一种DNA高通量测序建库方法

摘要

本发明提供了一种适用于复杂环境中生物DNA的高通量测序建库方法，包括以下步骤：(1)对待测生物的基因组DNA进行片段化处理，获得DNA片段化物料；(2)对所述DNA片段化物料进行琼脂糖凝胶电泳获得电泳胶块，切取所述电泳胶块中文库目的大小的片段至比所述文库目的大小的片段大40-60bp的片段范围内的凝胶，回收凝胶内的DNA获得第一纯化DNA；(3)对所述第一纯化DNA进行末端修复，3`末端加A，连接接头序列获得连接产物，并对连接产物进行Solexa？PCR扩增，获得文库。本发明方法操作简单，能够解决复杂环境中生物DNA(如：海带DNA、贝类DNA、石榴DNA等)建库困难的问题，且能够降低接头使用量，为高通量测序提供一种疑难样品的建库方案。

说明书

技术领域

本发明涉及基因高通量测序技术领域，具体地，涉及一种适用于 复杂环境中生物的DNA高通量测序建库方法。

背景技术

在二代和三代测序技术中，构建高质量的测序文库是高通量测序 的关键因素。测序文库的质量直接决定测序产出的数据质量，进而对 数据分析有着莫大的关联。随着高通量测序技术的快速发展，各大试 剂公司，包括Illumina、NEB、KAPA、Nugen等，已能提供多种文库 制备的试剂或试剂盒，为DNA、RNA等形式的核酸样品的建库带来 极大的便利，但是，在DNA核酸建库方面，并不是所有物种的DNA 都能够顺利完成文库的构建。究其原因为这些DNA样品中含有大量杂 质，特性与DNA相近，不能够通过调整DNA提取条件去除干净，且 这些杂质对建库过程中酶反应产生抑制效应，使DNA修复不完全或接 头连接效率低，最终导致文库产出量低。比较有代表性的一种生物类 型是海洋生物，如海带、贝类等。利用上述各大公司提供的建库方法， 海带、贝类DNA仍然不能得到有效的文库产出，因此迫切需要一种能 够有效降低复杂环境中生物DNA杂质污染的影响，特别是降低海洋生 物DNA中杂质污染的影响的建库方法。

发明内容

本发明的目的在于解决现有的高通量测序建库方法中难以降低 环境中杂质污染的影响的问题，提供一种能够有效避免环境杂质污染 的DNA高通量测序建库方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种DNA高通量测序建库方法， 包括以下步骤：

(1)对待测生物的基因组DNA进行片段化处理，获得DNA片 段化物料；

(2)对所述DNA片段化物料进行琼脂糖凝胶电泳获得电泳胶 块，切取所述电泳胶块中文库目的大小的片段至比所述文库目的大 小的片段大40-60bp的片段范围内的凝胶，回收凝胶内的DNA获得 第一纯化DNA；

(3)对所述第一纯化DNA进行末端修复和在3`末端加A，末端 加A后连接接头序列获得连接产物。

本发明所提供的DNA高通量测序建库方法能够在含有多糖、酚 类物质、萜类、酯类等杂质污染的复杂环境下对生物DNA进行高通 量测序文库构建，能够将样品中与DNA特性接近的杂质去除，提高 高通量测序文库的质量。适用于那些按照本领域现有构建文库方法， 获得的文库产出低，同时通过调节DNA纯度、反应体积、酶用量等 手段仍然无法排除缺陷的，属于疑难样品的DNA。

可选的，所述待测生物为海洋生物，特别优选的，所述海洋生物 为海带或贝类。本发明对于海带和贝类的具体种类没有特别的限制， 包括所有已知和未知海带和贝类种类。

可选的，所述待测生物为石榴。

石榴籽中含有多糖、蛋白质、酯类等杂质物质的干扰，多糖与 DNA或者RNA的理化性质相似，抽提过程中易与DNA形成胶状沉 淀，导致最终提取的DNA纯度不高。而这些杂质会对建库过程中酶 造成影响。本发明所提供的方法能够去除石榴籽中的杂质物质的干 扰，获得高质量的测序文库。

