一种来源于海洋生物的细菌Pseudoalteromonas.sp.QJ97及用其生产琼胶酶的方法

摘要

本发明的目的是提供一种来源于海洋生物的微生物菌株Pseudoalteromonas.sp.QJ97，该菌株具有营养要求范围低，容易培养和培养时间短等特点。用本发明的菌株作为琼胶酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，适于工业化生产。通过酶的分离纯化，SDS-PAGE确定该菌株产生的褐藻胶裂解酶的分子量分别为35kDa。

说明书

技术领域

生物技术。

背景技术

琼胶是一种从江蓠、石花菜、紫菜等红藻类(Rhodophyceae)海藻细胞壁中提取出来的具有高凝胶强度的细胞间多糖，由琼脂糖和硫琼胶组成。琼脂糖是由α-D-半乳糖和3,6-内醚-α-L-半乳糖以α-1,3和β-1,4糖苷键交替连接形成的线性大分子；硫琼胶由半乳糖残基组成糖链，并交联了硫酸基、甲基、丙酮酸等取代基。琼胶酶可催化水解琼脂糖分子内的糖苷键，基于所催化糖苷键的类型差异,可以把琼胶酶分为2种：一种是α-琼胶酶(E.C.3.2.1.158)，作用于琼脂糖的α(1→3)糖苷键，产物为以3,6-内醚-α-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖(Agaro-oligosaccharide)系列，包括琼二糖、琼四糖等系列寡糖；另一种是β-琼胶酶(E.C.3.2.1.81)，作用于琼脂糖的β(1→4)糖苷键，产物为以D-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖(Neoagaro-oligosaccharide)系列，包括新琼二糖、新琼四糖等系列寡糖。研究表明，琼胶酶的作用机理大体可分为三种：第一种，由内切β琼胶酶裂解琼胶的β糖苷键，形成新琼四糖，进而被外切β琼胶酶降解为新琼二糖，最后新琼二糖酶将其分解为半乳糖和3,6?内醚α半乳糖。第二种，胞外的α琼胶酶作用于α-1,3?糖苷键，形成非还原性末端为D?半乳糖残基的琼二糖系列寡糖。第三种，琼胶酶的蛋白体结合两条寡糖链，一条寡糖链上的四个糖单体结合在蛋白体的活性部位；另一条寡糖链有八个糖单体与蛋白体相连处在与催化活性部位相对应平行的部位上。微生物来源的琼胶酶产生菌主要是海洋细菌，包括假单孢菌属(Pseudomonassp.)、交替单孢菌属(Alteromonassp.)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)、弧菌属(Vibriosp.)、噬琼胶菌属(Agarivoranssp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillussp.)、噬细胞菌属(Cytophagasp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、产微球茎菌属(Microbulbifersp.)、桃色杆菌属(Persicobactersp.)、盐杆菌属(Salegentibactersp.)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonassp.)等。Pseudomonas是重要的产生琼胶酶的菌属，产生的琼胶酶也有多种酶，酶的分子量是琼胶酶重要的性质表征，它代表了不同酶蛋白的分子大小，也是描述酶学性质的重要指标。王静雪报道Alteromonassp.琼胶酶分子量39.5kDa，刘美英报道Actinobacillusgenus琼胶酶分子量85kDa，唐中秀报道Paenibacillussp.琼胶酶分子量30kDa，马怡茗等研究Pseudoalteromonassp.琼胶酶分子量50.4kDa，李京宝报道Pseudoalteromonassp.琼胶酶分子量51kDa，吴倩倩报道Pseudoalteromonassp.琼胶酶分子量50.8kDa等等。本案发明人从采自海洋动物锈凹螺样品中筛选出一株高产琼胶酶菌株，依据形态学特征和16SrDNA序列分析，初步鉴定其属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，命名为Pseudoalteromonassp.QJ97。通过酶的分离纯化，SDS-PAGE确定了该菌株产生的琼胶酶的分子量为35kDa。经查阅资料、检索文献可知，该琼胶酶的分子量不同于以往的报道。

发明内容

本发明的分离纯化出一种来源于海洋生物的菌株Pseudoalteromonas.sp.QJ97，其具有产琼胶酶的特性，并对其产酶特性和分泌的酶蛋白进行分离纯化。保藏单位:中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：湖北、武汉、武汉大学，保藏号为CCTCCM2014567，保藏日期：2014年11月16日。本发明的目的是提供一种来源于海洋生物的微生物菌株Pseudoalteromonas.sp.QJ97，并利用该菌株制备琼胶酶。

