一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基及方法和应用

摘要

本发明涉及食用菌种培养技术领域，特别涉及一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基及方法和应用。所述培养基包括基础培养基：马铃薯150-220份，蔗糖15-25份，琼脂15-25份，水1000份；固体基质：150-200份。所述固体基质为谷类或豆类或杂粮或其组合；所述培养基为斜面培养基。采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养方法为：先制作基础培养基；再将固体基质在水中浸泡后，装入基础培养基中，消毒灭菌冷却后；接入蜜环菌孢子培养成菌种。本发明既适于蜜环菌基质，菌索、组织块分离，更适用于孢子的分离，一次性将孢子繁育成原种，从分离到纯化的时间为25-30天，中途不转管，且此菌种既可当试管母种，又可直接当原种用；缩短了蜜环菌种的分离时间和选育周期。

说明书

技术领域

本发明涉及食用菌种培养技术领域，特别涉及一种用于蜜环菌孢子分离、培养及 方法和应用。

背景技术

蜜环菌(Armillariellamellea)是真菌界、担子菌门、层菌纲、伞菌目、白磨科、 小蜜环菌属的一种食药用真菌。蜜环菌在自然界中与天麻、猪苓等生物相互作用和协同进 化有着密切的关系。在天麻、猪苓栽培中，蜜环菌种的活性或是优劣，直接影响或是决定着 它们的产量和质量。

蜜环菌种的获得或是分离技术方法，有从低级到高级，简单到复杂的五种技术和 方法。一是菌材分离，二是菌索分离，三是种麻分离，四是组织分离，五是孢子分离。目前我 国的研究所和菌种生产厂家主要是用菌索和种麻分离，少用组织分离，更少用孢子分离获 得菌种。用孢子分离的困难之一是，蜜环菌子实体在自然界中一年只出现一次（即重阳节前 后），且孢子弹射的时间很短（约30个小时左右），人为采取孢子的季节和时间受到限制。之 二是，人工用菌材培育蜜环菌子实体周期长（一至三年），且有技术难度和环境限制。之三 是，分离过程中易感杂，须要有一定的设备和相当的技术。

目前蜜环菌种分离和制种工艺是：从分离材料（基质、菌索、子实体）上获得菌种即 试管种（15d）－试管种(15d)－原种(45d)－栽培种（50d）。且一支试管种只能扩接原种6瓶 左右。

有人报道用蜜环菌索为材料的免消毒分离方法所用是PDA培养基（张方玉一种简 便的蜜环菌分离方法[J]微生物学通报199520（6）：382）；一种优化的蜜环菌分离与纯化 方法（王传华王义敏等一种优化的蜜环菌分离与纯化方法[J]武汉植物学研究2005，23 （5）：478～481），均在不同程度上有效提高了蜜环菌种的分离成功率，其不足点是，前者基 质易裂口，皱缩；后者基质胶质状程度不如琼脂。其它杂菌还能深入到此种培养基中生长， 因而降低了分离或纯化的成功率。根据蜜环菌生活史特性，孢子－菌丝－菌索－子实体。尤 其是菌丝（分解吃料）与菌索（穿越传输）有不同的功能和互相转换的特性，配制的培养基既 要满足孢子和菌丝及菌索的生长，还要能抵挡或阻隔其它真菌和细菌的生长。

发明内容

本发明在于提供一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基及方法和应用，能够分 离纯化、利于孢子萌发，进而生长为菌索和菌丝，即菌种。