其中，在步骤(1)中，进行片段化处理的方式包括但不限于超 声波破碎、酶切破碎和微波破碎。

其中，在所述DNA片段化物料中，DNA片段的大小为180-600bp。

优选的，在步骤(2)中，所述琼脂糖凝胶电泳的凝胶的浓度为 2.0％。可选的，凝胶长度为6cm-12cm。电泳条件为110V，60min 或120min(可以根据凝胶长度选择适当的电泳条件和时间)。

其中，在步骤(2)中，若文库目的大小的片段为300bp，那么应 该切取300bp至340bp或360bp范围内的凝胶。优选切取所述电泳 胶块中文库目的大小的片段至比所述文库目的大小的片段大50bp的 片段范围内的凝胶，即如果目的大小的片段为300bp，那么应该切取， 300bp至350bp范围内的凝胶。

在本发明的一种实施方式中，所使用的DNA胶回收试剂盒为 QIAGEN公司QIAquickGelExtractionKit，最终回溶体积为30-60μl， 本方法建议回溶体积为55.5-60μl，以便后续实验不需要补H₂O。

其中，在步骤(3)中对于进行末端修复、3`端加A、加接头等 建库步骤的试剂来源、形式没有特别的要求，但试剂必须能够完成 所述功能。

由于片段后物料经过切胶后，符合目的要求的DNA占总量的 1/10左右，为保持最适的接头与DNA的比例，因此本发明中所使用 的接头的用量显著低于本领域加接头时所使用的接头用量，可以约 为本领域常规接头用量的1/5-1/10，在本发明的一种实施方式中可以 按照常规推荐用量的十分之一添加接头，例如，当所使用的接头为 南京诺唯赞公司(Vazyme)提供的VAHTSDNAAdaptersset1/set2for 试剂盒(N801/N802)中提供的接头时，接头使用量可以调 整为建议用量的1/10，即建议用量为2.5μl，在本发明中可以将其稀 释10倍后，使用2.5μl。

优选的，在获得所述连接产物后，还包括利用纯化磁珠对所述连 接产物进行第二次纯化获得第二次纯化后的连接产物，所述纯化珠 子的用量为所述连接产物体积的1.0-2.0倍，优选为1.8倍。

所述方法还包括对所述第二次纯化后的连接产物进行Solexa PCR获得PCR产物，再对所述PCR产物进行第二次凝胶电泳并切 胶回收获得文库DNA。其中，第二次凝胶电泳和切胶回收的目的是 去除非目的DNA、进一步提高文库片段的均一性，所使用的凝胶浓 度优选为2.0％，切胶范围为电泳亮带。

本发明还提供了所述DNA高通量测序建库方法的应用，所述应 用包括对存在于含有多糖、酚类物质、萜类和酯类杂质中的至少一 种的环境下的生物进行DNA高通量测序建库。

本发明所提供的建库方法适用于复杂环境中生物DNA的高通 量测序建库，具有以下优点及有益效果：

(1)能够有效低降低样品杂质对建库酶活反应的抑制效应，解 决高通量测序中部分样品建库困难的问题，提高建库成功率。

(2)该方法提供的DNA片段化后切胶回收，其方法简单，几乎 所有实验室均有条件实现。

(3)该方法对DNA破碎方法、建库试剂、建库流程等简便易行， 可以在多种建库条件下使用，适用性广泛。

附图说明

图1为海带DNA样品利用常规高通量建库方法文库结果电泳图。

图2为海带DNA样品利用本发明高通量建库方法文库结果电泳 图。

图3为贝类DNA样品利用常规高通量建库方法文库结果电泳图。

图4为贝类DNA样品利用本发明高通量建库方法文库结果电泳 图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。超声波清洗仪由 江苏苏美电器公司生产，型号为KQ-50E；琼脂糖为Bio-Rad Laboratories，Inc提供的Certified^TMLowRangeUltraAgarose (#161-3107)；胶回收试剂盒为QIAGEN公司提供的QIAquickGel ExtractionKit(28706)和MinElutePCRPurificationKit(28006)， 建库试剂由南京诺唯赞公司(Vazyme)提供的VAHTS^TMTurboDNA LibraryPrepKitfor(#ND102)和VAHTSDNAAdapters set1/set2for试剂盒(N801/N802)，纯化磁珠使用的是 BeckmanCoulter公司的AMPureXPBeads(A63882)，DNAMarker 买自NewEnglandLab(NEB)公司的50bpDNALadder(N3236L)。

