一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白及其制备和应用

摘要

本发明涉及一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白，其包含以下结构：防御素HBD2-连接肽(G4S)2-人血清白蛋白HSA；其中所述的人β防御素2(HBD2)具有SEQ？ID？NO:1所示的氨基酸序列，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ？ID？NO:2所示的氨基酸序列，所述新型抗肿瘤融合蛋白，具有白蛋白巨胞饮靶向性和防御素HBD-2杀伤肿瘤细胞的功能，有望开发成为一类新型抗肿瘤药物。

说明书

技术领域:

本发明属于药用蛋白技术领域，具体而言，涉及一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白及其制备和应用。

背景技术：

临床常用的抗肿瘤药物以化疗药物为主，但由于其具有选择性低、副作用大等缺点，其应用受到诸多限制；靶向抗肿瘤药物由于其选择性高、毒副作用小，在肿瘤靶向治疗方面取得了巨大的成就，但依然存在不少问题，影响了临床治疗效果，如靶向效率低、易产生肿瘤的耐药性、免疫反应等安全性问题。因此，继续寻找更加安全高效的抗肿瘤靶向药物，是抗肿瘤药物研发需要解决的重要课题。

巨胞饮(macropinocytosis)是一种高度保守的内吞形式，指在某些因素刺激下，细胞膜皱褶形成大且不规则的原始巨胞饮体，其直径一般为0.5-3μm，比蛋白包被的内吞作用的囊泡平均尺寸大30倍。它为快速高效地内吞细胞外营养物质和液相大分子提供了一条有效途径。巨胞饮在肿瘤细胞中广泛存在，是癌细胞推动自身增值和生长的重要营养物质传递途径，正常细胞不存在或存在较少。Ras、Src等一些致癌基因的突变均可以激活巨胞饮，大部分的肺癌、结肠癌及超过90％的胰腺癌为KRAS突变型。研究表明，Ras癌细胞尤其依赖于巨胞饮维持生长和生存，它利用巨胞饮过程，吞噬白蛋白(albumin)，并随后利用其生成生长必需氨基酸的机制，来满足其特殊营养需求。阻断巨胞饮摄取白蛋白途径，肿瘤即停止生长。因此，有效地利用巨胞饮这一独特肿瘤细胞“进食机制”作为治疗靶点，设计抗肿瘤药物，可以提高药物的选择性和输送效率。

人血清白蛋白(Humanserumalbumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子量大约为68kDa，是血液中含量最高的蛋白，无免疫原性，人体相容性好，所以选择白蛋白作为药物传输载体具有较多优点；另外，巨胞饮是白蛋白进入肿瘤细胞的主要途径，一些肿瘤细胞巨胞饮明显增强，并以白蛋白为主要营养来源，为其提供生长必需氨基酸。所以，可以利用白蛋白作为靶向巨胞饮的药物输送载体。

防御素(defensins)是一类富含半胱氨酸，含有β片层折叠结构的阳离子小分子多肽，分子量为4.0kDa-5.0kDa，通过6个或8个半胱氨酸残基形成3个或4个分子内二硫键维持其β片层结构的稳定性。防御素广泛存在于哺乳动物、昆虫及植物体内，是一种具有抗菌、抗病毒及抗肿瘤活性的天然抗微生物肽。人的防御素(humandefensin)是由粒细胞和上皮细胞产生的，从遗传学上分为α-防御素和β-防御素家族。它们在天然免疫方面主要表现为杀死病原微生物和带有包膜的病毒，而在获得性免疫方面，主要表现作为化学诱导剂和激活免疫细胞。它是机体天然免疫系统的重要组成部分，具有很强的抗菌、抗病毒及肿瘤细胞毒作用，其作用机制较为相似，都是通过细胞裂解的作用。防御素作为一种天然抗肿瘤活性多肽与传统的化疗药相比，具有不良反应小，不易产生耐药性等优点。研究表明，人防御素可以作为一种新的治疗癌症的抗肿瘤分子。