本发明的具体方案如下：

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，所述培养基包括按重量份的以下组分：

马铃薯150-220份，蔗糖15-25份，琼脂15-25份，水1000份，固体基质150-220份；

所述固体基质为谷类或豆类或杂粮或其组合。

本发明优选方案，所述培养基包括按重量份的以下组分：

马铃薯180-210份，蔗糖18-22份，琼脂18-22份，水1000份，固体基质180-200份；

所述谷类为小麦或大麦或燕麦或黑麦或玉米或其组合；

所述豆类为蚕豆或绿豆或赤豆或黑豆或其组合；

所述杂粮为或薏米或高粱或黑米或高粱或荞麦或其组合。

所述培养基为斜面培养基。

采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养，所述方法包括以下步骤：

1）将固体基质在水中浸泡，得到物料1；

2）将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装 至三角瓶中，得到基础培养基；

3）将物料1加入所述步骤2）中的基础培养基中，封口、灭菌、冷却得到用于蜜环菌孢子 分离、培养的培养基；

4）从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述步骤3）的培养基上 进行培养，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。

所述步骤1）固体基质在水中浸泡浸泡时间为20-30h。

所述步骤4）蜜环菌孢子培养温度为20-22℃，培养时间为10-15天。

所述步骤4）接种的蜜环菌孢子收集方法为：

蜜环菌子实体菌衣开裂25-30h，菌盖边缘成铜罗边时，用消毒的剪刀在紧靠菌褶部位 剪去菌柄，将菌盖放在已消毒的滤纸上，菌盖上面盖上一张滤纸，再在上面盖一张干净薄 膜；

25-30h后，蜜环菌孢子大量弹射在滤纸上，得到接种孢子。

还包括对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌 种，在室内1月上旬培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻 产量。

所述的培养基在食用菌菌种分离、培养中的应用。

本发明提供一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基及方法和应用，有益效果如 下：

1、本配方培养基，科学地配制出适合蜜环菌菌丝和菌索，分离、培养生长，而不适合其 它杂菌生长的培养基配方，既能提供和满足蜜环菌种生长所需的营养物质，又能有效的阻 隔其它杂菌类的生长，即其它杂菌不能穿越琼脂生长，只能在琼脂的表层面上生长，但蜜环 菌索能穿入琼脂，并深入到被琼脂包裹的固体基质中生长，所以本发明培养基与常规培养 基比较，不仅能大大提高分离或纯化的成功率，还能最大程度地提高菌丝和菌索生长的数 量和质量；

2、本培养基配方既适于蜜环菌基质，菌索、组织块分离，更适用于孢子的分离。用无性 时期的料材（基质，菌索、组织块）获得的菌种在生产上易退化，用有性时期的材料（孢子）获 得的菌种能恢复和提高物种的活力和抗性，因此，用蜜环菌子实体产生的孢子分离获得的 菌种，是新一代的生命个体或群体，因而活力最强，用这种菌种生产蜜环菌原种和栽培种， 其活力和抗性（抗杂性、抗逆性）最强，因而能提高菌种的生产效益和经济效益；

3、采用本发明技术，不转管扩接成原种，一次性将孢子繁育成原种从分离到纯化的时 间为25-30天，中途不转管，一次性将分离的母种扩大50倍，且此种既可当试管母种，又可直 接当原种用；

4、采用本发明获得的菌种发菌材，由于具有新一代的生命力和生活力，其“吃料”能力， 即分解木材的活力旺盛，菌索很快就能缠绕到木材，并钻入到木材的韧皮部和木质部产生 菌丝体，菌丝体又形成菌索，木材上长满了菌丝体和菌索，为天麻生长准备好了丰富，纯洁 （无杂菌）的食粮即营养物质，因而能显著提高天麻产量和质量；

5、采用本发明缩短了蜜环菌种的分离培养时间，常规方法要125-130天，本专利方法只 需要70-80天；

6、采用本发明缩短了蜜环菌种选育的生产周期，常规方法要750天，时间历经周期三 年，本方法只需390天，时间历经周期二年；

7、本发明培养基中没有添加其他真菌和细菌抑制药物，组分简单且有利于蜜环菌种的 生长；

8、采用本发明培养的蜜环菌菌材，栽培天麻，天麻产量提高20%-30%。

附图说明

图1：基础培养基分离培养蜜环菌种状态示意图；

图2：蜜环菌盖示意图；

图3：蜜环菌盖弹射出的孢子示意图。

图4：本发明专利培养基（斜面）分离培养蜜环菌种状态示意图；

图5：本发明专利培养基（直立）培养蜜环菌种状态示意图；

图6：传统方法采用的培养基状态示意图。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施 例表述的范围。

