具抗肿瘤活性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂MPGF和MPGH及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了具抗肿瘤活性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR？TKI)MPGF和MPGH及其制备方法和应用。本发明通过对PD153035的化学结构进行优化和改进，得到了全新的EGFR？TKI，命名为MPGF(式I)和MPGH(式II)，研究表明本发明合成的EGFR？TKI—MPGF和MPGH能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，与PD153035相比，对突变EGFR肺癌细胞系PC-9具有更强的抑制增殖作用，因此在临床上可作为抗肿瘤剂应用。此外，本发明还公开了制备所述具抗肿瘤活性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂MPGF和MPGH的方法。本发明的提出为肿瘤治疗，特别是非小细胞肺癌的治疗提供了一种有效的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及喹唑啉类化合物，尤其涉及具有抗肿瘤活性的EGFRTKI—MPGF和 MPGH及其制备方法，本发明还涉及该药作为抗肿瘤剂的应用，属于生物医药领域。

背景技术

目前发现的EGFR酪氨酸激酶(EGFRTK)可以催化ATP的高能磷酸键转移到 EGFR的数个酪氨酸位点，使其磷酸化，从而激活下游的PI3K/Akt、Ras/MAPK等信 号通路，促进细胞进生长增殖、代谢，抑制细胞凋亡。细胞中EGFR过度表达和突 变时，会阻碍细胞程序死亡，使细胞的生长调节失控，而获得无限增殖和侵袭能力， 即发展成为恶性肿瘤细胞。EGFRTKI通过与ATP竞争胞内酪氨酸激酶的结合位点, 阻止受体内酪氨酸的自身磷酸化,抑制EGFR酪氨酸激酶激活,从而抑制肿瘤细胞 生长、加速肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成和肿瘤细胞浸润、转移。小分子EGFRTKI 的基本结构为喹唑啉胺。EGFRTKI可分为：1)可逆性TKI主要有：吉非替尼 (gefitinib)，厄洛替尼(erlotinib)，拉帕替尼(Lapatinib)，2)不可逆性TKI主要 有：阿法替尼(Afatinib)，达可替尼(Dacomitinib)。目前，可逆性和不可逆性 EGFRTKI对突变EGFR非小细胞肺癌短时间内具有显著的疗效，但最终均因产生 获得性耐药而导致治疗失败，并没有明显延长患者的生存期。因此，开发和研制具 有更强、更持久抗肿瘤活性的新型EGFRTKI将可能为突变EGFR非小细胞肺癌患者 带来生机。

发明内容

本发明的目的之一是研发全新的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)—MPGF和MPGH，其机制是通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化从 而促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成和侵袭、转移；

本发明的目的之二是发现MPGF和MPGH对突变EGFR肺癌细胞系具有较强的 抑制活性。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明通过对PD153035化学结构进行优化和改进，得到了全新EGFR TKI—MPGF和MPGH，其具有更好的水溶性和更小的毒副作用，同时对突变EGFR 非小细胞肺癌具有较强抑制活性，并阐明其机制是通过抑制肿瘤细胞表皮生长因子 受体酪氨酸激酶磷酸化，阻碍下游信号通路活化，从而抑制肿瘤细胞生长、增殖， 促进肿瘤细胞凋亡。

本发明的一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐，命名为 MPGF或MPGH，其中，所述的MPGF的分子结构式如式I所示，所述的MPGH的分 子结构式如式II所示:

当然，可以制备本发明化合物酸加成的盐，这些盐包括在本发明之中。

本发明化合物的酸加成盐优选为药学上可接受的，与适当的酸(例如盐酸、醋 酸、硫酸)形成无毒的盐，除了药物上可接受的盐以外，其它的盐也包括在本发明 之中。

进一步的，本发明还提出了所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可 药用的盐在制备促进肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。

其中，所述的促进肿瘤细胞凋亡是通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸 化而实现的。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞为EGFR突变的非小细胞肺癌细胞。