人β防御素2(Humanbetadefensin2,HBD2)属于人β防御素家族具有代表性的成员之一，对肿瘤细胞的毒性是以细胞裂解为主，伴有少量的细胞凋亡。新的研究表明，在一些癌细胞中，HBD-2可以作为肿瘤的抑癌基因，如诱导口腔鳞癌细胞中HBD2的高表达，能够有效抑制人口腔鳞癌细胞株SAS的增值和侵袭，对A431和M-HeLa肿瘤细胞株的生存活力和增殖能力有很大影响。另外，HBD2可趋化未成熟的树突状细胞和记忆性T细胞，增强免疫系统对肿瘤抗原的识别，也可促进体内免疫因子的分泌活化，从而增进机体对肿瘤细胞的免疫监视，在肿瘤免疫中发挥一定的作用。在小鼠结肠癌细胞CT26移植瘤模型中，HBD2基因治疗可以介导特异性抗肿瘤免疫，增强局部的抗肿瘤作用。表明，HBD2在肿瘤免疫治疗方面成为有前景的应用分子。

基于上述，本发明制备一类融合蛋白，是由人防御素，包括α-防御素和β-防御素家族、连接肽、人血清白蛋白组成。本发明具体选择防御素家族中有代表性的人β防御素2(HBD2)作为杀伤肿瘤细胞的“弹头”分子，有巨胞饮靶向性的白蛋白作为药物的输送载体，研制得到防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白HBD2-HSA(defensinintegratedalbumin,DIA)。所述融合蛋白具有巨胞饮靶向性、防御素杀伤肿瘤细胞的功能、无免疫原性和不易产生耐药性特征，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明的目的之一是，提供一类靶向巨胞饮的防御素-白蛋白抗肿瘤融合蛋白。

本发明的目的之二是，提供了所述融合蛋白的制备方法。

本发明的目的之三是，提供防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白及其药物组合物在肿瘤治疗中的用途。

研究表明，防御素作为一种阳离子多肽，其活性明显受到白蛋白的影响，随着白蛋白浓度的增高其活性逐渐丧失，由于血液中白蛋白含量较高，这一特点限制了防御素作为治疗药物在体内的应用；另一方面，由于防御素本身对表达宿主有毒害作用，多以无活性形式表达或者不表达，限制了其生产应用。本发明，将防御素与白蛋白融合在一起，旨在利用白蛋白被肿瘤细胞巨胞饮大量内吞的特点，将防御素带入癌细胞内发挥作用。白蛋白作为癌细胞的供能对象，会很快降解，而防御素含有三对二硫键，且分子量较小，比较稳定，有希望在肿瘤细胞内攻击其细胞器。这一设计，不仅获得了DIA的宿主高表达，降低了制备难度，且提高了防御素的靶向性，其对正常细胞的毒性大大降低，另外还为防御素作为杀伤肿瘤细胞的“弹头”分子提供了一种新探索。本发明通过基因工程技术构建基于HSA，同时融合了HBD2(defensinintegratedalbumin,DIA)的重组载体，并通过毕赤酵母分泌表达系统制备目的蛋白，经纯化及相关的活性评价，获得一种抗肿瘤融合蛋白，有效避免原核表达系统中包涵体复性的不利因素，更好地确保其生物学活性。

本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，其中，所述的人β防御素2(HBD2)具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，共41个氨基酸；所述人血清白蛋白HSA具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，共585个氨基酸。此外，人β防御素2(HBD2)与HSA之间的连接肽，共10个氨基酸，具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列。

所述融合蛋白具有以下结构排列：防御素HBD2-连接肽(G4S)2-人血清白蛋白HSA，或HSA-(G4S)2-HBD2；所述蛋白具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，或者相应的HSA(SEQIDNO:2)-(G4S)2(SEQIDNO:3)-HBD2(SEQIDNO:1)氨基酸序列。