根据蜜环菌生活史特性，孢子－菌丝－菌索－子实体。尤其是菌丝（分解吃料）与 菌索（穿越传输）有不同的功能和互相转换的特性，配制的培养基既要满足孢子和菌丝及菌 索的生长，还要能抵挡或阻隔其它真菌和细菌的生长。

实施例1基础培养基培养分离培养蜜环菌种

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，其特征在于：所述培养基包括按重量份的以 下组分：

马铃薯200份，蔗糖20份，琼脂18份，水1000份；

将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装至 三角瓶中，封口、灭菌、冷却得到基础培养基；

从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述基础培养基上进行培 养，培养温度为20℃，培养时间为10天，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。其培养的情况见图1。由图可知，菌索、菌丝少量生长在基础培 养基上。

所述蜜环菌孢子收集方法为：

蜜环菌子实体菌衣开裂25h，菌盖边缘成铜罗边时，紧靠菌褶部位剪去菌柄，将菌盖放 在已消毒的滤纸上，如图2，菌盖上面盖上一张滤纸，再在上面盖一张干净薄膜；

25h后，蜜环菌孢子大量弹射在滤纸上，如图3，得到接种孢子。

实施例2本发明专利培养基分离培养蜜环菌种

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，所述培养基包括按重量份的以下组分：

马铃薯200份，蔗糖20份，琼脂20份，固体基质180份，水1000份；所述固体基质为小麦。

采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养，所述方法包括以下步骤：

1）将固体基质在水中浸泡28h，得到物料1；

2）将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装 至三角瓶中，得到基础培养基；

3）将物料1加入所述步骤2）中的基础培养基中，封口、灭菌、冷却得到用于蜜环菌孢子 分离、培养的培养基，培养基分斜面、直立状进行摆放；

4）从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述步骤3）的培养基上 进行培养，培养温度为20℃，培养时间为10天，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。

培养后的菌种见图4、5，图4为本发明专利培养基斜面分离培养蜜环菌种状态示意 图；图5为本发明专利培养基直立培养蜜环菌种状态示意图；由图4、图5可知，采用斜面培 养，更有利于菌丝、菌索生长和深入至在整个培养基中。

实施例3

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，所述培养基包括按重量份的以下组分：马铃 薯150份，蔗糖15份，琼脂25份，固体基质200份，水1000份；

所述固体基质为大麦；

所述培养基为斜面培养基。

采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养，所述方法包括以下步骤：

1）将固体基质在水中浸泡25h，得到物料1；

2）将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装 至三角瓶中，得到基础培养基；

3）将物料1加入所述步骤2）中的基础培养基中，封口、灭菌、冷却得到用于蜜环菌孢子 分离、培养的培养基，培养基分斜面、直立状进行摆放；

4）从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述步骤3）的培养基上 进行培养，培养温度为20℃，培养时间为10天，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。

所述蜜环菌孢子收集方法为：

蜜环菌子实体菌衣开裂30h，菌盖边缘成铜罗边时，用消毒的剪刀在紧靠菌褶部位剪去 菌柄，将菌盖放在已消毒的滤纸上，菌盖上面盖上一张滤纸，再在上面盖一张干净薄膜；

30h后，蜜环菌孢子大量弹射在滤纸上，得到接种孢子。

对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌种，在 室内1月上旬培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻产量， 天麻产量提高25%。

