基于防御素的巨胞饮介导重组融合蛋白以及双靶向单链抗体重组融合蛋白的制备和抗肿瘤活性研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一部分 基于防御素HBD2的巨胞饮介导融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性和作用机制研究
　　研究目的:据报道，K-Ras基因突变的胰腺癌细胞表现出明显增强的巨胞饮过程(elevated level of macropinocytosis)，来满足自身独特的营养需求，这一发现为针对巨胞饮过程的靶向抗肿瘤药物设计方案提供了理论依据。本研究利用白蛋白作为巨胞饮介导的靶向治疗药物输送载体，构建了一种白蛋白整合的β防御素(DF-HSA)，由“效应”分子人β防御素2(HBD2，DF)和巨胞饮导向性的人血清白蛋白(HSA)两部分组成，研究其对K-Ras突变胰腺癌的抗肿瘤活性。
　　研究方法:选择胰腺癌MIA PaCa-2和BxPC-3细胞研究DF-HSA的巨胞饮摄取量和细胞毒性;并以HSA和HBD2分子作为实验对照，研究DF-HSA的体外抗肿瘤活性。建立人胰腺癌MIA PaCa-2裸鼠移植瘤模型进行DF-HSA体内靶向分布的考察和初步的药效评价。应用人类基因表达谱芯片检测HBD2和DF-HSA作用于MIA PaCa-2细胞后的基因表达差异。
　　研究结果:K-Ras突变的胰腺癌MIAPaCa-2细胞中，DF-HSA通过巨胞饮介导的内化过程进入细胞;MIA PaCa-2细胞中巨胞饮的强度与K-Ras野生型的BxPC-3细胞相比明显增高;在细胞毒性方面，融合蛋白DF-HSA明显强于HSA和游离的防御素HBD2; DF-HSA诱导MIA PaCa-2细胞线粒体损伤，并激活肿瘤细胞线粒体凋亡途径。值得注意的是，DF-HSA对K-Ras突变的MIA PaCa-2胰腺癌裸鼠移植瘤有显著治疗效果，30mg/kg的DF-HSA抑瘤率达到81％且耐受良好。活体呈像结果显示，DF-HSA在体内能特异性富集并长时间滞留在肿瘤部位。经DF-HSA处理的MIA PaCa-2细胞基因表达谱变化明显，这些基因功能涉及基因表达和转录的调控、细胞代谢和细胞凋亡等多个方而。
　　研究结论:β防御素与白蛋白整合的融合蛋白DF-HSA，可以通过巨胞饮介导的过程大量进入K-Ras突变的胰腺癌细胞，对胰腺癌裸鼠异种移植瘤显示特异性分布，并有良好的治疗效果。结果表明，DF-HSA在巨胞饮介导的肿瘤靶向治疗方面是一个是有应用前景的分子。
　　第二部分 基于防御素HBD1的双单链抗体融合蛋白的制备
　　HBD1作为人体先天性免疫的重要组成成分，不仅具有广谱的抗微生物活性外，还具有杀伤肿瘤细胞和免疫调理的作用，而且不易产生耐药性。大量的研究显示，hbd1在体内作为一种抑癌基因存在，而HBD1不仅可以选择性地裂解杀伤肿瘤细胞，还能发挥抗肿瘤免疫的作用。所以HBD1具有良好的抗肿瘤潜能和应用前景。由于涉及肿瘤的生长、转移和血管生成等过程，基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)被认为是一类理想的靶标。明胶酶属于基质金属蛋白酶的一种，包括MMP-2和MMP-9两种组分，其能够破坏基底膜及细胞外基质的完整性，参与肿瘤生长、侵袭和转移，并且在肿瘤血管发生和新生血管的形成过程中都起到重要作用。据报道，明胶酶在侵袭和转移性肿瘤如在胰腺癌中大量表达。本研究的目的是选择人β防御素1(HBD1)作为抗肿瘤活性分子，通过基因工程手段构建了以LDP为支架具有靶向明胶酶(MMP2/9)的防御素HBD1融合蛋白β1-dFv-LDP，利用抗体靶向结合肿瘤细胞表面及微环境MMP2/9的特性，将HBD1定向运输至肿瘤部位，使其发挥特异性肿瘤细胞毒作用和抗肿瘤免疫作用，同时抑制MMP2/9的表达或者活性，为胰腺癌靶向治疗药物的研究提供借鉴与参考。本研究中我们通过分子生物学方法构建了重组表达载体PET-30a/β1-dFv-LDP，通过大肠杆菌表达体系诱导表达，产物主要以包涵体的形式存在，经纯化复性后每升发酵液可以获得20mgβ1-dFv-LDP融合蛋白，该融合蛋白对明胶酶抗原具有与dFv-LDP相似的的亲和活性。
　　第三部分 靶向EGFR/明胶酶的双特异性单链抗体融合蛋白Fv(E)-LDP-Fv(M)的制备
　　多靶向治疗策略一直是抗肿瘤研究中最热门的话题之一。其中双特异性抗体能同时高效结合两种抗原表位，是多重调控功能的联合靶向抗肿瘤的有效策略之一。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）属于跨膜受体酪氨酸激酶(ErbB)家族成员;EGFR在多种肿瘤细胞表面都异常表达，与人类癌症关系密切，被认为是研究肿瘤治疗的一个重要分子靶点。此外，肿瘤基质金属蛋白酶(MMPs)也在肿瘤进展和侵袭转移过程中起到重要作用，其中明胶酶（MMP-2和MMP-9）在多种肿瘤组织中异常表达，使其成为另一个理想的靶向治疗靶点。力达霉素(Lidamycin，LDM)是一种具有高效抗肿瘤活性的大分子肽类抗肿瘤抗生素，由辅基蛋白(LDP)和烯二炔结构的发色团(AE)两部分组成，发色团是力达霉素分子的活性部分。基于EGFR和MMP2/9在肿瘤发生发展过程中的重要作用，本研究的目的是制备一种同时靶向EGFR和明胶酶的并具有药物导向的双特异性单链抗体融合蛋白Fv(E)-LDP-Fv(M)，该融合蛋白由三部分组成:两个分别靶向EGFR和MMP2/9的scFv作为导向分子，力达霉素作为“弹头”药物，并对其体内外抗肿瘤活性进行检测。表达该重组蛋白的质粒pET30a(+)/Fv(E)-LDP-Fv(M)经过序列测定后，转化于大肠杆菌Transetta(DE3)中，进行诱导表达，产物主要以包涵体的形式存在，目的蛋白经纯化、复性后，每升发酵液可以获得0.5 mg有活性的Fv(E)-LDP-Fv(M)融合蛋白，该融合蛋白对EGFR和明胶酶抗原均有较好的亲和活性。

目录

摘要

第一部分 基于防御素HBD2的巨胞饮介导融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性和作用机制研究

前言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

参考文献

第二部分 基于防御素HBD1的双单链抗体融合蛋白的制备

前言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

参考文献

第三部分 靶向EGFR／明胶酶的双特异性单链抗体融合蛋白Fv(E)-LDP-Fv(M)的制备

前言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果与讨论

参考文献

结论和创新点

文献综述 双特异性抗体在肿瘤治疗中的研究进展

附录

致谢

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