所述融合蛋白的编码基因，具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列，或相应于编码HSA(SEQIDNO:2)-(G4S)2(SEQIDNO:3)-HBD2(SEQIDNO:1)氨基酸序列的核苷酸序列。

其中，所述融合蛋白的防御素不限于人β防御素HBD2，包括所有的人α防御素和人β防御素，本发明选择比较有代表性的人防御素HBD2。

本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法。所述方法是，将一类防御素如HBD2，通过连接肽，如(G4S)2以及HSA基因序列，加入合适的酶切位点以及利于蛋白纯化的标签序列，插入到合适的表达载体，获得重组表达载体，电转化至感受态细胞，获得含有目的基因序列的表达菌株，表达菌株经培养、诱导表达，收取培养液，进行蛋白纯化，获得目的融合蛋白。

另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物，所述组合物系以本发明提供的上述融合蛋白为活性成分。

再一方面，本发明提供了所述融合蛋白及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。优选地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防人胰腺癌、肺癌或肝癌。

综上所述，本发明通过基因工程技术构建一种新型蛋白，既含有能够靶向巨胞饮的白蛋白HSA，又含有杀伤肿瘤细胞活性的防御素HBD2。目前，尚未见有利用白蛋白作为靶向巨胞饮药物输送载体的相关报道。

本发明的优点在于，所述防御素-白蛋白抗肿瘤融合蛋白，能够较好地保留防御素的生物学功能，而且防御素HBD2和白蛋白HSA均属于人体内天然存在的成分，具有无免疫原性，应用安全的特点。此外，防御素-白蛋白新型抗肿瘤融合蛋白DIA，对人胰腺癌MIAPaCa2裸鼠移植瘤的治疗效果显著，靶向性较好。因此，所述药物显示出较好的应用前景。

附图说明：

图1-DIA基因结构示意图

图2-DIA蛋白表达、鉴定及纯度检测

其中：图A为不同酵母菌株蛋白表达电泳图谱(1：蛋白分子量标准，2-9：分别为不同菌株的蛋白分泌情况)；

图B为DIA纯度的SDS-PAGE检测结果；

图C为DIA的WesternBlot检测结果。

图3-共聚焦方法检测胰腺癌肿瘤细胞通过巨胞饮对DIA的摄取情况

其中：A油镜显示巨胞饮摄取DIA的实验；

B定量分析EIPA对MIAPaCa-2细胞摄取DIA的抑制作用；Control：MIAPaCa-2细胞摄取DIA或HSA量

C两种胰腺癌细胞MIAPaCa-2细胞和BxPC-3中的巨胞饮摄取DIA的定量结果。

图4-DIA对不同肿瘤细胞的增值抑制作用

其中：A-D分别为DIA对肿瘤细胞MIAPaCa-2、BxPC-3、H460、A549的增值抑制作用；

E为DIA对正常细胞L02的增值抑制作用。

图5-DIA对MIAPaCa-2胞内线粒体的影响

其中：A透射电镜观察DIA对MIAPaCa-2细胞超微结构的影响，其中1和2：对照组；3和4：DIA处理组(其中图1、3放大倍数为1650倍，图2、4放大倍数为4200倍)；

B为流式细胞仪分析测定DIA对胰腺癌细胞线粒体膜电位影响。

图6-DIA对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用

其中：A为DIA抑瘤率

B为DIA对小鼠体重的影响。

图7-通过活体呈像实验观察DIA对人胰腺癌MIAPaCa-2裸鼠移植瘤的靶向情况

其中：A为DIA剂量10mg/kg；

B为DIA剂量30mg/kg；

C为DIA剂量50mg/kg。

图8-DIA对裸鼠移植瘤MIAPaCa-2细胞生长的抑制作用

其中：A为DIA抑瘤率

B为DIA对小鼠体重的影响

具体实施方式：

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

《实施例1》重组表达载体pPIC9K-DIA的构建

构成DIA的防御素HBD2和HSA氨基酸序列分别来自于GenBank:

AAN64161.1和CAA00047.1，并经过OptimumGeneTM密码子优化技术处理，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成提供含有HBD2和HSA编码基因的质粒PUC57s-HBD2和PUC57s-HSA。分子生物学实验中使用的PCR引物由

InvitrogenTM公司合成，质粒pPIC9K购买自Invitrogen公司，大肠杆菌感受态DH5α为北京全式金生物科技公司产品。

构建重组pPIC9K-DIA的引物：

β2F2：TCTGTACGTAGGTATTGGTGACCCTGTTACTTGTTTGAAGTCCGGTGCTATTTG54bp(下划线为SnabI酶位点)

β2R2：CTTGTGTGCATCGGAACCTCCACCTCCAGAACCTCCACCTCCAGGTTTCTTGCAACACT59bp(下划线的反向互补序列为(G4S)2连接肽)

HSAF2：GGAGGTGGAGGTTCCGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC40bp

HSAR2：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTAAGCCTAAGGCAGCTTG55bp(下划线为NotI酶位点)

以质粒PUC57s-HBD2为模板，分别以β2F2为5’端引物，β2R2为3’端引物，进行PCR扩增，获得N端含有酶切位点SnabI的、C端(G4S)2氨基酸的连接肽部分及与HSA重叠的HBD2基因片段。PCR反应体系为94℃变性5min后进行30个循环的扩增反应：94℃变性30s，42℃退火20s，72℃延伸20s，最后一个循环结束后在72℃保温10min。

同时以质粒PUC57s-HSA为模板，分别以HSAF2为5’端引物，HSAR2为3’端引物，进行PCR扩增，获得C端含有6个组氨酸标签和NotI酶切位点的HSA基因的片段。PCR反应体系为94℃变性5min后进行30个循环的扩增反应：94℃变性40s，68℃退火20s，72℃延伸1min40s，最后一个循环结束后在72℃保温10min。

然后，以上两种PCR产物利用快速胶回收试剂盒(Omega生物技术有限公司产品)纯化回收后的两个片段混合作为模板，以引物β2F2和引物HSAR2进行OverlapPCR反应，产物进行琼脂糖凝胶电泳回收1955bp的片段，其含SnabI和NotI限制性酶切位点，并且中间含有编码(G4S)2氨基酸的连接肽基因。将得到的基因片段命名为DIA，其结构如图1所示。

分别用SnabI和NotI双酶切基因HBD2-HSA及pPIC9K质粒载体，然后连接，得到重组表达载体，命名为pPIC9K-DIA，并转化至大肠杆菌DH5α，挑选出阳性克隆进行测序。

重组质粒pPIC9K-DIA中的DIA包含编码HBD2和HSA的核苷酸序列，二者之间通过柔性连接肽(G₄S)₂核苷酸连接。在防御素HBD2编码序列的5’末端有SnabI酶切位点，HSA编码序列的3’末端有组氨酸标签序列(6个氨基酸，His-tag标签)和NotI酶切位点，使得该重组质粒pPIC9K-DIA在表达融合蛋白时，其蛋白含有His-tag标签，以便于纯化和鉴定。将测序正确pPIC9K-DIA质粒，经SalⅠ内切酶线性化后，回收目的条带，电转化至巴斯德毕赤酵母PichiapastorisGS115感受态细胞，获得含有目的基因序列的表达菌株。所述菌株被命名为GS115-DIA，于2015年09月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其编号为CGMCCNo.11388。

