一种检测白介素28B三个SNP位点基因型的试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及一种检测白介素28B三个SNP位点基因型的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂以及用于扩增样本DNA中IL28-B三个SNP位点的PCR引物。检测方法包括样品采集、PCR扩增以及测序。本发明通过特异的PCR扩增、并对PCR产物进行正反向测序，可以精确的检测到3个SNP位点的基因型；可对不同基因型的患者采取区别对待及治疗，对丙型肝炎标准方案的疗效进行预测，提高丙型肝炎的诊疗水平。

说明书

技术领域

本发明属于试剂盒领域，特别涉及一种检测白介素28B三个SNP位点基因型的试剂盒及 其检测方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)的感染已经成为一个世界性的卫生难题。据流行病 学调查，全球HCV的感染人口接近3％，并且以每年300-400万的病例递增,是目前国际上慢 性终末期肝病和肝癌的主要病因之一。由于缺乏有效的疫苗，因此及早发现并给予有效的抗 HCV病毒治疗，是丙型肝炎患者治疗的关键。目前丙型肝炎的抗病毒治疗的标准模式为长效 干扰素-α(Pegylatedinterferon-α，PEG-IFN-α)和利巴韦林(ribavirin，RBV)的联合治疗。由于1 型丙型肝炎患者的持续病毒应答率低，长期服用相关药物所带来的严重不良反应，使得丙型 肝炎的抗病毒治疗成为一大难题。

2009-08/2010-01，世界上有4个独立的研究小组,各自在不同种族的丙型肝炎患者中进行 全基因关联(Genome-WideAssociationStudy，GWAS)研究，证实IL-28B区域附近存在与长效 干扰素-α与利巴韦林标准方案疗效相关的单核苷酸多态位点(SNP)。

美国杜克大学Ge等报道，19号染色体上IL-28B基因上游3kb的一个单核苷酸多态位点 rs12979860，与1型丙型肝炎治疗的持续病毒反应率、标准方案SVR预测的特异性及敏感性 密切相关，可作为预测1型HCV患者标准方案疗效的重要独立指标。研究表明，具有CC 基因型的患者，标准方案治疗所带来的持续病毒反应率比TT型人群要高2倍左右。有研究 证实，rs12979860位点CC型对标准方案SVR预测的特异性及敏感性分别达到了78％和65％, 其作为对1型丙型肝炎患者标准治疗方案的持续病毒反应率(SVR)所具有独特的预测作用， CC型对非CC型的优势比达到了5.79。有研究则进一步证实了该位点的多态性对非1型慢性 丙型肝炎患者，特别是对具有早期病毒学反应(rapidvirologicalresponse,RVR)的这部分患者标 准方案的疗效具有同样的预测作用。

澳大利亚悉尼大学的Suppiah等、日本名古屋城市大学Tanaka等以及瑞士伯尔尼大学 Rauch等人通过在不同种族的丙型肝炎中所进行全基因关联研究中，一致证实了另1个与持 续病毒反应率密切相关的单核苷酸多态位点的存在——即位于IL-28B基因上游8kb的位点 rs8099917。研究表明，相对于其他与1型HCV患者抗病毒方案疗效相关的因素，如年龄、 病毒载量等，rs8099917基因型对持续病毒反应及无病毒反应(NVR)的预测最为重要。常见 的rs8099917位点TT型基因与SVR密切相关,可达到50％,NVR仅为12％，GG型患者中， SVR接近于0％，NVR则可高达80％，GT型的SVR及NVR则介于TT型与GG型之间，这 充分说明rs8099917基因型可以作为预测1型HCV患者标准方案抗病毒治疗的另一个指标， 特别是针对NVR的预测。有研究进一步证实，rs8099917对其他非1型HCV患者联合治疗 方案疗效同样具有预测作用。其中rs8099917位点TT型患者的SVR要高于非TT型患者(SVR 为76％vs51％)，特别是对于其中的2a型HCV患者,经单变量分析可知rs8099917位点TT 型可以作为一个预测持续病毒反应的独立指标。

Tanaka等研究中同时还证实了在日本人中还存在第三个与持续病毒反应率密切相关的单 核苷酸多态位点的存在——即位于IL-28B基因下游3kb的位点rs12980275。在其报告中，该 位点AA型和AG型患者的持续病毒反应率与位点rs8099917十分相似，分别为63.6％和 17.5％。同时，国内学者研究中也显示rs12980275的基因型在SVR、NVR组中的相关性分析 r均大于0，呈正相关。rs12980275基因型AA型与AG型，在SVR和NVR患者中差异均 有统计学意义(P＜0.05)。rs12980275多态性可有效地预测干扰素抗病毒治疗应答效果，具 有独立预测抗病毒治疗的特征。

