alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法及其在生物样本中的应用

摘要

本发明涉及一种alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法及其在生物样本中的应用。制备方法步骤为：将NBD-Cl溶解于氯仿中，溶解浓度0.002~0.012？g/mL，？然后加入体积浓度为0.2%~1.2%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得棕色产物alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针。适用于生物样本中alpha-酮戊二酸的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；其中生物样本主要包括血清、活细胞、肌肉组织等，可应用于分析化学、生命有机分析、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。具有响应性好、数据的准确性、重现性、精密度高等优点，设备便捷易操作，可实施性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法及其在生物样本中的应用。

背景技术

目前，针对alpha-酮戊二酸的分析化学方法主要包括气相（GC）、高效液相色谱(HPLC)与质谱（MS）、紫外检测器（UV-detector）等。而荧光分子探针检测方法数量甚少，包括利用硝基苯并噻二唑肼（nitrobenzothiadiazole hydrazine DT）和 萘酰亚胺肼取代物（hydrazino-substituted naphthalimide）荧光分子探针对alpha-酮戊二酸进行监测。

色谱检测方法已经在很多领域得以应用，但对于临床医学生物样本的快速批量检测来说并不是最好的选择。其原因在于：首先，技术步骤复杂，样品处理步骤繁多、工作量大、操作时间长、效率低下等。这对于医学生物样本，特别是活细胞、活体检测是完全没有可能实现的。其次，样品需求量大，试剂消耗量大。生物样本的特点在于样本量微小，而色谱联合大型仪器检测的方法则往往需要预处理较大数量的待测样本来达到目标物纯化、富集、分离的目的，因此并不适用于微量样本分析。最后，大型仪器本身成本高，且操作往往步骤缜密，不易于掌握和推广，在高效率快节奏的现代社会，此类方法的应用似乎达到了发展的瓶颈期。

荧光分子探针检测主要通过设计荧光分子探针对待测物进行高度选择检测，从而产生荧光响应的改变，并利用光学信号的差异性质来对待测物进行高灵敏检测。步骤大体概括为：分子设计、样品检测等。基于荧光分子探针的检测与应用是分析技术中比较新颖的技术，其原理在于通过分子设计思想，将发光基团与反应基团连接得到分子探针。检测时，探针通过反应基团的特异性反应来识别目标物，分子结构的改变将对发光基团造成影响，使荧光信号发生改变，从而实现对目标物的检测或生物成像。从其检测原理可见此类方法优势在于选择性好，不需要待测物分离，操作简便，适于样品的批量分析。所以该方法在生命分析研究领域备受推崇。然而，对于alpha-酮戊二酸，此类方法非常少见，说明学术界目前的研究程度还远远不够。从目前所报导的两种方法来看，存在如下缺限：

首先，荧光响应差，灵敏度较低，发光原理不利于生物样本检测。从现有报导来看，现有探针与待测物alpha-酮戊二酸反应后，荧光增强约7-9倍，很难实现高灵敏检测。虽然借助添加表面活性剂的方法来实现荧光增强，但这种方法将破坏生物环境同时会带来较大的误差，因而并不适于生物样本的实际检测。因此，探针本身的分子结构设计有待改进。

其次，检测准确性、精确密等指标有待改善。众所周知，相对于大型仪器较高的信号稳定性，生物传感往往带来较大误差。虽然荧光探针的信号自校正功能可有效改善这一缺点。但现有报导并没有对这一缺点实施改善。并且现有探针分子发光原理不利于分子荧光的强烈增加。所以，探针的功能性设计及发光机理均有待改进。

再次，检测的便捷程度仍有待提高。目前，生命有机分析检测领域中涌现出很多快捷方便的检测手段，包括比色法、肉眼监测等等。这些方法已在细胞分析、活体监测等领域广为使用，但alpha-酮戊二酸的比色/肉眼观测技术却依然处于研究的空白。因此，将检测方法进一步改善，将实验操作的便捷程度继续提高是alpha-酮戊二酸检测方法开发的实际需求。