实施例4

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，所述培养基包括按重量份的以下组分：

马铃薯200份，蔗糖20份，琼脂20份，固体基质180份，水1000份；所述固体基质为小麦。

采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养，所述方法包括以下步骤：

1）将固体基质在水中浸泡30h，得到物料1；

2）将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装 至三角瓶中，得到基础培养基；

3）将物料1加入所述步骤2）中的基础培养基中，封口、灭菌、冷却得到用于蜜环菌孢子 分离、培养的培养基，培养基分斜面、直立状进行摆放；

4）从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述步骤3）的培养基上 进行培养，培养温度为21℃，培养时间为11天，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。

所述蜜环菌孢子收集方法为：

蜜环菌子实体菌衣开裂28h，菌盖边缘成铜罗边时，用消毒的剪刀在紧靠菌褶部位剪 去菌柄，将菌盖放在已消毒的滤纸上，菌盖上面盖上一张滤纸，再在上面盖一张干净薄膜；

27h后，蜜环菌孢子大量弹射在滤纸上，得到接种孢子。

对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌种，在 室内1月上旬培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻产量， 天麻产量提高25%。

实施例5

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，所述培养基包括按重量份的以下组分：马铃 薯190份，蔗糖19份，琼脂22份，固体基质190份，水1000份；

所述固体基质为小麦140份，薏米50份；

所述培养基为斜面培养基。

采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养，所述方法包括以下步骤：

1）将固体基质在水中浸泡29h，得到物料1；

2）将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装 至三角瓶中，得到基础培养基；

3）将物料1加入所述步骤2）中的基础培养基中，封口、灭菌、冷却得到用于蜜环菌孢子 分离、培养的培养基，培养基分斜面、直立状进行摆放；

4）从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述步骤3）的培养基上 进行培养，培养温度为20℃，培养时间为10天，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。

所述蜜环菌孢子收集方法为：

蜜环菌子实体菌衣开裂29h，菌盖边缘成铜罗边时，用消毒的剪刀在紧靠菌褶部位剪去 菌柄，将菌盖放在已消毒的滤纸上，菌盖上面盖上一张滤纸，再在上面盖一张干净薄膜；

28h后，蜜环菌孢子大量弹射在滤纸上，得到接种孢子。

对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌种，在 室内1月上旬培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻产量。

对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌种，在 室内1月上旬培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻产量， 天麻产量提高28%。

实施例6

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，所述培养基包括按重量份的以下组分：

马铃薯210份，蔗糖22份，琼脂23份，固体基质180份，水1000份；

所述固体基质为大麦60份，燕麦20份，黑麦50份，赤豆20份，高粱30份；

所述培养基为斜面培养基。

采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养，所述方法包括以下步骤：

1）将固体基质在水中浸泡25h，得到物料1；

2）将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装 至三角瓶中，得到基础培养基；

3）将物料1加入所述步骤2）中的基础培养基中，封口、灭菌、冷却得到用于蜜环菌孢子 分离、培养的培养基，培养基分斜面、直立状进行摆放；

4）从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述步骤3）的培养基上 进行培养，培养温度为20℃，培养时间为11天，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。

所述蜜环菌孢子收集方法为：

蜜环菌子实体菌衣开裂28h，菌盖边缘成铜罗边时，用消毒的剪刀在紧靠菌褶部位剪去 菌柄，将菌盖放在已消毒的滤纸上，菌盖上面盖上一张滤纸，再在上面盖一张干净薄膜；

28h后，蜜环菌孢子大量弹射在滤纸上，得到接种孢子。

还包括对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌 种，在室内1月上旬培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻 产量，天麻产量提高30%。

实施例7

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，所述培养基包括按重量份的以下组分：

马铃薯200份，蔗糖20份，琼脂20份，固体基质190份，水1000份；

所述固体基质为大麦30份，燕麦20份，玉米30份，蚕豆20份，黑豆30份，黑米30份，荞麦 30份；

所述培养基为斜面培养基。

采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养，所述方法包括以下步骤：

1）将固体基质在水中浸泡27h，得到物料1；

2）将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装 至三角瓶中，得到基础培养基；

3）将物料1加入所述步骤2）中的基础培养基中，封口、灭菌、冷却得到用于蜜环菌孢子 分离、培养的培养基，培养基分斜面、直立状进行摆放；

4）从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述步骤3）的培养基上 进行培养，培养温度为20℃，培养时间为10天，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。

