硬蜱科蜱虫COIII基因全长序列的扩增引物及其应用

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体提供了硬蜱科蜱虫COIII基因全长序列的扩增引物及其应用。本发明提供的硬蜱科蜱虫COIII基因的全长序列扩增引物如SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示，其可有效扩增硬蜱科线粒体COⅢ基因序列全长(778bp)，扩增效率达到98.5％。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及硬蜱科蜱虫COIII 基因全长序列的扩增引物及其应用。

背景技术

硬蜱科(Ixodidae)隶属于节肢动物门(Arthropoda)，蛛形纲 (Arachnida)，蜱目(Ixodida)。目前，全世界已知硬蜱种类超过700 种，我国硬蜱记录有效种分属于硬蜱属(Ixodes)、花蜱属 (Amblyomma)、血蜱属(Haemaphysalis)、革蜱属(Dermacentor)、 璃眼蜱属(Hyalomma)、扇头蜱属(Rhipicephalus)以及异扇蜱属 (Anomalohimalaya)7个属共106种。蜱类在宿主体上吸食血液，对 人和家畜危害很大。蜱虫的叮咬，不仅造成宿主血液损失，还可引起 宿主皮肤出现炎症、溃疡等症状。更重要的是，硬蜱作为媒介可传播 人、畜疫病，包括病毒病(森林脑炎、出血热)、立克次体病(Q热)、 细菌病(布氏杆菌)、螺旋体病(莱姆病)以及原虫病(巴贝斯虫、 泰勒虫)等。蜱虫的物种鉴定及蜱媒分布调查是蜱媒及蜱传疫病防控 的重要基础。传统蜱虫物种的分类鉴定主要依据形态学，然而形态学 的鉴定需要经验丰富的专家，而且形态学对蜱虫未成熟个体(卵、幼 虫)及虫体不完整的标本难以鉴定。分子生物学技术可解决上述难题。

利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种有效 的方法。线粒体COⅢ基因具有较高的进化速率和种内保守性，是鉴 定物种和研究物种间进化关系较为理想的靶标基因。然而，Genbank 数据库中硬蜱COⅢ序列较少，且缺少扩增硬蜱科COⅢ基因的通用引 物，严重制约了COⅢ序列在蜱虫系统发生及蜱媒流行病学调查研究 中的应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种硬蜱 科蜱虫COIII基因全长序列的扩增引物。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种硬蜱科蜱虫COIII基 因全长序列的扩增引物，其包括：

COIII-TF：5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3'；

COIII-TR：5'-AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。

本发明还提供一种含有所述引物的用于检测硬蜱科蜱虫的试剂 盒。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、 PCR反应缓冲液中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供了所述引物或所述试剂盒在检测硬蜱科蜱虫中的 应用。

本发明还提供了硬蜱科蜱虫的特异性PCR检测方法，包括以下 步骤：

1)提取样品DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用所述的引物COIII-TF 和COIII-TR进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

进一步地，PCR反应体系以50μl计为：5μL10×PCRbuffer， 2μL引物COⅢ-TF，2μL引物COⅢ-TR，2μLdNTPs(10mM)，4μl2.5 mMMgCl₂，1μLTaq酶，蜱虫DNA模板基因组2μL(10～20ng)，加 灭菌双蒸水至50μl。

进一步地，PCR反应条件为：PCR扩增程序：94℃预变性5min； 94℃变性30S，45℃退火30S，72℃延伸1min，共36个循环；72℃延伸 7min，4℃保存。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的硬蜱科蜱虫COIII基因的扩增引物，可有效扩增硬 蜱科线粒体COⅢ基因全长序列，扩增效率达到98.5％。

附图说明

图1为用本发明所述引物对11种蜱虫DNA样本进行PCR检测的 1％琼脂糖凝胶电泳图；

其中：1：全沟硬蜱Ixodespersuleatus；2：边缘革蜱Dermacentor marginatus；3：嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna；4：长角血蜱 Haemaphysalislongicornis；5：亚洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum；M： DL2000Marker；6：日本血蜱Haemaphysalisjaponica；7：微小扇头 蜱Rhipicephalusmicroplus；8：小亚璃眼蜱Hyalommaanatolicum；9： 草原革蜱Dermacentornuttalli；10：草原血蜱Haemaphysalisverticalis； 11：残缘璃眼蜱Hyalommadetritum。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1、数据收集：从Genbank中下载硬蜱科不同蜱虫物种线粒体CO Ⅲ基因序列(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

2、序列比对：利用MEGA软件中的ClustalW程序将收集到的硬 蜱科蜱虫COⅢ序列进行序列比对，找出较保守、碱基变异度最小的 序列片段。

3、引物合成：根据上述的比对结果，利用引物设计软件Primer5 在碱基变异度最小的序列片段设计出1对兼并扩增引物。

引物序列为：

COIII-TF：5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3'；

COIII-TR：5'-AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。

4、引物扩增：将上述引物分别应用于PCR扩增所采集的表1所示 的硬蜱科5个属11个种265个个体的COⅢ序列的PCR扩增。

表1硬蜱科5个属11个种

5、扩增结果检测：扩增产物用1.5倍的琼脂糖凝胶电泳进行检测 (见图1)。结果显示，该引物可有效扩增硬蜱科线粒体COⅢ基因序 列，共获得265个硬蜱样本中的261个个体的COIII全长序列，扩增效 率达到98.5％。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为780bp。

针对扩增产物进行测序，获取了全沟硬蜱Ixodespersuleatus、边 缘革蜱Dermacentormarginatus、嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna、长 角血蜱Haemaphysalislongicornis、亚洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum、 日本血蜱Haemaphysalisjaponica、微小扇头蜱Rhipicephalus microplus、小亚璃眼蜱Hyalommaanatolicum、草原革蜱Dermacentor nuttall、草原血蜱Haemaphysalisverticalis和残缘璃眼蜱Hyalomma detritum共11个种的线粒体COⅢ基因序列，其具体的核苷酸序列见 SEQIDNo.3-13。

特异性扩增引物条件：

上述COⅢ-TF与COⅢ-TR扩增引物的50μLPCR反应体系为：5μL 10×PCRbuffer，2μL引物COⅢ-TF，2μL引物COⅢ-TR，2μLdNTPs (10mM)，4μl2.5mMMgCl₂，1μLTaq酶，蜱虫DNA模板基因组2μL (10～20ng)，加灭菌双蒸水至50μl。

PCR反应条件：预热94℃，5min；94℃30s，45℃30s，72℃1min， 共36个循环；末次延伸72℃，7min，4℃保存。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。