鸡肝癌细胞系作为鸭瘟病毒宿主的应用

摘要

本发明属于鸭瘟病毒培养技术领域，具体涉及鸭瘟病毒的新宿主细胞，本发明公开了鸡肝癌细胞系作为鸭瘟病毒宿主的应用。传统的鸭胚成纤维细胞原代细胞培养鸭瘟病毒方法，往往受到鸭胚供应、孵化日龄的限制，制备过程费时费力。本发明建立的鸭瘟病毒鸡肝癌细胞系培养方法，病毒生长良好。该传代细胞系培养病毒的方法，不受鸭胚供给影响，具有随用随取，省时省力的优点。本发明表明鸭瘟病毒可以在鸡肝癌细胞系传代细胞培养物上生长繁殖，作为新发现的病毒复制宿主细胞，为相关领域的研究提供了新的技术途径和方法材料。

说明书

技术领域

本发明属于鸭瘟病毒培养技术领域，具体涉及鸭瘟病毒的新宿主细胞。

背景技术

鸭瘟(DuckPlague，DP)是由鸭瘟病毒(DuckPlagueVirus，DPV)引起的常见于鸭、鹅、天鹅、雁等雁行目水禽的一种急性败血性和高度接触性、高度致死性的传染病。该疾病流行广泛、传播迅速、发病率和死亡率均较高，是目前对世界范围水禽养殖业危害最为严重的疫病之一，是养鸭业的大敌。该疫病在我国及世界各地广泛分布，并且造成了严重的危害，所以对该病的研究具有重要的意义。

DPV属于疱疹病毒甲亚科中的鸭疱疹病毒1型。DPV可在9-14日龄鸭胚绒毛尿囊腔内生长繁殖，但DPV的生长受鸭胚来源的影响，如果种鸭免疫过鸭瘟病毒疫苗，种蛋内含有高滴度的DPV特异性母源抗体，则由于病毒的中和作用，DPV不能在鸭胚内生长复制。DPV还可在成纤维样传代细胞系CCL-141中生长增殖，并具有蚀斑易于观察的特点，但病毒产量较原代细胞少5.6倍之多，说明病毒在其中的生长繁殖不及在原代细胞中理想。上述培养方法为目前获取DPV病毒培养物的主要途径。

DPV在鸭胚成纤维细胞(DEF)中生长繁殖的主要现有技术为：使用12日龄左右的鸭胚现用现制备DEF细胞。该方法的不足之处表现为：①受鸭胚供应的限制，在休产期无受精卵可供使用；②受鸭胚来源影响，有一些饲养管理和卫生条件较差的养殖场，一些细菌性垂直传播疾病如沙门氏菌、支原体等病原的存在，容易导致该批次DEF原代细胞的污染，直接影响后续实验的进行。③传统方法制备细胞所需的时间周期较长，每一次制备DEF都需要重复同一个过程，且由于种蛋批次不同，每一次制备DEF的生物学特征可能会存在有差异。

鸡肝癌细胞系(LMH细胞系)是由一位日本学者在1981年所建立的。通过使用二乙基亚硝胺对雄性来航鸡长期进行诱导，导致鸡体产生肝癌，再从肝癌组织中分离细胞而得到的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鸭瘟病毒的新的宿主来源，为本领域的相关研究开辟了新的途径和病毒培养宿主来源，丰富了相关研究的内容。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

鸡肝癌细胞系(LMH)作为鸭瘟病毒(DPV)宿主的应用。

所述的鸡肝癌细胞系优选经过如下预处理：按照常规方法培养鸡肝癌细胞，当细胞刚刚长成细胞单层的时候，固液分离取鸡肝癌细胞，用灭菌PBS清洗细胞表面3次。

其中，所述的固液分离，其手段为倾弃培养液。

鸡肝癌细胞系接种鸭瘟病毒的方法优选为：在细胞瓶中，将鸭瘟病毒种毒液覆盖到鸡肝癌细胞表面，37℃条件下进行吸附20-30min(优选30min)，固液分离，弃病毒液，然后加含体积百分含量为3％的小牛血清和100IU/ml的双抗的DMEM维持营养液于37℃细胞培养箱中培养48-72小时。

其中，较为优选的处理是，吸附过程中，每隔5-10(优选5分钟)轻轻摇动细胞瓶，使病毒在细胞上均匀分布从而充分感染。

其中，所述的固液分离为倾弃上清液。

其中，较为优选的处理是，鸭瘟病毒种毒液用量以能够覆盖细胞单层为宜。

其中，较为优选的处理是，一般对于75cm²细胞培养瓶中，DMEM维持营养液的用量为25毫升。

所述的100IU/ml的双抗为100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的组合。

采用本发明方法以鸡肝癌细胞系为宿主接种鸭瘟病毒，分别采集接种鸭瘟病毒后的细胞(图1所示)和对照细胞(图2所示)，作细胞超薄切片，可以观察到接毒细胞内，有大量的鸭瘟病毒粒子，而对照细胞没有观察到，确定DPV在LMH细胞上生长，鸡肝癌细胞系可以作为鸭瘟病毒的复制宿主。

有益效果：本发明方法与现有技术相比，具有如下优势：

1、传统的鸭胚成纤维细胞原代细胞培养鸭瘟病毒方法，往往受到鸭胚供应、孵化日龄的限制，制备过程费时费力。本发明建立的鸭瘟病毒LMH细胞培养方法，病毒生长良好。该传代细胞系培养病毒的方法，不受鸭胚供给影响，具有随用随取，省时省力的优点。

2、本发明表明鸭瘟病毒可以在鸡肝癌细胞系传代细胞培养物上生长繁殖，作为新发现的病毒复制宿主细胞，为相关领域的研究提供了新的技术途径和方法材料。

附图说明

图1为实施例1中鸭瘟病毒在鸡肝癌细胞系上生长的电镜超薄切片，其中M代表线粒体；N代表细胞核。

图2为实施例1中对照细胞电镜超薄切片。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中，鸡肝癌细胞系来源(来自于ATCC，Number:CRL-2117^TM)。鸭瘟病毒为鸭瘟病毒鸡胚化弱毒株，为本实验室用鸭瘟病毒分离株鸡胚连续传代获得。

实施例1：

按照实验室常规方法培养LMH细胞，当细胞密度达到95％左右的时候，取该刚刚长成单层的LMH，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面3次，然后将DPV种毒接种加入到LMH细胞表面进行接种。鸭瘟病毒液覆盖细胞表面进行吸附，孵育中间每隔5分钟轻轻摇动细胞瓶，使病毒在细胞上均匀分布从而充分感染。37℃吸附30min后弃病毒液，然后加含3％小牛血清和100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的DMEM维持营养液于37℃培养，每天于倒置显微镜下观察CPE的变化。图1为鸭瘟病毒在鸡肝癌细胞系上生长的电镜超薄切片示意图，箭头为鸭瘟病毒，证明鸭瘟病毒可以在LMH细胞上生长。