV18E7优选是HPV18E7蛋白质或其片段。在此情况时，检测所述的HPV18E7的步骤优选是使用HPV18E7的免疫细胞化学染色分析。所使用的抗HPV18E7抗体优选是抗HPV18E7单克隆抗体。

所述方法免疫检测所采用的来自HPV18E7癌基因表达的蛋白作为HPV18相关的恶性或恶变前细胞发生的可靠指标。本发明最有用的方面之一是在对子宫颈癌、鳞状上皮细胞和腺癌及与致癌HPV18感染相关的任何上皮细胞异常的诊断中的应用，所示的致癌HPV18感染包括中空细胞病；角化过度症；包括上皮内瘤形成或上皮内病变的癌前期病症；高度发育不良；和侵染行或恶性癌症。除宫颈癌外，对HPV18E7的检测对检测膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤也是有用的。

本发明的另一个目的通过本发明的方法提供一种检测试剂盒。该试剂盒可以是诊断试剂盒或研究试剂盒。

本发明的试剂盒是用以检测肿瘤标记物的试剂盒，其特征在于具有抗HPV18E7单克隆抗体。本发明的试剂盒优先是还具有用以检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV18E7抗体，更优选是抗HPV18E7单克隆抗体，尤其优选是由杂交瘤MAB-F2产生的小鼠抗HPV18E7单克隆抗体或是与该小鼠抗HPV18E7单克隆抗体具同等的结合活性的单克隆抗体。

本发明提供了一种方法通过检测细胞内源的HPV18E7蛋白区分HPV18E7感染的肿瘤细胞和不含HPVDNA的肿瘤细胞。这种方法基于当HPV18E7阳性肿瘤细胞占细胞总数的10％时仍能够准确的被检出，并且当细胞在临床广泛采用LBC固定液中固定后仍能准确的检测出阳性细胞，从而能够在癌症演变的早期作出诊断，为及时治疗提供依据。

进一步，本发明还提供一种采用该检测方法所形成的检测试剂盒。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供的针对HPV18E7蛋白的抗体，特异性高，亲和力强，并且可以大量制备、单克隆抗体质量容易控制。

(2)本发明提供的针对HPV18E7蛋白的抗体能够特异性的与HPV18E7蛋白进行结合，但是不与HPV16E7蛋白结合，因此该抗体不仅能够用于检测HPVE7蛋白，还能够用于鉴别不同的HPV类型。

(3)本发明提供的检测HPVE7蛋白的方法中使用本发明提供的抗体，稳定性好，检测灵敏度极高，与HPV18E7蛋白的结合亲和力达到了2.67nM。

(4)本发明提供的单克隆抗体以及检测方法，适用于相关癌症的早期诊断和大规模的病人筛查，并可用于监测复发病人。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.人乳头瘤病毒HPV18E7单抗制备

1.1动物免疫

取6-8周雌性BALB/C小鼠，免疫原为GST-HPV18E7蛋白，免疫程序见表1。每次免疫前进行小鼠断尾采血，采用Hi_s-HPV18E7作为检测抗原包被间接ELISA法检测小鼠血清效价。待免疫小鼠血清效价滴度达到最大并不再升高时取脾细胞进行融合。

表1小鼠免疫程序

1.2细胞融合与培养

按常规方法收集免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，融合比率脾细胞：SP2/0＝5:1，融合细胞分装于96孔培养板，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中选择性培养。融合后用HAT培养基全换液3次；待杂交瘤细胞长满一个显微镜视野时，进行ELISA检测。

1.3阳性杂交瘤的筛选

检测时，采用间接ELISA筛选：抗原选用His-HPV18E7融合蛋白，2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入杂交瘤上清并设置阳性(P)、阴性(N)及空白对照(空白直接加入酶标二抗)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗(SigmaA2554)(1:10000)37℃反应45～60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2MH₂SO₄终止。