最后，缺乏对alpha-酮戊二酸成像技术的研究。细胞/组织成像技术是荧光探针优势的独特体现。该技术可实现疾病的可视化监测与治疗，对于癌症等重大疾病的发现与诊断有着非凡的意义。但前人所报导的方法中并未涉及这一技术及应用。因而，开发适于细胞成像的分子探针，建立可视化监测平台将从本质上改变alpha-酮戊二酸的研究方式，有望实现对alpha-酮戊二酸所致癌症疾病的可视化研究。因此，成像技术及应用亟待开展。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法，制备得到的分子探针可应用于生物样本检测，具有响应性好、数据的准确性、重现性、精密度高等优点，设备便捷易操作，可实施性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。

本发明技术方案如下：

一种alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法，步骤为：将NBD-Cl (7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazole) 溶解于氯仿中，溶解浓度0.002～0.012 g/mL， 然后加入体积浓度为0.2～1.2%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得棕色产物alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针。

上述制备方法中，所述的NBD-Cl溶解于氯仿中溶解浓度优选0.006g/mL；水合肼-甲醇溶液体积浓度优选0.6%。

所述的alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针，检测效果指标如下：

检测灵敏度: 检测限0.9µmoL/L；荧光增强倍数为20～60倍；

吸收波长改变：检测时吸收向红光移动100 nm；

颜色变化：在日光灯下颜色由淡绿色变为红色；紫外灯下的颜色由无色变为绿色；

双重定量校正：兼具荧光定量功能及吸收峰比率定量功能；

光学机理指标：兼具PET荧光开关功能及吸收红移功能。

上述alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的应用：适用于生物样本中alpha-酮戊二酸的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；其中生物样本主要包括血清、活细胞、肌肉组织等，可应用于分析化学、生命有机分析、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。

本发明alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针定量分析生物样本中alpha-酮戊二酸时，适用于检测血清中alpha-酮戊二酸含量。

本发明荧光/紫外分子探针检测血清中alpha-酮戊二酸含量的方法，步骤包括：

1）配制溶液

探针HNBD储备液配制： 准确称取alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为2×10^-4M的探针HNBD储备液；

待测目标物alpha-酮戊二酸（α-KA）储备液配制： 准确称取待测目标物alpha-酮戊二酸溶于无水乙腈，配制浓度为1×10^-3>

血清储备液配制：将血清和无水乙腈按体积比5:1混合，转速5000 rpm离心20min，取上清液过0.2 µm膜处理得血清储备液；

2）建立血清/alpha-酮戊二酸标准品的线性方程

取步骤1）配制的待测目标物alpha-酮戊二酸储备液稀释得到梯度浓度为2～900µM的alpha-酮戊二酸标准品溶液，然后分别取200 µL稀释后2～900µM alpha-酮戊二酸标准品溶液与100µL探针HNBD储备液和650 µL血清储备液混合后，加入50 µL 度为10 mM、 pH7.4的PBS 缓冲液，振摇混合均匀，于37 ℃下放置60min，然后经荧光分光光度计和紫外光谱仪检测，建立血清/α-KA浓度与荧光信号强度的线性方程或血清/α-KA浓度与紫外吸收信号强度的线性方程；

荧光或紫外方法检测血清待测样品中alpha-酮戊二酸含量

a）荧光检测待测样品：将1000µL待测样品注入石英比色皿后，于荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入血清/α-KA浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得alpha-酮戊二酸含量；

b）紫外检测待测样品：将1000µL待测样品注入石英比色皿后，置入紫外分光光度计，收集最大吸收波长位置的强度，求出反应前后最大吸收峰强度比率并代入血清/α-KA浓度与紫外吸收信号强度，计算得alpha-酮戊二酸含量。

上述荧光/紫外分子探针检测血清中alpha-酮戊二酸含量的应用，最优检测范围为荧光3～900µmol/L， 紫外80～200µmol/L。分别以荧光检测、紫外检测的方法对待测物进行平行多次检测（n=7），并与标准品进行校准，得到荧光/紫外检测的最优检测范围，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择最优化的检测手段进行定量。

本发明alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针定性分析生物样本中alpha-酮戊二酸时，适用于血清样品中alpha-酮戊二酸的肉眼监测、活细胞内alpha-酮戊二酸的监测和肌肉组织内alpha-酮戊二酸的监测。