更进一步的，本发明还提出了一种制备以上所述的表皮生长因子受体酪氨酸激 酶抑制剂或其可药用的盐的方法，包括：

1)氮气保护下在反应瓶中加入10.0g3-甲氧基-4-羟基苯甲酸，19.0g碳酸钾，7.0g 氯化苄和80毫升乙腈，该混合物于90℃回流反应2小时，使用正己烷：乙酸乙酯体 积比＝4:1的混合物作为展开剂进行TLC分析；原料完全反应后，冷却抽滤，用150mL 乙酸乙酯洗涤滤饼，滤液旋干，进行柱层析分离，使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝5:1 的混合溶液进行洗脱，得到纯白色固体，即化合物一；

2)将53毫升浓硝酸和105毫升醋酸混合后冰浴降温至-5℃，将14.0g化合物一溶 于15ml醋酸中，然后将含有化合物一的醋酸溶液缓慢滴加进浓硝酸和醋酸的混合液 中，滴完后反应液升至20-25℃，反应16小时，进行TLC分析，原料完全反应后，反 应液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤，将有机相用饱和碳酸 氢钠溶液洗涤至碱性，再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤滤液旋干 得到白色固体，即化合物二，此产物可以直接用于下步反应；

3)氮气保护下将8.0g化合物二，12.0g铁粉，12.0g氯化铵，60ml水，120毫升甲 醇混合于75-85℃回流搅拌30分钟，TLC分析显示无原料，抽滤，用50毫升甲醇和50 毫升乙酸乙酯的混合溶液洗涤滤饼，滤液旋去溶剂，加入300毫升水中，用150毫升 乙酸乙酯萃取三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤后用无水硫酸镁干燥，抽滤旋干 得到棕色固体，即化合物三；

4)氮气保护下将5.8g化合物三，720mg甲酸铵，60ml甲酰胺混合于160℃回流反 应3小时后，冷却析出固体，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥得灰白色固体，即化合物 四；

5)将2.1g化合物四，9.1g三氯氧磷和60ml二氯乙烷混合于85℃回流反应1小时， 旋去三氯氧磷，加入冰水，用二氯甲烷萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，无水 硫酸镁干燥，抽滤旋干，进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝5:1、 3:1以及1:1的混合溶液进行梯度洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝1:1的洗脱液于得 到类白色固体，即化合物五；

6)氮气保护下将2.10g化合物五，3-氯-4-氟苯胺1.10g，异丙醇80ml混合于 80-90℃回流搅拌4-5小时，冷却抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，干燥后得淡黄色固体 3g，向该固体中加入氨水调节pH至碱性，用二氯甲烷萃取，饱和氯化钠洗涤后，无 水硫酸镁干燥，旋干得到淡黄色固体，即化合物六；

7)氮气保护下将2.4g化合物六溶于100ml甲醇和50mlTHF混合液中，加入1g5％ 钯碳，通入氢气20-25℃搅拌反应2.5h，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝10:1的混合溶液 作为展开剂进行TLC分析，原料反应完全后，抽滤，滤饼用二氯甲烷和甲醇混合液 浸泡洗涤，滤液旋干得到黄色粉末，即化合物七；

8)20.0g三缩四乙二醇和10.2g三乙胺加入反应瓶中，加入300ml乙腈，冰浴降温 至0-5℃，将19.0gTsCl溶入100ml乙腈缓慢滴入含有三缩四乙二醇和三乙胺的乙腈溶 液中，1h滴完，滴完后升至20-25℃下反应12-14h，旋去溶剂，进行柱层析分离，依 次使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝4:1以及1.5:1的混合溶液进行梯度洗脱，于正己烷： 乙酸乙酯体积比＝4:1的洗脱液中得到油状产品，即化合物十三，于正己烷：乙酸乙 酯体积比＝1.5:1的洗脱液中得到油状物，即化合物十四；

9)MPGH制备：氮气保护下，将1.50g化合物七，8.00g碳酸钾，120ml乙腈混合， 升温至90-98℃搅拌，将含有1.60g化合物十三的20ml乙腈溶液滴加进入该含有化合 物七的混合物中，30-60min加完，加毕于95℃继续反应1h，使用二氯甲烷：甲醇体 积比＝20:1的混合溶液作为展开剂进行TLC分析，原料反应完全后，冷却抽滤，用二 氯甲烷洗涤滤饼，滤液旋干过柱，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1、30:1以及 20:1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到油状 产物1.7g，制备色谱分离后得到纯产品，即化合物八，即为EGFRTKI-MPGH化合物；