《实施例2》DIA的诱导表达、纯化及鉴定

将GS115-DIA菌株进行小规模诱导表达，筛选出高效表达菌株。主要步骤为：挑取MD平板上长出的单菌落，分别接种至BMGY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，100mMpH6.0磷酸钾缓冲液，1％甘油)，28-30℃，280-300rpm，培养至对数期(OD₆₀₀＝2-6)。转接0.5mL培养液至50mLBMGY培养基(500mL摇瓶，按≤10％量装瓶)，28-30℃，280-300rpm，培养24-36h。于室温3,000×g离心5min，弃上清后收集菌体，细胞沉淀转移至50mLBMMY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，100mMpH6.0磷酸钾缓冲液，1％甲醇)中，28℃，280-300rpm，培养96h(每隔24h添加100％甲醇至终浓度为1.0％)。取少量发酵液至1.5mLEppendorf管中，室温5,000×g离心5min，收集上清。通过10％SDS-PAGE检测蛋白的表达情况(图2A)。筛选获得的菌株经过发酵条件优化后，进行较大规模的表达。收取发酵液上清，采用GEHealthcare公司产品HisTrap亲和层析柱(5mL)进行蛋白纯化，详细步骤可参阅说明书。纯化产物用SDS-PAGE检测纯度，结果显示目的蛋白DIA达到电泳纯(图2B)，产量约20mg/L；并采用Westernblot方法进行鉴定(图2C)，分子量大小与预期接近。

《实施例3》肿瘤细胞通过巨胞饮摄取DIA的观察和定量

据报道，胰腺癌KRAS突变的MIAPaCa2细胞，与KRAS野生型的胰腺癌肿瘤细胞BxPC-3相比，有明显增强的巨胞饮现象。本实验中将处于对数生长期的胰腺癌细胞MIAPaCa-2和BxPC-3制成细胞悬液，细胞计数调整其密度，按每孔1×10⁵个细胞接种至12孔板(板底置有灭菌的圆盖玻片)，常规培养至细胞汇合度约70％。吸弃培养液，PBS润洗2次，与FITC标记的DIA蛋白或HSA蛋白(1mg/mL)于37℃避光孵育1-2h，同时设置对照组和巨胞饮抑制剂EIPA(阿米洛利：为巨胞饮的特异性抑制剂)组。PBS室温润洗3次，每次5min，。4％甲醛固定1h，PBS润洗3次，每次5min。DAPI(终浓度为2μg/mL)染核处理15-20min，PBS润洗3次，每次5min。之后，滴加抗淬灭剂，封片，油镜(LEICATCSSP5,×630)检查，结果的分析用image-Proplus软件完成。结果表明，MIAPaCa-2在短时间内能大量摄取HSA与DIA；但KRAS未突变的BxPC-3对二者的摄取较少(如图3-A和图3-C)。另外，MIAPaCa-2摄取DIA的过程和量与HSA类似同样可以被EIPA抑制(如图3-A和图3-B)，说明DIA蛋白可以被MIAPaCa-2通过巨胞饮途径大量摄取进入细胞，其与HSA类似。

《实施例4》DIA对肿瘤细胞的增值抑制作用

取对数生长期的肿瘤细胞MIAPaCa-2、BxPC-3、H460、A549及正常细胞L02，胰酶消化后计数，并以2×10³/孔接种至96孔板中(数量根据不同细胞的生长速度进行调整，以未加药处理组细胞48h达85％汇合度为准)，于37℃培养24h。然后，加入DIA、HBD2和HSA几种融合蛋白，每种浓度设置3个平行孔。于37℃培养24h或48h后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)继续孵育4h。吸弃上清，每孔加入150μLDMSO，室温摇动反应10min，酶标仪测定570nm处的吸光值(A570)。实验中应分别设置无药对照组及无细胞空白组，按下列公式计算细胞的存活率及IC₅₀值：细胞存活率＝(加药组A570值-空白组A570值)/(对照组A570值-空白组A570值)×100％。结果如图4所示，DIA对MIAPaCa-2、BxPC-3、H460、A549肿瘤细胞的IC₅₀值分别是1±0.08,18.7±1.21,12±0.93和10.3±0.51μM，说明DIA在μM水平就能对肿瘤细胞增殖有抑制作用，且其活性明显优于HBD2单体，MIAPaCa-2对其最为敏感，DIA在使用浓度范围内，对正常细胞L02增值基本无影响，表明DIA对肿瘤细胞的选择性较好。