1、血清样品中alpha-酮戊二酸的肉眼监测，方法为： 将待测血清样品和无水乙腈按体积比5:1混合，转速5000 rpm离心20min，取上清液过0.2 µm膜处理，取所得上清液200µL并依次加入100µL探针HNBD储备液和200µL alpha-酮戊二酸储备液，然后用pH 7.4的PBS缓冲液定容至1000µL，所得溶液在37 ℃保存50～70min，置于荧光显微镜下观测成像，根据发光情况判断血清样品中是否含有alpha-酮戊二酸；

颜色判断方法：若紫外灯下显绿色或日光灯下淡红色，则含有alpha-酮戊二酸。

所述探针HNBD储备液和alpha-酮戊二酸储备液配制方法与上述检测血清中alpha-酮戊二酸含量的方法相同。

2、活细胞内alpha-酮戊二酸的监测，方法为： 将待测活细胞置入培养基中培育18～26h，待测活细胞在培养基中达到2×10^>~9×10>7个/mL时，加入3～5倍体积20>

判断方法：紫外灯下显绿色，则含有alpha-酮戊二酸。

所述的活细胞优选酵母菌细胞；所述的培养基优选蛋白胨葡萄糖琼脂。

3、肌肉组织内alpha-酮戊二酸的监测，方法为：将待测肌肉组织切成厚1～1.5㎜的片层，与3～5倍体积20 µM的探针HNBD-乙腈溶液，在37℃下于培养基中共培育1～2 h，然后用PBS缓冲液洗涤，置于荧光显微镜下观测成像，根据发光情况判断待肌肉组织中是否含有alpha-酮戊二酸；

判断方法：紫外灯下显绿色，则含有alpha-酮戊二酸。

所述的培养基由1wt%脂提取物、2wt%蛋白胨和 2wt%葡萄糖的水溶液在121℃培养20min制得。

本发明制备的alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针检测机理：

alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的设计方案，原理为：借助优秀的荧光母环NBD，利用光致电子转移机理（PET）使其荧光淬灭；同时该淬灭基团对待测物alpha-酮戊二酸具备良好的反应特性，反应后要求产物的分子前线轨道能量有较大幅度改变致PET机理被阻止，从而释放出强荧光信号并提高灵敏度；另外前线轨道能量差值应有所减小，以使吸收波长红移，从而显示出可见光颜色为肉眼观测提供保证。

荧光母环NBD分子具有长波吸收和发射、高量子产率、优良的细胞穿透性、低毒性以及良好的可获得性等优点。alpha-酮戊二酸分子结构中羧酸邻位存在一羰基，该基团可与给电子基团（如-氨基）反应，改变基团的电子供效。因此，以NBD作母体发光环，将NBD-Cl分子7号位的元素氯取代成为肼基，得到本发明alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针（即探针HNBD），然后将其应用于生物样本检测，机理如图1所示（其中HNBD-alpha-KA分式中发光基团颜色为绿色）。

由图1对该探针在激发态时的能量计算可以看出，HNBD分子中，氨基作为给电子基团（Donor 1）其激发态能量（-8.92eV）远高于待测物alpha-酮戊二酸的最高占据轨道能量(-11.34eV)，因而可轻易导致PET电子转移过程的发生，从而使探针本身处于荧光淬灭状态。而一旦与待测物结合后，给电子基团变为图中所示的Donor2，其能量显著降低至Acceptor能量之下，致PET过程受抑制，从而使荧光得以释放。该过程将使探针与目标物反应后荧光强度出现大幅提升，显著提高检测信号的灵敏度。另外值得注意的是，在探针HNBD与目标物alpha-酮戊二酸结合成产物HNBD-alpha-KA后，其前线轨道能量之差将变小。因此，从理论层面上可以看出，产物的吸收光谱有可能向长波区移动，而这一点对于解决前面提到的关于实现肉眼观测技术问题有着重要的意义。因此，构建HNBD这一有机分子作为alpha-酮戊二酸的多功能分子探针切实可行。

本发明技术方案有益效果为：

1）灵敏度更高：

目前文献报导同类方法检测限为6µM，且该检测限度是在向体系中添加表面活性剂等附加材料之后所达到，而本发明方法中，在不加任何表面活性剂的条件下即可实现检测限为0.9µM，灵敏度大大提高，同时避免附加材料的添加,减少了误差来源。