所述蜜环菌孢子收集方法为：

蜜环菌子实体菌衣开裂25h，菌盖边缘成铜罗边时，用消毒的剪刀在紧靠菌褶部位剪去 菌柄，将菌盖放在已消毒的滤纸上，菌盖上面盖上一张滤纸，再在上面盖一张干净薄膜；

25h后，蜜环菌孢子大量弹射在滤纸上，得到接种孢子。

还包括对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌 种，在室内2月底培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻产 量。

对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌种，在 室内1月上旬培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻产量， 天麻产量提高30%。

实施例8

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，所述培养基包括按重量份的以下组分：

马铃薯220份，蔗糖25份，琼脂25份，固体基质200份，水1000份；

所述固体基质为蚕豆50份，高粱50份，黑米50份，荞麦50份；

所述培养基为斜面培养基。

采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养，所述方法包括以下步骤：

1）将固体基质在水中浸泡20-30h，得到物料1；

2）将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装 至三角瓶中，得到基础培养基；

3）将物料1加入所述步骤2）中的基础培养基中，封口、灭菌、冷却得到用于蜜环菌孢子 分离、培养的培养基，培养基分斜面、直立状进行摆放；

4）从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述步骤3）的培养基上 进行培养，培养温度为22℃，培养时间为12天，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。

所述蜜环菌孢子收集方法为：

蜜环菌子实体菌衣开裂28h，菌盖边缘成铜罗边时，用消毒的剪刀在紧靠菌褶部位剪去 菌柄，将菌盖放在已消毒的滤纸上，菌盖上面盖上一张滤纸，再在上面盖一张干净薄膜；

28h后，蜜环菌孢子大量弹射在滤纸上，得到接种孢子。

对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌种，在 室内1月上旬培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻产量， 天麻产量提高30%。

实施例9

一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基，所述培养基包括按重量份的以下组分：

马铃薯180份，蔗糖19份，琼脂22份，固体基质180份，水1000份；

所述固体基质为薏米60份，高粱60份，黑米60份；

所述培养基为斜面培养基。

采用所述的培养基进行蜜环菌孢子的分离、培养，所述方法包括以下步骤：

1）将固体基质在水中浸泡25h，得到物料1；

2）将培养基组分马铃薯切片沸水煮15分钟过滤，过滤液、蔗糖、琼脂溶解于水中，分装 至三角瓶中，得到基础培养基；

3）将物料1加入所述步骤2）中的基础培养基中，封口、灭菌、冷却得到用于蜜环菌孢子 分离、培养的培养基，培养基分斜面、直立状进行摆放；

4）从蜜环菌子实体上收集蜜环菌孢子，挑取蜜环菌孢子接种在所述步骤3）的培养基上 进行培养，培养温度为22℃，培养时间为12天，并剔除感染杂菌的接种瓶；

完成孢子的分离、培养。

所述蜜环菌孢子收集方法为：

蜜环菌子实体菌衣开裂29h，菌盖边缘成铜罗边时，用消毒的剪刀在紧靠菌褶部位剪去 菌柄，将菌盖放在已消毒的滤纸上，菌盖上面盖上一张滤纸，再在上面盖一张干净薄膜；

29h后，蜜环菌孢子大量弹射在滤纸上，得到接种孢子。

对所得到的接种孢子优良性的检测方法，所述检测方法为将得到的蜜环菌种，在 室内1月上旬培养好菌材，在3月上旬室外栽培天麻，当年10月挖取天麻，并测定天麻产量， 天麻产量提高30%。

上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申 请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范 围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方 案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。