《实施例5》DIA对MIAPaCa-2线粒体的影响

(一)：透射电镜观察融合蛋白DIA体外对肿瘤细胞MIAPaCa-2超微结构的影响

培养细胞，用DIA处理12-48h后收集细胞；0.1MPBS，pH7.2-7.4快速清洗2遍，5min/次，室温；吸干净PBS，加入100-500ul2.5％戊二醛，4℃固定2h；再用PBS清洗3遍，5-10min/次；吸出PBS，加入适量琼脂糖(水配成浓度为2-5％的琼脂糖，煮沸融化，37度放置备用)离心，3000rpm，10min；低温静置30min使琼脂糖冷却凝固；在显微镜下切除没有样品的琼脂糖，有样品部分切成1mm3小块，2.5％戊二醛常温保存；弃去戊二醛，PBS快速洗两次，5-10min/次；水洗一次，5-10min/次，吸干；1-2％锇酸于4℃或室温，固定2h；PBS或水洗3次，5-10min/次；30％乙醇或丙酮，10min，4℃；50％乙醇或丙酮，10min，4℃；70％乙醇或丙酮，10min室温；90％乙醇或丙酮，10min，室温；95％乙醇或丙酮，10min，室温；100％乙醇或丙酮，10min×3，室温；渗透；包埋；聚合；切片制好上镜观察。如图5-A中1和2所示，透射电子显微镜观察结果显示，MIAPaCa-2细胞对照组其超微结构无异样，线粒体及其它细胞器结构正常，细胞膜完整；但是DIA蛋白处理后，可以明显观察到线粒体结构发生变化，绝大多数线粒体中间产生明显的的空泡，形态发生变化，部分细胞膜出现破裂，多数细胞呈现典型的坏死病变，如图5-A中3和4所示。说明，DIA进入MIAPaCa-2后，损伤了其超微结构，尤其是对线粒体的影响最为广泛和明显。

(二)：测定融合蛋白DIA对胰腺癌细胞的线粒体膜电位的影响

将MIAPaCa-2、BxPc-3细胞分别按1×10⁵/孔的密度接种与12孔细胞培养板。37℃培养24h后，加入不同浓度的DIA、HSA和HBD2(Abcam)，孵育24-48h后，每孔中加入终浓度为1-20μg/ml的JC-1染料(Sigma)，37℃染色10-20min，PBS洗两边细胞，胰酶消化收集细胞，PBS洗三遍后，用0.5-1mL1×PBS重悬，并用300目细胞筛过滤细胞悬液后，1h内上机检测。结果如图5B所示，检测DIA对胰腺癌细胞线粒体膜电位的影响，发现随着蛋白浓度的增加，DIA可以明显降低MIAPaCa-2的膜电位，但对BxPC-3的膜电位基本没有影响。而且HBD2单体在与DIA等摩尔最高浓度下，对线粒体膜电位的影响明显低于DIA，说明DIA具有优于亲本分子HBD2的干扰癌细胞线粒体的作用，而且这一作用仅对有增强巨胞饮作用的MIAPaCa-2细胞作用明显，再次证明了本发明设计的可行性。

《实施例6》DIA对鼠H22肝癌的抑瘤作用

小鼠H22肝癌细胞在小鼠腹腔培养扩增，取生长期的细胞计数，用生理盐水稀释成7.5×10⁶/ml细胞悬液，取200微升直接接种于昆明小鼠右侧腋窝皮下，次日开始给药。融合蛋白DIA和HSA经尾部静脉注射给药，于第1天和第6天给药，共两次。实验共设3组，每组6只雌性昆明小鼠，即对照组(生理盐水)、HSA组(40mg/kg)、DIA组(20mg/kg)。实验期间记录小鼠体重，于接种肿瘤后第10天结束实验，处死动物，取瘤，称重。按下列公式计算抑瘤率，并对各组瘤重进行统计学处理。T/C(％)＝Wt/Wc×100％，其中Wt为治疗组的瘤重，Wc为对照组的瘤重。抑瘤率计算公式为(1-T/C)×100％。结果如图6A所示，所用融合蛋白DIA的剂量为20mg/kg时，抑瘤率能达到65％，同比HSA，对瘤重无明显影响，说明本发明DIA能对肿瘤起到抑制生长的作用。在整个实验治疗期间，监测小鼠体重(图6B)显示给药组未使小鼠体重下降，小鼠能够耐受所给的剂量。