10)MPGF制备：氮气保护下将0.50g化合物八溶入20mL二氯甲烷中，降温至-5℃ 加入0.24g三乙胺和0.12gDMAP，于-10℃加入0.93gTsCl，搅拌反应5-10min后撤去 冰浴，自然升至20-25℃反应3h，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的混合溶液作为 展开剂进行TLC分析，原料基本反应完全后，旋去溶剂后快速柱层析分离，依次使 用二氯甲烷：甲醇体积比＝50:1、40:1以及30:1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲 烷：甲醇体积比＝30:1的洗脱液中得类白色固体，将产物溶于二氯甲烷中，加入1mL 3.5MHCl/乙醇溶液成盐，旋去溶剂得到白色固体，即化合物九；

11)氮气保护下将3.60g化合物十四和0.85g氟化钾(KF)，2.70g氨基聚醚 (K222)以及30ml乙腈混合于90℃左右回流反应5h，旋干乙腈，加入乙酸乙酯， 用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥旋干后进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯 体积比＝3:1、2:1以及1:1的混合溶液进行梯度洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝1:1 的洗脱液中得到油状产品，即化合物十五；

12)氮气保护下将0.48g化合物九，2.76g碳酸钾，20ml乙腈混合加热至回流，将 0.55g化合物十五溶入10ml乙腈中缓慢滴入上述含有化合物九的混合液中，20-30min 加完，继续回流2h，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的混合溶液作为展开剂进行TLC 分析，原料基本反应完全后，冷却抽滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，旋干，进行柱层析 分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝30:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，于 二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到白色固体470mg，制备色谱分离，用乙 酸乙酯和正己烷结晶得到白色晶体，即化合物十，即为EGFRTKI-MPGF化合物。

本发明通过对PD153035化学结构进行优化和改进，得到了全新EGFR TKI—MPGF和MPGH，经生物活性评价，本发明EGFRTKI—MPGF和MPGH能够有 效抑制肿瘤细胞的增殖，具有优秀的抗肿瘤活性，在临床上可作为抗肿瘤剂应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由有效量的本发明化 合物或其可药用的盐与药学上可接受的载体配合而成，也即是说，将药学上可接受 用量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂 方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。将有效量的本发明化合物与药学上可 接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的 药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。 该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂 形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％ 重量的本发明化合物。

附图说明

图1为本发明EGFRTKI-MPGF化合物的分离路线图；

图2为本发明EGFRTKI—MPGH化合物的分离路线图；

图3为MPGF的高效液相色谱(HPLC)结果；

图4为MPGH的高效液相色谱(HPLC)结果；

图5为MPGF的质谱结果；

(1)1H-NMR；(2)19F-NMR

图6为MPGH的质谱结果(1H-NMR)；

图7为通过MTT法测定MPGF处理48小时后的细胞活力结果；

从图7结果可以看出MPGF可较强抑制PC9细胞活力，IC50＝2.5938±3.1568μM， 说明MPGF对EGFR19外显子缺失突变的非小细胞肺癌细胞系具有明显的抑制作用 (P<0.05)；

图8为通过MTT法测定MPGH处理72小时后的细胞活力结果。

从图8结果可以看出MPGH可较强地抑制PC-9细胞活力，IC50＝0.3536 ±0.1891μM，说明MPGH对EGFR19外显子缺失突变的非小细胞肺癌细胞系PC-9具有 明显的抑制作用(P<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1EGFRTKI—MPGF以及EGFRTKI—MPGH的制备

所述的MPGF的分子结构式如式I所示，所述的MPGH的分子结构式如式II所示:

制备流程图如图1及图2所示，具体制备方法如下：

1)氮气保护下在反应瓶中加入10.0g3-甲氧基-4-羟基苯甲酸，19.0g碳酸钾，7.0g 氯化苄和80毫升乙腈，该混合物于90℃回流反应2小时，使用正己烷：乙酸乙酯体 积比＝4:1的混合物作为展开剂进行TLC分析；原料完全反应，冷却抽滤，用150mL 乙酸乙酯洗涤滤饼，滤液旋干，进行柱层析分离，使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝5:1 的混合溶液进行洗脱，得到14.5g纯白色固体(化合物一)，产率97.0％；

2)将53毫升浓硝酸和105毫升醋酸混合后冰浴降温至-5℃，将14.0g化合物一溶 于15ml醋酸中，然后将含有化合物一的醋酸溶液缓慢滴加进浓硝酸和醋酸的混合液 中，滴完后反应液升至20-25℃，反应16小时，进行TLC分析，原料完全反应后，反 应液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤，将有机相用饱和碳酸 氢钠溶液洗涤至碱性，再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤滤液旋干 得到15.3g白色固体(化合物二)，此产物可以直接用于下步反应，产率93.9％；

3)氮气保护下将8.0g化合物二，12.0g铁粉，12.0g氯化铵，60ml水，120毫升甲 醇混合于80℃左右回流搅拌30分钟，TLC分析显示无原料，抽滤，用50毫升甲醇和 50毫升乙酸乙酯的混合溶液洗涤滤饼，滤液旋去溶剂，加入300毫升水中，用150毫 升乙酸乙酯萃取三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤后用无水硫酸镁干燥，抽滤旋 干得到7.2g棕色固体(化合物三)，产率99.4％；

4)氮气保护下将5.8g化合物三，720mg甲酸铵，60ml甲酰胺混合于160℃左右回 流反应3小时后，冷却析出固体，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥得5.0g灰白色固体(化 合物四)，产率87.7％；

5)将2.1g化合物四，9.1g三氯氧磷和60ml二氯乙烷混合于85℃回流一小时反应， 旋去三氯氧磷，加入冰水，用二氯甲烷萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，无水 硫酸镁干燥，抽滤旋干，进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝5:1、 3:1以及1:1的混合溶液进行梯度洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝1:1的洗脱液于得 到2.1g类白色固体(化合物五)，产率93.9％；

6)氮气保护下将2.10g化合物五，3-氯-4-氟苯胺1.10g，异丙醇80ml混合于 80-90℃回流搅拌4-5小时，冷却抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，干燥后得淡黄色固体 3g，向该固体中加入氨水调节pH至碱性，用二氯甲烷萃取，饱和氯化钠洗涤后，无 水硫酸镁干燥，旋干得到淡黄色固体2.40g(化合物六)，产率83.9％；

7)氮气保护下将2.4g化合物六溶于100ml甲醇和50mlTHF混合液中，加入1g5％ 钯碳，通入氢气20-25℃搅拌反应2.5h，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝10:1的混合溶液 作为展开剂进行TLC分析，原料反应完全后，抽滤，滤饼用二氯甲烷和甲醇混合液 浸泡洗涤，滤液旋干得到黄色粉末1.65g(化合物七)；

8)20.0g三缩四乙二醇和10.2g三乙胺加入反应瓶中，加入300ml乙腈，冰浴降温 至0-5℃，将19.0gTsCl溶入100ml乙腈缓慢滴入上述溶液中，1h滴完，滴完后升至20-25 度下反应12-14h，旋去溶剂，进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯体积比 ＝4:1以及1.5:1的混合溶液进行梯度洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝4:1的洗脱液 中得到12.9g油状产品(化合物十三)，产率35.9％，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝1.5:1 的洗脱液中得到5.4g油状物(化合物十四)，产率10.4％。

9)MPGH制备：氮气保护下，将1.50g化合物七，8.00g碳酸钾，120ml乙腈混合， 升温至95℃左右搅拌，将含有1.60g化合物十三的20ml乙腈溶液滴加进入上述体系， 约60min加完，加毕于95℃继续反应1h，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的混合溶 液作为展开剂进行TLC分析，原料反应完全后，冷却抽滤，用二氯甲烷洗涤滤饼， 滤液旋干过柱，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1、30:1以及20:1的混合溶液进 行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到油状产物1.7g，制备色 谱分离后得到1.2g纯产品(化合物八)，即为EGFRTKI-MPGH化合物，两步产率 41.4％；