ELISA筛选结果以OD值大于0.6的为出阳性孔，并进行复检。经过两次连续检测为阳性后，将该阳性孔细胞进行扩增，及时冻存和亚克隆。

1.4杂交瘤细胞系的建立

对于2次筛选都为阳性的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，取一块96孔细胞培养板，每孔中加入150μlHAT培养液；对需亚克隆的阳性孔轻轻吹打悬浮，吸取100μl细胞悬液加到96孔细胞板中，从第一孔开始倍比稀释。细胞计数选取孔中约有100个细胞的孔并加入到含有6mlHAT培养液的加样槽中，按100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加前三列；再补加HAT培养基3ml，100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加中三列；再补加HAT培养基5ml，100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加后六列。计算每块板的阳性率达到100％时，可以得到稳定细胞株。转移到细胞培养板中，扩大培养并大量冻存。

经过筛选后得到一株阳性杂交瘤细胞株MAB-F2。

1.5单克隆抗体的大量生产(腹水制备)

大量培养杂交瘤细胞(MAB-F2)，8-10周龄的BALB/C雌性小鼠预先用液体石蜡致敏，然后腹腔注射1x10⁶杂交瘤细胞/只，约10天左右待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水。收获的腹水用His-HPV18E7包被通过ELISA检测腹水效价达到1：10,000以上。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以ProteinG亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，用磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用紫外分光光度计OD260,280测定抗体蛋白浓度为0.7-1.5mg/ml，间接ELISA检测结果表明：纯化的单克隆抗体的效价在1:10000以上。

2.单抗的鉴定

2.1单抗Ig亚类的鉴定：

纯化单抗采用PBS1:10000稀释，按照Sigma公司的亚型鉴定试剂盒说明书操作，单抗MAB-F2为IgG1。

2.2ELISA检测anti-HPV18E7单克隆抗体特异性及交叉反应：

抗原分别选用His-HPV18E7(HPV18E7氨基酸序列SEQIDNO.:2MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ)和His-HPV16E7(HPV16E7氨基酸序列SEQIDNO.:1HGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP)融合蛋白，2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入anti-HPV18E7单抗MAB-F2(1μg/ml)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗(SigmaA2554)(1:10000)37℃反应45～60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2MH₂SO₄终止，OD450nm处读数。结果见图1：MAB-F2仅能够特异性的结合HPV18E7重组蛋白而与HPV16E7无结合。

2.3Anti-HPV18E7单克隆抗体的抗原结合表位分析

鉴定单克隆抗体在HPV18E7抗原蛋白中的表位氨基酸序列区域。采用ELISA方法进行鉴定：抗原选用多肽或重组蛋白，其中多肽分别为HPV18E7-1(氨基酸序列SEQIDNO.:11SDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRH),HPV18E7-2(氨基酸序列SEQIDNO.:12IDGVNHQHLPARRAEPQR),重组蛋白为His-HPV18E7和His-HPV16E7，蛋白抗原4μg/ml包板，多肽抗原2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入anti-HPV18E7单抗MAB-F2(1μg/ml)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗(SigmaA2554)(1:10000)37℃反应45～60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2MH₂SO₄终止，OD450nm处读数。结果见图2：由于MAB-F2能够结合多肽HPV18E7-1和HPV18E7-2，因此初步推测MAB-F2与HPV18E7的结合表位为41-55位氨基酸，而由于MAB-F2仅能特异性结合HPV18E7重组蛋白而不结合HPV16E7重组蛋白，而41-43位氨基酸在两种重组蛋白中同时存在，因此MAB-F2与HPV18E7结合氨基酸序列位于VNHQHLPARRAEPQR之间，即HPV18E7的第44-58位氨基酸之间。