2）多通道检测，准确度更高：

本发明方法所开发的探针同时兼具荧光开关功能及波长位移功能，这一功能是以往所报导以荧光探针检测待测物α-KA的方法中所不具备的。本发明方法可以荧光由关闭至打开状态所致响应增强予以定量，同时亦可利用吸收波长位移所致强度比率予以定量。其中，比率定量方法可有效降低背景干扰，使定量准确性提高，同时紫外吸收定量可与荧光定量相互校正，即可自校正功能，从而大大提高了检测结果的准确性。

3）发光机理新颖独特，更适于光学检测：

本发明探针的发光机理为PET光致电子转移机理与吸收红移的组合，原理非常新颖。其中PET过程使原本处于淬灭状态的探针在遇待测物后荧光大幅增强，可带来高灵敏响应；并且，探针所兼具的吸收红移是以紫外可见380 nm 的波数为起点向红光区转移，从而使产物的颜色显著改变，因而比其他单一机理的探针更适于光信号传感分析检测。且过程中荧光无发射位移，因而不会干扰比色分析。

4）多种生物样品成像：

成功实施了待测物在活细胞、肌肉组织中的成像，这同样也是前人方法中所未能实现的。成像的实现对于α-KA这一生物标志物的深入研究起到很大的推动作用。

5）肉眼监测，方便快捷：

本发明探针和检测方法填补了α-KA检测方法的空白，使待测物的肉眼监测（无需仪器，直接观测）成为可能，检测过程比普通探针更加快捷。

附图说明

图1为本发明alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针检测及发光原理示意图；

图2为实施例1探针HNBD和HNBD-α-KA的高效液相色谱-紫外图谱: (a)探针分子HNBD，(b) HNBD-α-KA ，(c) 探针HNBD、HNBD-α-KA；

图3为实施例1探针HNBD和HNBD-α-KA的高相液相色谱-一级（MS）及二级（MS/MS）质谱图：探针HNBD (a: MS； b: MS/MS) ； HNBD-α-KA (c: MS；d: MS/MS)；

图4为实施例2血清/α-KA浓度与荧光信号强度的线性方程；

图5为实施例2血清/α-KA浓度与紫外吸收信号强度的线性方程；

图6为实施例2中不同待测物α-KA浓度（1: 0 µM, 2: 5 µM, 3: 100 µM, 4: 300 µM,5: 400 µM, 6: 600 µM, 7: 700 µM, 8: 900 µM, 9: 1000 µM,）在紫外（上）和日光灯（下）照射下的照片( HNBD: 20 µM; PBS buffer (pH 7.4)；

图7为血清样品在紫外灯和日光灯下的发光图， 1: 空白血清, 2: 空白+HNBD, 3: 空白+α-KA, 4: 空白+HNBD+α-KA, 其中HNBD: 20 µM; α-KA: 200 µM, PBS buffer (pH7.4)；

图8为血清中待测物α-KA与荧光信号的线性关系；1为PBS溶液数据、2为血清中数据；

图9为酵母菌细胞成像实验：a (空白), b (空白+200 µM α-KA), c (空白+20 µMHNBD) 和 d (空白+20 µM HNBD+200 µM α-KA)；

图10为新鲜猪肉组织成像实验： c (空白), d (空白+200 µM α-KA), g (空白+20 µMHNBD) 和 h (空白+20 µM HNBD+200 µM α-KA)；

图11为不同浓度探针HNBD响应强度图；

图12为探针HNBD在有/无待测物200 µM α-KA存在条件下的荧光信号响应 ：上/下两条趋势线分别为探针分子在有/无待测物200 µM α-KA存在条件下的荧光信号响应；