除上述对治疗效果的预测作用外，IL28B基因还与HCV感染流行特点、HCV的自发清 除率、标准治疗相关的不良反应也存在着一定的关联。有研究发现,HCV慢性感染患者中,非 1型HCV患者，rs12979860位点CC型的概率明显高于1型患者(66.7％vs39.1％)，CC型的 非1型HCV感染率显著高于其他基因型的患者。还有研究表明，无论是欧洲还是非洲人群 中,rs12979860位点CC别的患者发生的病毒自发清除率，要远远高于非CC患者(欧洲人80.3％ vs66.7％；非洲人56.2％vs37.0％)。此外，研究还发现，rs12979860位点TT型患者食欲不 振、乏力等常见不良反应的发生率明显低于非TT型患者，其严重不良反应发生率仅为3.1％， 而在CT型、CC型患者中则分别达到了10.1％、8.9％。因此，IL-28B基因型不仅与SVR存 在着很大的相关性，而且在一定程度上也与HCV感染的流行病学分布、自发清除及治疗中所 带来的各种不良反应相关。

目前已有多个全基因关联研究证实，IL-28B基因区域附近的SNP位点rs8099917， rs12979860和rs12980275基因型与当前标准方案抗病毒疗效密切相关。通过该位点基因型的 检测，可以达到对丙型肝炎标准方案疗效的预测，从而对不同基因型的患者采取区别对待及 治疗的原则,从而改变当前丙型肝炎治疗策略，提高整个丙型肝炎诊疗水平。因此,2011年美 国肝脏病研究协会(AmericanAssociationfortheStudyofLiverDiseases,AASLD)和欧洲肝脏病 学会(EuropeanAssociationForTheStudyOfTheLiver,EASL)在更新的HCV感染防治指南已 将IL-28B基因多态性列为预测慢性HCV感染疗效的重要的因素。

目前关于SNP的检测包括根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚 核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等，但在所有SNP的检测方法中，对待检测 片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法，也是SNP分析的金标准。而IL-28Brs12979860， rs8099917和rs12980275多态性的研究多采用芯片的方法，但该方法准确度不高，并且成本 较高。本实验室采用采用的基于PCR扩增后进行直接测序分析的检测方法，具有准确度高， 特异性和重复性好等特点，可直接对IL-28Brs12979860，rs8099917和rs12980275进行序列 比对分析，能准确对SNP位点的基因型进行直观的判断，是IL-28Brs12979860、rs8099917 和rs12980275SNP分析的金标准。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测白介素28B三个SNP位点基因型的试剂盒及 其检测方法，该试剂盒可用于检测白介素28B三个SNP位点的基因型，特异性好，灵敏度高。

本发明的一种检测白介素28B三个SNP位点基因型的试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩 增反应试剂以及用于扩增样本DNA中IL28-B三个SNP位点的PCR引物；其中，SNP位点 为：rs12979860、rs8099917和rs12980275；相应的PCR引物如下：

IL28B-860F：GGGCGGAAGGAGCAGTT；IL28B-860R：TCAGGGTCAATCACAGAAGG；

IL28B-917F：GGAACAAATCGTCCCAATA；IL28B-917R：GATGAGGCCCCTCACC；

IL28B-275F：AGCAAGAGGAGGGAAGG；IL28B-275R：GCCGGGATTACAGGTC。

所述PCR扩增反应试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂和反应缓冲液(Go-Taq ColorlessMasterMix)。

本发明的一种检测白介素28B三个SNP位点基因型的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

(1)采集待测血液样本，提取DNA；

(2)以该DNA为模板，采用用于扩增样本DNA中IL28-B三个SNP位点的PCR引物进行 PCR扩增，得到PCR反应产物，进行测序分析，确定rs12979860、rs8099917和rs12980275 的基因型。

所述步骤(2)中的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s-62℃每个循环降低0.5℃ 至55℃30s-72℃40s，15个循环；95℃30s，55℃30s，72℃40s，25个循环；最后72℃ 10min。

所述步骤(2)中的PCR反应体系为：PCR扩增反应试剂10μL，ddH₂O6μL，上下游引 物各1μL，样品DNA2μL。

由于白介素28B(IL-28B)基因区域附近的SNP位点rs8099917，rs12979860和rs12980275 基因型与当前标准方案抗病毒疗效密切相关。通过该位点基因型的检测，可以达到对丙型肝 炎标准方案疗效的预测，从而对不同基因型的患者采取区别对待及治疗的原则，从而改变当 前丙型肝炎治疗策略，提高整个丙型肝炎诊疗水平。