2.4Anti-HPV18E7单克隆抗体蛋白结合亲和力分析

单克隆抗体蛋白结合亲和常数测定参照Beatty等人(J.DavidBeatty,BarbaraG.BeattyandWilliamG.Vlahos1987)建立的方法。His-HPV18E7蛋白以8μg/ml、2μg/ml、0.5μg/ml、0.125μg/ml浓度包被，四者浓度之比为1:4:16:64,加入一抗为MAB-F2抗体，浓度开始从8μg/ml做倍比稀释，共七个梯度，进行ELISA检测。将得到值代入公式K_aff＝(n-1)/2(n[Ab′]-[Ab])计算亲和常数，式中[Ab]和[Ab′]分别表示当抗原浓度为Ag和Ag’时，产生半数吸光值的抗体浓度，即通过作图法取曲线最大OD值一半(即OD50％)处对应的抗体浓度。式中n＝Ag/Ag’。然后两两比较，当n＝4时，可得到3个K值吗，n＝16时，得到2个K值，n＝64时可得到1个K值，求出6个K值的均数作为最终结果。结果如图3所示：计算得到MAB-F2与His-HPV18E7重组蛋白结合的的亲和力2.67nM。

2.5IP-WB检测单抗结合肿瘤细胞内源HPV18E7：

取5x10⁵文献报道的HPV18E7阳性的宫颈癌细胞株Hela细胞加入0.5ml含有1％TritonX-100,1mMEDTA，50mMNaCl，0.1(m/v)SDS，1％Sodiumdeoxycholate，1mMPMSF，2μg/mlAprotinin，1μg/mlLeupeptin和1μg/mlPepstain的细胞裂解液，其中所有的蛋白酶抑制剂在临用前加入。细胞置于冰上裂解30min后，12500rpm，4℃离心10min，收集上清，即为目的蛋白提取物。

在细胞裂解上清中分别加入2μg单克隆抗体MAB-F2或mIgG，4℃孵育两小时，再加入15μlproteinA/Gbeads4℃孵育过夜。第二天，采用不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液洗beads两遍后，加入1xSDS上样buffer，进行免疫印迹检测，采用NC膜，100V电压，转膜35min。5％脱脂奶粉封闭2h后，加入5％脱脂奶粉稀释的MAB-F2或mIgG蛋白，抗体使用浓度为2μg/ml，4℃孵育过夜，采用含0.1％Tween的TBS洗涤4次后，加入Anti-MouseIgG(Fcspecific)-peroxidaseantibody(SigmaA2554)(1：1000)，室温孵育1h，DAB(武汉博士德SA2024)，显色，结果如图4所示，在箭头所指分子量为15KDa处，MAB-F2抗体特异的识别Hela细胞内源的HPV16E7蛋白。

2.6免疫细胞化学染色检测宫颈癌细胞系中的HPV18E7的表达：

表达HPV18E7蛋白的宫颈癌细胞株Hela细胞，表达HPV16E7蛋白的宫颈癌细胞株CaSki细胞和不含HPVDNA的宫颈癌细胞株C-33A细胞用单克隆抗体MAB-F2进行免疫细胞化学染色试验。具体实验方法如下：

CaSki，Hela，C-33A细胞分别种植于poly-L-Lysine处理过的盖玻片上37℃，5％CO₂培养24h，将盖玻片取出采用4％多聚甲醛固定液室温固定30min；加入TBS洗液洗5min，甩干；加入含0.3％TritonX-100的TBS缓冲液室温放置15min使细胞膜通透；加入TBS洗液洗5min，甩干；为了使内源过氧化物酶失活加入含1％H₂O₂的TBS缓冲液室温处理5min，甩干；加入TBS洗液洗5min，甩干；加入10％FBS/TBS封闭液封闭过夜，甩干；加入mAbanti-HPV18E7MAB-F2(5μg/ml)37℃孵育2h；加入TBS/0.1％Tween洗液洗5次，每次5min，甩干；加入Anti-MouseIgG(Fcspecific)-peroxidaseantibody(SigmaA2554)(1:1000)二抗37℃孵育1h；加入TBS/0.1％Tween洗液洗5次，每次5min，甩干；加入DAB显色液(北京中杉金桥ZLI-9017),室温反应10min，蒸馏水洗涤终止反应。显微镜下观察结果并记录。

结果见图5，显微镜下检测显示：HPV18E7单克隆抗体MAB-F2仅与表达HPV18E7蛋白的宫颈癌细胞株Hela有强的免疫化学染色反应，而与表达HPV16E7的CaSki细胞和不表达HPV蛋白的宫颈癌细胞株C-33A无,染色反应。与之前的ELISA检测结果一致，即MAB-F2与细胞内源的HPV18E7有强的结合能力，即能够特异的识别细胞内源的HPV18E7蛋白。