图13为探针HNBD (20 µM)与 α-KA (200 µM)在pH 范围为5.4~7.4内的荧光响应；

图14温度对探针HNBD (20 µM) 与 α-KA (200 µM)反应的荧光信号影响；

图15离子强度对探针HNBD (20 µM) 与 α-KA (100 µM) 反应体系的影响；

图16探针HNBD对不同浓度的待测目标物α-KA的荧光响应图（α-KA浓度：0~900 µM）；

图17探针HNBD对不同浓度pH值荧光响应图；

图18探针HNBD对待测物α-KA及其他物质选择性对照实验结果。

具体实施方式

通过结合具体实施例描述本发明，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。

将本发明实施例中高效液相-质谱分析是利用Agilent 1290连接Agilent 6460三重四极杆质谱系统 (Agilent, USA)，并配备Agilent Jet Stream电喷雾系统. 高效率液相色谱分离是借助SB C18 柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.8 µm i.d., Agilent, USA)来完成。 高效液相–紫外分析实验是采用Agilent 1260 在线真空抽气装置、自动进行样器、荧光检测器联合工作。分离梯度设为 0 分钟: 70% A+30% B; 10 分钟: 0% A+100% B; 15分钟: 0% A+100% B; 其中 A 与 B分别为0.5% 甲酸+5% 乙腈 和 100% 乙腈溶液。荧光检测是利用日立Hitachi F-7000 荧光光谱仪来进行，激发波长为475 nm，发射波长为540nm, 激发和发射狭缝宽度均为 10.0 nm, 电压400V，扫描速度2400纳米/分。紫外可见光谱是通过Cary 300 Bio紫外可见光谱仪来进行，扫描范围为350-700纳米。荧光成像观测是通过Olympus, IX73-DP80 (Japan) 倒置荧光显微镜来进行。化合物的分离纯化是采用薄层色谱硅胶柱来实现(填料 300-400 目)。

实施例1：制备alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针

将0.3g NBD-Cl溶解至50mL氯仿中，然后加入50mL体积浓度0.6%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌30min，得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得0.29g棕色产物，即为alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针（探针HNBD），收率为97%。

制备得到的alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针效果判断指标如下：

检测灵敏度: 检测限0.9µmol/L；荧光增强倍数为20～60倍；

吸收波长改变：检测时吸收向红光移动100 nm；

双通道颜色变化：在日光灯下颜色由淡绿色变为红色；紫外灯下的颜色由无色变为绿色；

双重定量校正：兼具荧光定量功能及吸收峰比率定量功能；

光学机理指标：兼具PET荧光开关功能及吸收红移功能。

实施例1制备的探针HNBD与alpha-酮戊二酸反应可行性验证：取0.1克探针HNBD溶于80mL乙腈中，向其中加入2倍当量alpha-酮戊二酸并在室温下搅拌1h，得产物 HNBD-α-KA，所得产物经半制备色谱分离(色谱条件：Wates 600 controller； 检测器：waters2489；洗脱条件：条件: 0-5 分钟 100% A, 5-7分钟 5% A+95% B; 7-15分钟：0% A+100%B；15-18分钟：0% A+100% B)。

通过高效率液相色谱-紫外、高效液相色谱-质谱进行表征，可见产物HNBD-α-KA正是由探针HNBD 7号位的肼基与alpha-酮戊二酸的羰基综合而成。探针HNBD和产物HNBD-α-KA的高效率液相色谱-紫外、高效液相色谱-质谱分别见图2和图3。

实施例2：检测血清中alpha-酮戊二酸含量（采用实施例1制备的alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针）

取癌症患者血清样品（食管癌、右侧乳腺癌、右侧结肠癌、直肠癌）加入alpha-酮戊二酸标准品后制成alpha-酮戊二酸血清模型（100 µM）作为检测对象：

配制溶液

探针HNBD储备液配制： 准确称取alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为2×10^-4>

待测目标物alpha-酮戊二酸（α-KA）储备液配制： 准确称取待测目标物alpha-酮戊二酸溶于无水乙腈，配制浓度为1×10^-3>

血清储备液配制：将血清和无水乙腈按体积比5:1混合，转速5000 rpm离心20min，取上清液过0.2µm膜处理得血清储备液；

建立血清/alpha-酮戊二酸标准品的线性方程

取步骤1）配制的待测目标物alpha-酮戊二酸储备液稀释得到梯度浓度分别为0 µM,、5µM、100 µM、300 µM、400 µM、600 µM、700 µM、900 µM和1000 µM的alpha-酮戊二酸标准品溶液，然后分别取200 µL稀释后上述alpha-酮戊二酸标准品溶液与100µL探针HNBD储备液和650 µL血清储备液混合后，加入50 µL 度为10 mM、 pH7.4的PBS 缓冲液，振摇混合均匀，于37 ℃下放置60min，然后经荧光分光光度计和紫外光谱仪检测，建立血清/α-KA浓度与荧光信号强度的线性方程（图4）或血清/α-KA浓度与紫外吸收信号强度的线性方程（图5）；