本发明的特点如下：

将采集的海洋生物内脏以无菌操作方法取出放入无菌生理盐水中震荡、洗涤，将洗涤到的溶液通过涂布、初筛、复筛获得了琼胶酶高产菌株QJ97。该菌株的菌落呈规则的圆形，表面湿润，乳白色，边缘整齐，不易挑起。此菌株在2216E培养基上28℃培养24h形成单菌落，菌落周围形成较大的透明水解圈，菌落直径1.8~2.2mm，透明圈内圈直径7.0mm，外圈直径11.5mm。通过革兰氏染色初步断定其为革兰氏阴性菌。提取了菌株QJ97的基因组DNA，以细菌16SrRNA作为通用引物进行PCR扩增，16SrDNA的测序结果用NCBI数据库进行Blast比对，结果与Genebank中假交替单胞菌属的序列同源性最高，相似度达到99%。结合菌株QJ97的形态学特征，初步鉴定其属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，并命名为Pseudoalteromonassp.QJ97。在发酵培养基中培养24h，发酵液中生物量达到最大，进入稳定期，继续培养8h后，发酵液中生物量开始下降，琼胶酶的酶活力反而达到最高值625.93U/ml，在之后的84h内酶活力未见降低，说明该菌株发酵产生的琼胶酶稳定性好。作为琼胶酶的生产菌株，本发明的菌株产酶具有营养要求低、易培养和培养周期短的特点。用本发明的菌株作为琼胶酶生产菌，具有产品稳定性好、活性高、生产周期短、成本低的特点，适于工业化生产。本发明采用丙酮沉淀、Q-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析对菌株QJ97进行了分离纯化，经SDS-PAGE检验,最终收集到的活力组分呈现单一条带,该琼胶酶的相对分子质量为35kDa(图1)。其分子量不同于已报导的任何琼胶酶的分子量。

附图说明

图1Pseudoalteromonas.sp.QJ97产的琼胶酶SDS-PAGE电泳结果。左边为标准蛋白分子量，右边为菌株Pseudoalteromonassp.QJ97发酵并经纯化后的电泳纯度的琼胶酶蛋白条带，表示数量单位为：kDa。

具体实施方式

1．菌株的分离纯化：

本发明Pseudoalteromonassp.QJ97菌株的获得：将采集的海洋生物内脏以无菌操作方法取出放入装有25mL无菌生理盐水的100mL三角瓶中，摇匀，在无菌条件下，用接种环在2216E初筛培平板养基上划线进行纯化，28oC倒置培养48h。选择周围出现透明圈和凹陷的菌落，在初筛培养基平板上划线获得纯培养。将初筛得到的菌株接种至装有50mL复筛培养基(2216E基础添加CaCl₂0.1g,NaCl15g,NH₄Cl1g,琼脂2g,蒸馏水1000mL,pH7.2-7.6)的100mL三角瓶中，28℃，160rpm培养24h后，取发酵液测定琼胶酶活力。挑选出发酵液酶活力最高的菌株，即得到一株能产琼胶酶的细菌。

2．菌株的鉴定：

将分离得到是菌株经过16SrDNA基因序列测序结果：

CGAATGGCGCGGACTACCATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGCTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGATAGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTACCACGGATATTCCTTGG

依据形态学特征和16SrDNA序列分析，初步鉴定其属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，并命名为Pseudoalteromonassp.QJ97。

3.制备酶：将Pseudoalteromonassp.QJ97菌株用液体2216E培养基活化后，以5%的接种量接入到装有100mL发酵培养基(2216E为基础添加琼脂3.96g,乳糖4.0g,MgSO₄·7H₂O0.5g,NaCl11.27g,蒸馏水1000mL，pH7.2-7.6)的250mL三角瓶中，31℃摇瓶培养32h，将发酵液4℃下6000rpm冷冻离心7min。收集1000mL上清液，按照发酵液上清：丙酮=1：1.5(v/v)的比例向上清液中缓慢加入预冷丙酮(-20℃)，搅拌均匀，于4℃下静止2h，6000rpm冷冻离心7min，弃上清，沉淀部分加入100mL0.05mol/LTris-HCl（pH7.0）缓冲液，4℃磁力搅拌2h，使沉淀充分溶解，6000rpm冷冻离心7min，去除不溶的杂蛋白，上清部分即为浓缩粗酶液，用于进一步纯化。

4．纯化酶：将透过0.22μm微孔滤膜的浓缩粗酶液上样于Q-SepharoseFastFlow(Φ1.6cm×20cm)离子交换柱，洗脱液为含有NaCl（0-1mol/L）的0.05mol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液，进行梯度洗脱，流速为1mL/min,收集洗脱液，在280nm下检测蛋白峰，DNS法测定洗脱液的酶活力，将有活性的部分合并，进行下一步纯化。将Q-SepharoseF.F部分纯化后的活性蛋白浓缩后上样于SephadexG-75(Φ1cm×80cm)凝胶柱，洗脱液为的0.05mol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液，在280nm下检测蛋白峰，DNS法测定对应蛋白峰部分的洗脱液的酶活力，将有活性的部分合并。

5.酶分子量测定：用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）技术确定琼胶酶的分子量。具体方法是：将不同分子量标准蛋白质（proteinmarker）和加入SampleBuffer的琼胶酶样品在沸水浴中加热5min使其变性，取出10000rpm离心3min，冷却后上样，电泳后用考马斯亮蓝R250染色。电泳后，测定标准蛋白质和各样品的迁移距离，计算相对迁移率，以相对迁移率和各标准蛋白质分子量的对数以最小二乘法做标准曲线，计算此琼胶酶的分子量。此酶在SDS-PAGE上显示的分子量分别为：35kDa（图1）。