有益效果

本发明通过特异的PCR扩增、并对PCR产物进行正反向测序，可以精确的检测到3个 SNP位点的基因型；可对不同基因型的患者采取区别对待及治疗，对丙型肝炎标准方案的疗 效进行预测，提高丙型肝炎的诊疗水平。

附图说明

图1为本发明PCR扩增特异条带电泳图；Marker由1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、 200bp、100bp7条带组成；

图2为rs12979860C/T杂合型(a)和C/C纯合型(b)的测序峰图；

图3为rs8099917T/G杂合型(a)和T/T纯合型(b)的测序峰图；

图4为rs12980275A/G杂合型(a)和A/A纯合型(b)的测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一、样本抽提：

(1)在1.5ml离心管中加入20μl蛋白酶K，200ul血浆/血清(样品需平衡至室温)，加入200μl 缓冲液GB，充分颠倒混匀。

(2)于56℃孵育10min。

(3)加入200μl无水乙醇，涡旋振荡15s混匀。

(4)转移离心管中的溶液和絮状沉淀至吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃废液。

(5)加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30sec，弃废液。

(6)向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec，弃废液。

(7)向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec，弃废液。

(8)放回吸附柱12000rpm离心2min。打开吸附柱盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变 干。

(9)将吸附柱放入一个1.5ml离心管，加入50μlTB，室温放置2-5min，12000rpm离心2min。

(10)弃吸附柱，标记提取好的DNA，若不用-20度冻存。

二、实验过程：

按样品数n(样品数＝待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应液每管18ul 分装于反应管中。

将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2ul分别加入反应管中，混匀，低速离 心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下：

PCR引物：

IL28B-860F GGGCGGAAGGAGCAGTT IL28B-860R TCAGGGTCAATCACAGAAGG IL28B-917F GGAACAAATCGTCCCAATA IL28B-917R GATGAGGCCCCTCACC IL28B-275F AGCAAGAGGAGGGAAGG IL28B-275R GCCGGGATTACAGGTC

PCR反应体系：

Go-Taq Colorless Master Mix 10μL ddH₂O 6μL 引物工作液(上游) 1μL 引物工作液(下游) 1μL 样品DNA 2μL

PCR程序：

电泳鉴定：2％琼脂糖凝胶电泳，180V，20min，凝胶成像系统观察目的条带。

三、测序PCR：

1.试剂配制：按下表进行，冰上操作，分装后保存在-20℃冰箱。

BigDye体系：

酶纯化体系：

原料 1X 需要体积量(ul/管) CIP 0.1ul - Exo I 0.5u l - 去离子水 1.4ul -

2.PCR产物纯化

2.1取出分装好的纯化反应液，在管壁上标好相应的编号。

2.2取9ulPCR产物加入相应编号的管中，混匀(注意不能产生气泡)。

2.3将混匀样品按照如下反应条件上PCR仪，进行酶纯化扩增。

37℃→95℃→4℃

50'5'+∞

2.4纯化好的样品用于下一步测序反应，如当日不用放冷冻保存。

3.测序反应

3.1每个样品做正反两个反应，在相应的薄壁管上写好标记。

3.2每反应体系5ul，BigDye混合液和5P引物固定加1ul，模板一般加2ul，最大量为3ul (根据PCR产物电泳结果调整，)，用水补足5ul。

3.3先加相应量的水，然后加入相应的1ul引物加到水里，再在管壁的不同地方加1ul的 BigDye混合液，最后加入模板。

3.4盖上管盖低速短暂离心，涡旋器混匀，再次低速短暂离心。

3.5按照如下反应条件上PCR仪，进行测序反应。

95℃→95℃→56℃→60℃→4℃

4'15”20”2'+∞

25个循环。

4.测序反应后乙醇纯化，上机。

4.1将扩增完的PCR产物进行短暂离心。在每管一侧贴壁加入2ul的125mMEDTA，然 后在管的另一侧贴壁加入15ul无水乙醇，涡旋混匀。

4.2用板式离心机，4000rpm，离心30min，然后300rpm倒置瞬时离心，除掉上清。

4.3加入50ul的20℃预冷75％乙醇，涡旋混匀，4000rpm、4℃离心15min。

4.4300rpm倒置瞬时离心，除掉上清，然后放置于室温，15min，挥发完乙醇。

4.5乙醇完全挥发后，每管加入水和Hi-Di^TM各5ul，充分涡旋振荡1min.，短暂离心后静 置15min.使测序产物完全溶解。

4.6将Hi-Di^TM溶解产物转移至96孔板的相应位置中。放至PCR扩增仪上，95℃预变性 5min.，迅速转移至冰盒上4℃冷却5min。至3500测序仪上机测序并分析。

数据分析：应用sequencinganalysis软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与NCBI 中检索到的标准序列进行比对，确认样本IL-28B基因3个SNP位点的基因型。