半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白及其应用

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎补体成分C5a(CsC5a)的重组蛋白及其应用。半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补体成分CsC5a基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白。本发明补体成分CsC5a重组蛋白能够显著促进免疫细胞吞噬作用，提高鱼类的抗细菌或抗病毒能力。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎补体成分C5a (CsC5a)的重组蛋白及其应用。

背景技术

补体因子5(Complementfactor5,C5)是补体系统的一个成分。 人类C5蛋白由α、β两条多肽链通过二硫键组成,分子量为190 kDa。C5靠近N端的第74-75位精氨酸-亮氨酸键为C5转化酶作用的部 位。补体系统通过三条途径(经典途径、旁路途径和凝集素途径)激 活后，均生成C5转化酶。C5蛋白在C5转化酶的作用下裂解为C5a和C5b 两个片段。C5a是C5的α链的N端约8-10kD的肽段，是炎症反应的重要 介质和趋化因子。C5a通过与细胞表面的C5a受体结合而激活相应的信 号通路，剌激白细胞产生呼吸爆发、趋化效应等炎症反应，从而辅助 激活机体的先天性免疫，促进获得性免疫应答。目前，C5和C5a已经 在虹鳟和鲤鱼等鱼类中报道，但是它们在鱼类中的应用性研究尚缺 乏。

发明内容

本发明目的在于提供一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白及 其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白，半滑舌鳎补体成分C5a 的重组蛋白以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR 扩增补体成分CsC5a基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白， 所述C5F1为5’-GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA-3’；C5R1 为5’-GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT-3’。

一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎补 体成分C5a的重组蛋白可用于制备增强外周血淋巴细胞的吞噬作用 的制剂。

一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎补 体成分C5a的重组蛋白可用于制备抑制细菌或病毒感染的制剂。

细菌为哈氏弧菌，是鱼类常见的致病性细菌，能感染多种养殖鱼 类包括牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎等。

病毒为细胞肿大病毒，是一种严重危害养殖鱼类的病毒，能感染 大菱鲆、条石鲷、半滑舌鳎等。

本发明具有如下优点：本发明的补体成分C5a重组蛋白，能够显 著提高外周血淋巴细胞的吞噬能力和增强鱼类的抗细菌及抗病毒能 力。

附图说明

图1为本发明实施例提供的重组补体成分C5a(命名为rCsC5a) 电泳图。泳道1，分子量标准；泳道2,补体成分rCsC5a。

图2为本发明实施例提供的重组补体成分rCsC5a的促吞噬作用。 A,半滑舌鳎外周血淋巴细胞(peripheralbloodleukocytes，PBL)。 B，PBL+FITC-标记的哈氏弧菌。C,PBL+FITC-标记的哈氏弧菌 +rCsC5a。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进 行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用 “天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.大肠杆菌用Hanahan方法(SambrookandRussell:Molecular Cloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratory Press2001)。

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公 司”，北京。

实施例1

补体成分C5a重组蛋白rCsC5a的制备

1)表达补体成分C5a重组蛋白rCsC5a的质粒pCsC5a的构建：

本发明的补体成分rCsC5a为半滑舌鳎补体成分C5的一部分(氨 基酸685-751)，C5序列已公布(GenBankaccessionnumber XP_008334663.1)。

CsC5a由67个氨基酸组成，具有典型的anaphylatoxin结构。

以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补 CsC5a基因。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s, 62℃60s,72℃65s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR 产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(构建过程参见 HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysis ofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).Fish ShellfishImmunol2010；28:678–86)用限制性内切酶EcoRV酶切 后回收5.3kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接， 连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(100ug/ml)的LB培养 基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pCsC5a。通过 DNA测序分析证明了pCsC5a为含有上述C5结构域的补体成分CsC5a 序列的表达质粒。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉, 1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述C5F1为5’- GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA-3’；C5R1为5’- GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT-3’。

2)rCsC5a的诱导表达和纯化

将上述的质粒pCsC5a用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购 自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml) 的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为 BL21/pCsC5a。将BL21/pCsC5a于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液 体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含 有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm 摇动培养至OD₆₀₀为0.6,加入终浓度为1mM的IPTG，16℃继续以转 速160rpm摇动培养16h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液， 加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变 澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中 的蛋白用亲和层析柱HisTrapHPColumns(购于美国GEHealthcare 公司)回收纯化。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压 下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分 子量大小(参见图1)。发现rCsC5a的蛋白质质量与补体成分CsC5a 相同。