荧光或紫外方法检测血清待测样品中alpha-酮戊二酸含量

a）荧光检测待测样品：将1000µL待测血清样品注入石英比色皿后，于荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入血清/α-KA浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得alpha-酮戊二酸含量为99.07 ~ 99.34 µM；

b）紫外检测待测样品：将1000µL待测血清样品注入石英比色皿后，置入紫外分光光度计，收集最大吸收波长位置的强度，求出反应前后最大吸收峰强度比率并代入血清/α-KA浓度与紫外吸收信号强度，计算得alpha-酮戊二酸含量为99.45 ~ 99.79 µM。

本实施例: 四种血清模型样品荧光（FLD）和紫外(UV)检测含量分别为：食管癌：FLD: 99.07, UV： 99.45；右侧乳腺癌：FLD: 99.20, UV： 99.58；右侧结肠癌：FLD: 99.34,UV： 99.48；直肠癌：FLD: 99.31, UV： 99.79；误差范围：FLD：-0.93% ~ -0.56%； UV： -0.55%~-0.21%.

结果表明，alpha-酮戊二酸（α-KA）在2～900 µM的浓度范围内（比文献报道的10^-3～10^{-5>M更宽Ind. Eng. Chem. Res. 2015, 54, 2886−2893）对本发明探针HNBD引起的响应信号呈现线性关系 （图4），检测限为0.9µmol/L （优于文献所报道的 6µM Ind. Eng. Chem.Res. 2015, 54, 2886−2893 ），并且在较宽的浓度范围内表现出良好的相关系数（r2>=0.9921.）。}

同时，紫外吸收波长移动前后的强度比率对待测物浓度呈现出线性相关性（图5），这使得定量的准确性大大提高。而且，考虑到在生物样品中可能存在的待测物α-KA的浓度级别，紫外吸收比率所得线性范围（80～190 µM）刚好适合在生物样品中定量，从而提高了方法的生物适用性。此外，大幅的吸收红移使得体系的颜色由绿色转变成红色，这一剧烈变化保证了痕量待测物的肉眼监测（图6），这一特性在荧光探针检测α-KA的领域中首次出现，前人所报道的检测方法均无此特性（Chem. Sci., 2014, 5, 4012）

根据实施例2溶液制备方法分别配制 1: 空白血清, 2: 空白+HNBD, 3: 空白+α-KA,4: 空白+HNBD+α-KA，四种待测溶液，其中HNBD: 20 µM; α-KA: 200 µM, PBS buffer (pH7.4), 在37 ℃ 条件下保存60min。通过对比可见，空白+HNBD的样品并未呈现吸收红移，同时在紫外灯下荧光始终处于淬灭状态，这表明血清基质不会对本探针造成干扰。而加入待测物α-KA后，在紫外灯下出现明显绿色，表明荧光被打开（PET被禁止）同时在日光灯下出现了橙红的颜色(图6)，表明可以实现对血清样品中的目标物α-KA进行肉眼比色监测（图7）。

实施例3：血清样品中alpha-酮戊二酸的肉眼监测（样品同实施例2）

方法为： 将待测血清样品和无水乙腈按体积比5:1混合，转速5000 rpm离心20min，取上清液过0.2µm膜处理，取所得上清液200µL并依次加入100µL探针HNBD储备液和200µLalpha-酮戊二酸储备液，然后用pH 7.4的PBS 缓冲液定容至1000µL，所得溶液在37 ℃保存60min，置于荧光显微镜下观测成像，颜色为：紫外灯下为绿色，日光灯下为淡红，证明含有alpha-酮戊二酸。

探针HNBD储备液和alpha-酮戊二酸储备液配制方法与实施例2相同。

由图7空白+HNBD的样品，可以看出并没有吸收红移出现，同时在紫外灯下荧光始终处于淬灭状态，这表明血清基质不会对本探针造成干扰。而加入待测物α-KA后，在紫外灯下出现明显绿色，表明荧光被打开（PET被禁止）同时在日光灯下出现了橙红的颜色，这一现在表明可以实现对血清样品中的目标物α-KA进行肉眼比色观测。同时，由血清中待测物α-KA与荧光信号的线性关系（图8）可以看出，人血清溶液中，在0～900 µM的待测物范围内，荧光线号是呈现线性相关的，同时以紫外吸收所建立的关系也符合线性变化规律。