实施例1本发明的高通量测序建库方法及其与常规高通量建库方 法之间的比较

一、常规高通量建库方法实验步骤及结果：

1.取出海带DNA样品500ng(北京百迈客生物科技有限公司海 带DNA样品，编号451，文库目的大小的片段为300bp)，加入到PCR 管中，补H₂O至总体积44μl，置于超声波清洗仪中进行DNA破碎至所 需片段大小(300-400bp)；

2.根据BeckmanCoulter公司AMPureXPBeads说明书，使用1.8 倍样品体积的AMPureXPBeads对片段化DNA进行纯化，纯化后DNA 用55.5μlH₂O溶解；

3.根据南京诺唯赞公司(Vazyme)提供的VAHTS^TMTurboDNA LibraryPrepKitfor和VAHTSDNAAdaptersset1/set2for 试剂盒对片段化且纯化后的DNA进行末端修复、3`末端加A、 连接适用于Illumina测序平台的接头；

4.连接产物使用1.8倍样品体积的AMPureXPBeads进行纯化， 最后溶剂体积为30μl；

5.纯化产物点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件 110V，120min；切取“400bp下-400bp上”范围内凝胶，并用QIAGEN 公司提供的QIAquickGelExtractionKit试剂盒进行回溶，回溶体积30 μl；

6.取出连接产物切胶后的12μl样品，利用VAHTS^TMTurboDNA LibraryPrepKitfor试剂盒提供的高保真Taq酶进行Solexa PCR，添加特定Index；

7.SolexaPCR产物点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条 件110V，120min；电泳完毕的凝胶进行染色、成像，观察样品亮度， 结果如图1所示，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司海 带DNA样品451，Marker为NewEnglandLab(NEB)公司50bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中显示R3-R7共5个文库浓度弱，不 可见。

8.切取“400bp-450bp”上范围内凝胶，使用QIAGEN公司提供的 MinElutePCRPurificationKit试剂盒对文库进行回收，回溶体积为26 μl。

二、本发明的高通量建库方法实验步骤及结果：

1.取出海带DNA样品500ng(北京百迈客生物科技有限公司海 带DNA样品，编号451，文库目的大小的片段为300bp)，加入到PCR 管中，补H₂O至总体积44μl，置于超声波清洗仪中进行DNA破碎至所 需片段大小(300-400bp)；

2.DNA片段化产物点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳 条件110V，120min，切取“300-400bp”范围内凝胶，并用QIAGEN公 司提供的QIAquickGelExtractionKit试剂盒进行回溶，回溶体积55.5 μl；

3.根据南京诺唯赞公司(Vazyme)提供的VAHTS^TMTurboDNA LibraryPrepKitfor和VAHTSDNAAdaptersset1/set2for 试剂盒对片段化且纯化后的DNA进行末端修复、3`末端加A、 连接适用于Illumina测序平台的接头(其中Adapter需要用H₂O稀释10 倍)；

4.连接产物使用1.8倍样品体积的AMPureXPBeads进行纯化， 最后溶剂体积为30μl；

5.取出连接产物纯化后的12μl，利用VAHTS^TMTurboDNA LibraryPrepKitfor试剂盒提供的高保真Taq酶进行Solexa PCR，添加特定Index；

6.SolexaPCR产物点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条 件110V，120min；电泳完毕的凝胶进行染色、成像，观察样品亮度， 结果如图2所示，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司海 带DNA样品451，Marker为NewEnglandLab(NEB)公司50bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中显示R03、R04、R05、R07四个 文库明显可见，且同项目的R01和R02两个文库也可见。

7.切取“400-450bp”范围内凝胶，使用QIAGEN公司提供的 MinElutePCRPurificationKit试剂盒对文库进行回收，回溶体积为26 μl。

通过比较电泳图1和图2，图1显示451海带DNA样品利用常规的高 通量建库方法进行建库，文库产物极低，反应到胶图上，看不到应有 的电泳条带；而这些海带DNA样品，利用本发明的高通量建库方法构 建的文库，最终文库反应到电泳胶图上，目的范围内有着清晰的亮带。 该示例说明，本发明能够显著提高海带DNA样品的建库产出、建库成 功率。