《实施例7》DyLight680标记的DIA在活体中靶向肿瘤组织的能力

实验过程所使用的DyLight680AntibodyLabelingKit购于Thermo公司，调节待标记蛋白浓度至2.0mg/mL，溶于PBS，取0.5mL加入40μL0.67M的硼酸盐缓冲液中。将准备好的蛋白溶液加入DyLight680试剂，轻柔的上下震荡混匀。将反应管快速离心使反应混合物集中到管底部，于室温，避光反应60min。取两个上下套管装配在一起，混匀纯化试剂并加至套管上部，1,000×g离心1min，弃收集管。更换一个新的收集管，套管上部加入反应后的蛋白溶液，使之与纯化试剂混合。1,000×g离心1min，将收集管中标记好的蛋白合并。于4℃避光保存(30天)。将人胰腺癌MIAPaCa-2细胞接种至裸鼠右侧腋下。约2-3周后，当肿瘤体积至100-500mm3，将DyLight680标记的DIA，通过尾静脉给药荷瘤裸鼠(n＝3)的方式，给药剂量分别为10mg/kg、30mg/kg和50mg/kg。利用XENGOEN(美国Caliper公司)的小动物活体成像仪进行观察。

结果发现：DIA能很好地靶向MIAPaCa-2裸鼠移植瘤处，2h时可见微弱强度黄色荧光，随时间的推移荧光强度逐渐增强，24h富集程度最强，到264h基本消失(图7)。且随着剂量的增大，肿瘤部位荧光增强。以上结果说明了本发明DIA具有较好的肿瘤靶向性。

《实施例8》DIA对裸鼠移植瘤MIAPaCa-2的生长抑制作用

取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠2-3只建立移植瘤传代模型，将人胰腺癌细胞MIAPaCa-2接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种1×10⁷个细胞。待瘤块长至200-300mm³，采用颈椎脱臼法处死荷瘤裸鼠，无菌条件下取出皮下生长的瘤块，修剪去除包膜及坏死组织，生理盐水中剪成约2mm³大小的瘤块，并用套管针将瘤块分别移植到裸鼠右腋窝皮下，火棉胶粘住切口。待瘤块长至约50-100mm³时，按照裸鼠体重和瘤体积进行分组，每组6只。按照下述给药方案处理：DIA(10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg)、HSA(30mg/kg)以及阳性对照吉西他滨(GEM)(40mg/kg)。尾静脉给药，每只200μL，对照组不作处理，吉西他滨腹腔注射。第一次给药后的第8天，按照相同剂量给药第二次，第二次给药后的第8天给第三次药。实验期间，每3天对裸鼠体重和肿瘤的体积进行测量，并观察裸鼠的精神状态。根据公式V＝ab²/2计算肿瘤体积(a:肿瘤长径，b:肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线及裸鼠体重变化曲线图。DIA抑制MIAPaCa-2移植瘤生长的治疗效果显著，三组计量由高到低抑瘤率分别约为59％，65％和80％(图8A)，30mg/kgDIA的抑瘤率明显优于吉西他滨40mg/kg的抑瘤率(67％)，上述各治疗组的小鼠状态良好，未发生死亡，体重变化区间在10％以内(图8B)。由此说明，本实验室构建的防御素-白蛋白抗肿瘤融合蛋白DIA与临床上常用于治疗胰腺癌的吉西他滨相比，DIA的抑瘤效果更好，白蛋白本身对肿瘤抑制无明显作用，说明防御素的引入发挥了很好的弹头作用。