实施例4: 活细胞内alpha-酮戊二酸的监测（以酵母菌为例）

方法为：将酵母菌细胞置入酵母蛋白胨葡萄糖琼脂中培育24h，待酵母菌细胞在培养基中达到2×10>7~9×10>7个/mL时，然后加入3倍体积20>

对比试验分析：在紫外波长激发下，酵母菌细胞（如图9所示）分别与空白、HNBD(20 µM)和α-KA (200 µM) 于37 ℃, 共培育24 h后并未呈现出荧光发射, 其中空白液是由细胞在脂提取物 (1%), 蛋白胨(2% ) 和 葡萄糖 (2%) 混合物中培养20 min制成。这表明探针HNBD对于细胞中的各种物质是光学免疫的，即细胞基质未造成光学干扰。而当加入10倍量的待测物α-KA时，在紫外灯下出现明显的发射效果，绿色荧光的成像得以顺利观察到。这说明探针HNBD具有优异的膜穿透性，同时探针HNBD可以应用于细胞成像方面。

实施例5：肌肉组织内alpha-酮戊二酸的监测（以新鲜猪肉组织为例）

方法为：将新鲜猪肉组织切成厚1㎜的片层，与3倍体积20 µM的 探针HNBD-乙腈溶液在37 ℃下培育1h，（1wt%脂提取物、2wt%蛋白胨和 2wt%葡萄糖的水溶液在121℃培养20min制得），然后用PBS缓冲液洗涤，置入荧光显微器下观测成像，新鲜猪肉组织中alpha-酮戊二酸颜色为：绿色（紫外灯下），证明含有alpha-酮戊二酸。

对比试验验证：实验结果（如图10所示）(37 ℃, 共培育24 h，c (空白), d (空白+200 µM α-KA), g (空白+20 µM HNBD) 和 h (空白+20 µM HNBD+200 µM α-KA), 其中空白液是肌肉组织在1wt%脂提取物、2wt%蛋白胨和 2wt%葡萄糖的水溶液在121℃培养20min制得。表明在不加入待测物的情况下，空白样品与探针共培育后几乎未呈现荧光发射。在与10倍当量待测物α-KA共培育60min后，可观察到荧光发射显著增强，呈现出清晰的组织荧光图像。这些现象证实了该探针对于粗壮的肌肉纹理组织仍然具有良好的穿透性，因而适合于肌肉组织成像。

本发明alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针各项技术指标的实验验证，具体如下：

探针用量优化

探针用量关系到检测的灵敏度及试剂消耗等重要指标，往往做为检测优化的首要因素来进行调查研究。根据本探针的发光特点，其灵敏度应属较高，因此在实际检测时所需探针浓度应较低。如给定浓度偏高则由可能出现自淬灭使信息强度降低。因此，选择了10~50 µM的浓度范围来进行优化。结果表明，在待测物浓度为200 µM时，浓度为20 µM的探针具有最强响应。该浓度将带入到后续优化实验过程（图 11）。

反应时间优化

反应时间将影响探针分子HNBD与待测物α-KA的反应效率与反应程度，同时也将决定最终信号的强度与稳定性。因此，在确定探针浓度后，对反应的时间进行优化，温度：37 ℃,缓冲溶液PBS，pH为 7.4。从图12中可以看出，在反应前60分钟内，荧光信号呈上升趋势后至平台期，从而可确定反应时间为60分钟。相比之下，不含待测物的探针溶液则未出现荧光强度的变化，这说明信号响应为待测物所致。

反应体系pH值的优化

pH 值往往对有机分子探针的光学性质有一定影响，因而在反应中往往通过缓冲溶液予以控制从而满足实验需要。针对本发明应用对象（血清、细胞、组织）自身特点，研究了在动物体生理环境下可能达到的pH值 （5.4~7.4）。从图13（37℃, 60 min）中可见，生理范围内pH值的微小波动对于目标物与探针的混合体系所呈现的荧光强度响应影响甚小。因此，在通常的生物体系中，即pH值为7.4时，生物体酸度环境不会对探针的应用造成影响。