实施例2

免疫细胞化学染色检测HPV18E7单克隆抗体MAB-F2在悬浮固定的宫颈癌细胞系中的特异性：

表达HPV18E7蛋白的宫颈癌细胞株Hela细胞和不含HPVDNA的宫颈癌细胞株C-33A细胞经不同细胞固定液固定后采用单克隆抗体MAB-F2进行免疫细胞化学染色试验。具体实验方法如下：

分别收集C-33A细胞和Hela细胞，采用4％多聚甲醛或LBC固定液固定数日，取总数为50000个细胞，其中宫颈癌细胞Hela细胞与阴性对照C-33A细胞以一定比例混合，Hela细胞与C-33A细胞数目的比例为1:9,1:19,1:49,1:99,1:499,1:999。混合后置于poly-L-Lysine处理过的盖玻片上室温风干，使细胞固定于盖玻片上；加入TBS洗液洗5min，甩干；加入含0.3％TritonX-100的TBS缓冲液室温放置15min使细胞膜通透；加入TBS洗液洗5min，甩干；为了使内源过氧化物酶失活加入含1％H₂O₂的TBS缓冲液室温处理5min，甩干；加入TBS洗液洗5min，甩干；加入10％FBS/TBS封闭液封闭过夜，甩干；加入mAbanti-HPV16E7MAb-F2(2μg/ml)37℃孵育2h；加入TBS/0.1％Tween洗液洗5次，每次5min，甩干；加入Anti-MouseIgG(Fcspecific)-peroxidaseantibody(SigmaA2554)(1:1000)二抗37℃孵育1h；加入TBS/0.1％Tween洗液洗5次，每次5min，甩干；加入DAB显色液(北京中杉金桥ZLI-9017),室温反应10min，蒸馏水洗涤终止反应；加入苏木素染色液(碧云天C0107)染色2min，浸自来水中冲洗去多余的染色液，约10min，蒸馏水再洗涤一遍(数秒)，显微镜下观察结果并记录。

显微镜下检测显示：HPV18E7特异性单克隆抗体MAB-F2仅与表达HPV18E7蛋白的宫颈癌细胞株Hela有强的免疫化学染色反应，而与不含HPVDNA的宫颈癌细胞株C-33A无免疫学染色反应。当Hela细胞与C-33A细胞数目1:9混合后，MAB-F2能够特异地结合Hela细胞而与C-33A细胞无结合，即阳性肿瘤细胞占总细胞数10％时MAB-F2仍能够准确的区分中阴性和阳性细胞。另外采用4％多聚甲醛或LBC固定液固定细胞对ICC检测中阴性和阳性染色的判断无影响。

因此，结果表明当肿瘤细胞采用4％多聚甲醛或LBC固定液预先固定数日后，HPV18E7单抗MAB-F2仍能特异性的检测出肿瘤细胞内部的HPV18E7蛋白,即固定液处理细胞数日未对免疫细胞化学染色结果产生如染色减弱或背景增强的影响。另外当HPV18E7细胞比例低至10％时，MAB-F2抗体仍能够准确的检测中靶细胞，说明该检测方法具有很好的特异性和灵敏度。由于临床上目前使用广泛的LBC检测技术，能够提供剩余的细胞样本供其他HPV感染分析，而在该实施例中，采用LBC固定数日后仍能准确的检测出HPV18E7相关的宫颈癌细胞，因此该方法可进一步开发用于临床HPV18E7持续感染导致的相关恶性肿瘤的检测。

讨论：

本发明人采用上述方法制备HPV18E7单克隆抗体，对1000多株细胞进行筛选，共筛到8株特异性较好的，与HPV16E7蛋白无交叉反应的细胞株，亚克隆后5株转阴，3株仍然为阳性。最终，只有单克隆抗体MAB-F2能够IP-WB检测和免疫细胞化学检测，在临床检测应用上具有非常大的价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。