10)MPGF制备：氮气保护下将0.50g化合物八溶入20mL二氯甲烷中，降温至-5℃ 加入0.24g三乙胺和0.12gDMAP，于-10℃加入0.93gTsCl，搅拌反应5-10min后撤去 冰浴，自然升至20-25℃反应3h，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的混合溶液作为 展开剂进行TLC分析，原料基本反应完全后，旋去溶剂后快速柱层析分离，依次使 用二氯甲烷：甲醇体积比＝50:1、40:1以及30:1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲 烷：甲醇体积比＝30:1的洗脱液中得类白色固体，将产物溶于二氯甲烷中，加入1mL 3.5MHCl/乙醇溶液成盐，旋去溶剂得到白色固体0.40g(化合物九)，产率61.0％；

11)氮气保护下将3.60g化合物十四和0.85g氟化钾(KF)，2.70g氨基聚醚 (K222)以及30ml乙腈混合于90℃左右回流反应5h，旋干乙腈，加入乙酸乙酯， 用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥旋干后进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯 体积比＝3:1、2:1以及1:1的混合溶液进行梯度洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝1:1 的洗脱液中得到1.00g油状产品(化合物十五)，产率39.8％；

12)氮气保护下将0.48g化合物九，2.76g碳酸钾，20ml乙腈混合加热至回流，将 0.55g化合物十五溶入10ml乙腈中缓慢滴入上述含有化合物九的混合液中，约30min 加完，继续回流2h，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的混合溶液作为展开剂进行TLC 分析，原料基本反应完全后，冷却抽滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，旋干，进行柱层析 分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝30:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，于 二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到白色固体470mg，制备色谱分离，用乙 酸乙酯和正己烷结晶得到白色晶体0.30g(化合物十)，即为EGFRTKI-MPGF化合 物，产率51.3％。

MPGF以及MPGH的高效液相色谱(HPLC)结果分别如图3和图4所示，从HPLC 结果可以看出，本发明制备得到的MPGF以及MPGH药物纯度单一，无杂质。

MPGF以及MPGH的质谱结果分别如图5和图6所示。

实施例2本发明MPGF和MPGH对EGFR19外显子缺失突变的非小细胞肺癌细 胞系PC-9的抑制作用试验

1、供试化合物：MPGF，MPGH，由实施例1方法制备

2、试验方法：

取对数生长期的EGFR19外显子缺失突变的非小细胞肺癌细胞系PC-9细胞，以 10000个/孔接种于96孔板中，于37℃5％CO2条件下培养24小时后，给药组加入供 试化合物MPGH，使其终浓度分别为0.01、0.1、1.25、2.5、5、10、20、30、40M, 空白对照组为0.08％二甲基亚砜，于37℃5％CO2条件下分别培养48小时和72小时 后，采用MTT比色法，于波长490nm处测定吸光度A值。根据A值计算药物对非小细 胞肺癌细胞生长的半数抑制率(IC50)。

3、试验结果

图7为通过MTT法测定MPGF处理48小时后的细胞活力结果，从图7结果可以看 出MPGF可较强抑制PC9细胞活力，IC50＝2.5938±3.1568μM，说明MPGF对EGFR19 外显子缺失突变的非小细胞肺癌细胞系具有明显的抑制作用(P<0.05)。

图8为通过MTT法测定MPGH处理72小时后的细胞活力结果，从图8结果可以看 出MPGH可较强地抑制PC-9细胞活力，IC50＝0.3536±0.1891μM，说明MPGH对 EGFR19外显子缺失突变的非小细胞肺癌细胞系PC-9具有明显的抑制作用 (P<0.05)。

以上结果说明，本发明化合物MPGF和MPGH，与PD153035相比，对突变EGFR 肺癌细胞系PC-9具有更强的抑制增殖作用。