反应温度的优化

温度对化学反应的影响至关重要，对于本发明所研究的生物样本如活细胞、组织体系更是如此。通常动物体的温度一般为37 ℃左右，在此温度下探针能否对待测目标物有良好的响应将关系到整个实验的成败。如图14(缓冲溶液：PBS buffer (pH 7.4)，温度：37 ℃，时间：60 min)所示，我们对温度在10~40 ℃范围的反应所带来的荧光响应进行了调查。从中不难发现，本探针在37℃时与待测物反应给出良好的荧光响应，因而特别适合于生物样本的应用与研究。

离子强度对荧光信号的影响

离子强度，作为溶液中特有的因素也有可能对荧光信号造成一定影响。在生物体系中，电解质以氯化钠为主，因此本发明确定以生理条件下的氯化钠浓度（100 mM）来模拟实际样品体系的电解质环境，从而进一步论证本方法在实际体系中的可行性。图15（NaCl: 100mM，缓冲溶液：PBS buffer (pH 7.4)，温度：37 ℃，时间：60 min）中可见，氯化钠的存在对于荧光信号几乎未造成影响，这说明本探针完全适合在生命体系离子强度氛围内对待测物实施检测。

光学性质与机理验证

本发明旨在发明一种具备新颖发光机理的多功能分子探针。 探针分子HNBD的发射光谱强度非常微弱（如图16所示），表明该分子内出现了可以让荧光有效淬灭的电子行为。

为证实这一行为属PET机理，本发明以量子化学计算方法对探针激发态进行了模拟（密度泛海理论，基组水平 B3LYP 6-31g(d,p)¹）。从结果来看，在探针分子中，氨基的能量足以导致有效的PET机理发生，从而淬灭荧光。并且在HNBD结合待测物后，其PET过程被拟制，则荧光释放。在探针与待测物反应后的混合液中，荧光强度有着明显提升，最大可增强60倍。这说明合理的PET荧光机理设计使得荧光探针具备了关闭/打开的切换功能。不仅如此，为进一步验证该机理，本发明验证了不同pH值对探针HNBD的荧光影响。考虑到HNBD所带肼基的碱性,>

事实上，HNBD与目标物α-KA反应后的产物HNBD-α-KA显示出极大的吸收红移，这可能是由于在转换为产物之后，HNBD-α-KA的前线轨道能量之差比探针HNBD分子的前线轨道能量之差有所减少，从而导致了吸收能量的降低，即出现吸收光谱的红移。同时，并没有出现发射光谱的红移现象，这表明本探针发光机理应属非常新颖的荧光开关+吸收红移机理。因此，凭借这些光学特性，本发明可以实现灵敏的检测响应、肉眼监测，甚至是吸收比率校正检测。同时这也表明本探针的设计是非常成功的。

探针分子检测α-KA的选择性分析

下述物质储备液配制方法：分别以二次蒸馏水溶解氨基酸（Ala, Cys, His, Met,Arg, Gln, Ile, Phe, Asn, Leu, Pro, Asp, Gly, Lys, Sar, Ser, Thr, Trp, Val,Glu）、葡萄糖（Glucose）、甘露糖（Galactose）、乙二醛（Glyoxal）、过氧化氢(H­₂O₂)、丙酮酸钠（sodium>

基于本探针较强的荧光响应，本发明分析了探针HNBD对α-KA的选择性，其比较对象包括葡萄糖（Glucose）、甘露糖（Galactose）、乙二醛（Glyoxal）、过氧化氢(H_­2O₂)、丙酮酸钠（sodium>­2O₂)，丙酮酸钠sodium>

首先，相对于待测物α-KA，HNBD对氨基酸表现出极差的响应，这应该是由于氨基酸与α-KA在结构上有明显不同所致。当加入过量醛糖、酮糖、乙二醛、丙酮酸盐和苯甲酰甲醛时，HNBD依然保持了对待测物α-KA优秀的选择性。虽然200 µM的丙酮醛引起了HNBD的微小响应，但这并不会带来检测的干扰，毕竟丙酮醛在生物体内可能存在的浓度一般小于2 µM。因此，优秀的选择性使得HNBD完全适合在生物样本中的应用。同时，通过pH滴定实验发现，在pH值为5.4~7.4的区间范围，荧光的强度未出现在显著变化，这表明该探针在生物环境即pH为7.4时是完全适用的。此外，温度实验也证实了本探针非常适用于生物样品。