所述裂解液为终浓度的10mMNaH₂PO₄、10mMTris和8M尿 素,pH8.0。

实施例2

rCsC5a的促吞噬作用

在LB培养基中培养哈氏弧菌(Vibrioharveyi)(保存于CGMCC，编 号为CGMCC1985)至OD₆₀₀为0.8,然后离心(5000g，40C，10min)， 收集菌体，将其悬浮于100ug/mlfluoresceinisothiocyanate(FITC) (购于天根生化科技(北京)有限公司”)中至终浓度为1×10⁸cfu/ml， 37℃保温2h，然后用上述方法离心收集菌体。将菌体悬浮于L－ 15-medium(购于ThermoScientificHyClone,北京)中至终浓度 为1×10⁸cfu/ml，即为FITC-标记细菌。利用Percoll方法制备半 滑舌鳎外周血淋巴细胞(peripheralbloodleukocytes，PBL)，具 体参见文献ZhouZX,ZhangJ,SunL.Poly(I:C)inducesantiviral immuneresponsesinJapaneseflounder(Paralichthysolivaceus) thatrequireTLR3andMDA5andisnegativelyregulatedbyMyd88. PLoSOne2014；9:e112918。将细胞置于含有L－15-medium的1.5ml 离心管中(每管107个细胞)，每管加入100ul上述FITC-标记细菌 和上述实施例1纯化的rCsC5a至终浓度为40ug/ml。对照细胞加入 同样体积的PBS。将细胞于22℃暗处保温1h，然后用上述方法离 心收集菌体。将菌体悬浮于1ml0.125％台盼蓝(购于北京索莱宝科 技有限公司),22℃保温5min，然后用上述方法离心收集菌体。将 菌体悬浮于1mlPBS。随后用常规的流式细胞仪(PartecGmbH, Munster,Germany)检测吞噬。具体参见文献ZhouZJ,SunL.CsCTL1, ateleostC-typelectinthatpromotesantibacterialand antiviralimmunedefenseinamannerthatdependsonthe conservedEPNmotif.DevCompImmunol2015；50:69–77。结果表 明，与没有rCsC5a处理的PBL的吞噬值(M1＝23.5％)相比，用rCsC5a 处理的PBL的吞噬值(M1＝43.5％)显著上升(参见图2)，说明rCsC5a 对PBL吞噬细菌有显著促进作用。

所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl, 0.358％Na₂HPO₄.12H₂O,0.024％NaH₂PO₄，余量为水。

实施例3

rCsC5a的抗菌作用

将上述实施例1纯化的rCsC5a蛋白在PBS中稀释至100ug/ml， 即为rCsC5a稀释液。在LB培养基中培养哈氏弧菌至OD₆₀₀为0.8,然 后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终 浓度为2×10⁶cfu/ml，即为细菌悬液。将细菌悬液与rCsC5a稀释 液或PBS(对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约12.7g) 随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为A和B。将A组的 每条鱼分别注射100ul细菌+rCsC5a稀释液，将B组(对照组)的每 条鱼分别注射100ul细菌+PBS。在注射后第24h，取A和B组鱼脾 脏组织，在1mlPBS中匀浆，稀释后将50ul匀浆液涂布于LB平板。 将平板置于28℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明，A组鱼脾 脏的细菌数(43±5)显著(P<0.01)低于B组鱼脾脏的细菌数(118 ±12)

这些结果表明，本发明的补体成分rCsC5a能够显著增强鱼类抵 抗细菌侵染。

实施例4

rCsC5a的抗病毒作用

将细胞肿大病毒RBIV-C1(具体制备方法见ZhangM,XiaoZ,Hu Y,SunL.Characterizationofamegalocytivirusfromcultured rockbream,Oplegnathusfasciatus(Temminck&Schlege),in China.AquacRes.2012；43:556–64)于PBS中稀释至10⁶copies/ml， 即为病毒悬液。将上述实施例1纯化的rCsC5a蛋白在PBS中稀释至 100ug/ml，即为rCsC5a稀释液。将病毒悬液与rCsC5a稀释液或PBS (对照)等体积(1：1)混合。将20条半滑舌鳎(重约12.7g)随 机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为C和D。将C组的每 条鱼分别注射100ul病毒+rCsC5a稀释液，将D组(对照组)的每条 鱼分别注射100ul病毒+PBS。在注射后第3天，取鱼脾脏组织。利 用DNA提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从组织中 提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述 参考文献)。结果表明，C组鱼脾脏的病毒数(257±14)显著(P<0.01) 低于D组鱼脾脏的病毒数(4.16x10⁴±5076)。

这些结果表明，rCsC5a能够显著增强鱼类抵抗病毒的侵染。