实施例2本发明的高通量测序建库方法及其与常规高通量建库方 法之间的比较

一、常规高通量建库方法实验步骤及结果：

1.取出贝类DNA样品500ng(北京百迈客生物科技有限公司贝 类DNA样品，编号S72，文库目的大小的片段为500bp)，加入到PCR 管中，补H₂O至总体积44μl，置于超声波清洗仪中进行DNA破碎至所 需片段大小(500bp)；

2.根据BeckmanCoulter公司AMPureXPBeads说明书，使用1.8 倍样品体积的AMPureXPBeads对片段化DNA进行纯化，纯化后DNA 用55.5μlH₂O溶解；

3.根据南京诺唯赞公司(Vazyme)提供的VAHTS^TMTurboDNA LibraryPrepKitfor和VAHTSDNAAdaptersset1/set2for 试剂盒对片段化且纯化后的DNA进行末端修复、3`末端加A、 连接适用于Illumina测序平台的接头；

4.连接产物使用1.8倍样品体积的AMPureXPBeads进行纯化， 最后溶剂体积为30μl；

5.纯化产物点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件 110V，120min；切取“600bp下-600bp上”范围内凝胶，并用QIAGEN 公司提供的QIAquickGelExtractionKit试剂盒进行回溶，回溶体积30 μl；

6.取出连接产物切胶后的12μl样品，利用VAHTS^TMTurboDNA LibraryPrepKitfor试剂盒提供的高保真Taq酶进行Solexa PCR，添加特定Index；

7.SolexaPCR产物点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条 件110V，120min；电泳完毕的凝胶进行染色、成像，观察样品亮度， 结果如图3所示，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司贝 类DNA样品S72，Marker为NewEnglandLab(NEB)公司50bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中显示D02文库在650bp处有很弱的 条带。

8.切取“600-650bp”范围内凝胶，使用QIAGEN公司提供的 MinElutePCRPurificationKit试剂盒对文库进行回收，回溶体积为26 μl。

二、本发明的高通量建库方法实验步骤及结果：

1.取出贝类DNA样品500ng(北京百迈客生物科技有限公司贝 类DNA样品，编号S72，文库目的大小的片段为500bp)，加入到PCR 管中，补H₂O至总体积44μl，置于超声波清洗仪中进行DNA破碎至所 需片段大小(500bp)；

2.DNA片段化产物点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳 条件110V，120min，切取“500-550bp”范围内凝胶，并用QIAGEN公 司提供的QIAquickGelExtractionKit试剂盒进行回溶，回溶体积55.5 μl；

3.根据南京诺唯赞公司(Vazyme)提供的VAHTS^TMTurboDNA LibraryPrepKitfor和VAHTSDNAAdaptersset1/set2for 试剂盒对片段化且纯化后的DNA进行末端修复、3`末端加A、 连接适用于Illumina测序平台的接头(其中Adapter需要用H₂O稀释10 倍)；

4.连接产物使用1.8倍样品体积的AMPureXPBeads进行纯化， 最后溶剂体积为30μl；

5.取出连接产物纯化后的12μl，利用VAHTS^TMTurboDNA LibraryPrepKitfor试剂盒提供的高保真Taq酶进行Solexa PCR，添加特定Index；

6.SolexaPCR产物点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条 件110V，120min；电泳完毕的凝胶进行染色、成像，观察样品亮度， 结果如图4所示，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司贝 类DNA样品S72，Marker为NewEnglandLab(NEB)公司50bpDNA Ladder，最亮的条带为500bp。图中显示D02文库在650bp处有很强的 亮带。

7.切取“600-650bp”范围内凝胶，使用QIAGEN公司提供的 MinElutePCRPurificationKit试剂盒对文库进行回收，回溶体积为26 μl。

通过比较电泳胶图3和4，其结果与实施例1的极为一致，贝类 DNA样品利用常规高通量建库方法只能得到低浓度的文库，胶图显 示目的范围内有较弱的条带；利用本发明的高通量建库方法对贝类 DNA样品进行建库，最终反应到电泳胶图上，目的范围内DNA亮 度的强度远大于常规方法构建的文库。该结果显示，本发明的方法 能够显著提高贝类DNA样品的建库浓度、建库成功率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。