自噬相关蛋白12在防治肠道病毒71型感染中的应用

摘要

本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。本发明以人脑微血管内皮细胞(HBMEC)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的宿主因子，从而保护血脑屏障的功能，预防病毒穿过血脑屏障感染中枢神经系统。本发明通过实验发现自噬相关蛋白12(autophagy？related？protein？12,ATG12)在EV71感染HBMEC中发挥着重要的作用，下调ATG12的表达，能明显抑制EV71的感染。本发明提供了ATG12在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠道 A类病毒，是导致手足口病(Hand-foot-mouthdisease,HFMD)的主要病原体之一。目前，手 足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市暴发手足 口病疫情以来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100万例，死 亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁以下婴幼儿，临床表现为发热，手、足、臀部以 及口腔粘膜等部位出现疱疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神经系统 (centralnervoussystem，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎以及神经源 性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[SolomonT1,LewthwaiteP,PereraD, CardosaMJ,McMinnP,OoiMH.Virology,epidemiology,pathogenesis,andcontrolof enterovirus71.LancetInfectDis.2010Nov；10(11):778-90.]。手足口病特别是重症病 例多由肠道病毒71型(EV71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特异 高效的抗病毒药物，临床上仍以对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。

EV71感染具有嗜神经性，易造成严重的CNS疾病及其并发症，这也是导致手足口病 患者发展为重症甚至死亡的主要原因。其中，脑干是最易被EV71感染的部位[Tee,K.K.,et al.Evolutionarygeneticsofhumanenterovirus71:origin,populationdynamics, naturalselection,andseasonalperiodicityoftheVP1gene.JVirol,2010.84(7): p.3339-50.]，研究证实在EV71重症患者的脑干神经元等部位均能够检测到EV71基因及抗 原的存在，证明EV71能进入CNS。EV71经血液循环感染CNS需要穿越血脑屏障，然而病毒如何 穿过血脑屏障侵入CNS的机制还不清楚。血脑屏障(BloodBrainBarrier，BBB)是位于循环 系统和中枢神经系统之间一道主要的屏障，它限制着不同物质在两个部位之间的自由运 输，对维持CNS的体内平衡以及保护CNS免受外界病原微生物的侵袭中起着至关重要的作用 [DyrnaF,HanskeS,KruegerM,BechmannI.Theblood-brainbarrier.JNeuroimmune Pharmacol.2013；8(4):763-73.]。血脑屏障是由无窗孔的脑微血管内皮细胞及其间的紧密 连接、星形胶质细胞足突、细胞基膜和周细胞共同组成的一个细胞复合体。在这个细胞复合 体中，最主要的物质结构基础是脑微血管内皮细胞(BrainMicrovascularEndothelial Cells，BMECs)及其紧密连接，其严整性的丢失被认为是病毒感染致脑组织损伤的一个重要 原因。因此，探明EV71感染BMECs的机制并以此寻找新的抗病毒靶点，对于保护血脑屏障的 功能，以及防治EV71所导致的中枢神经系统感染至关重要。

为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系统完成对 宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此，作为病 毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要靶标。研究表明，EV71 可利用不同的宿主因子和感染途径来入侵不同种类的靶细胞，比如EV71借助网格蛋白依赖 的内吞途径(clathrin-mediatedendocytosis)感染人横纹肌肉瘤细胞 (rhabdomyosarcoma,RD)[YamayoshiS,etal.ScavengerreceptorB2isacellular receptorforenterovirus71.NatMed,2009.15(7):p.798-801.]；而感染JurkatT淋巴 细胞系则主要利用小窝依赖的内吞途径(caveolar-dependentendocytosis)[LinHY, YangYT,YuSL,etal.CaveolarendocytosisisrequiredforhumanPSGL-1- mediatedenterovirus71infection.JVirol.2013,87(16):9064-76.]。目前，关于EV71 感染BMECs的途径及机制仍不清楚。

病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，这些宿主细 胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，内体、自噬体等囊泡的形成以及成熟中发挥着重要 的作用。如网格蛋白(clathrin)主要负责受体介导的的内吞过程；小窝蛋白家族分子 caveolin-1(CAV1)将物质运输至高尔基体；P62分子将多泛素化蛋白聚集体定位于自噬体； 小G蛋白家族分子RAB7介导自噬体与溶酶体的融合过程；Flotillin分子能够与脂筏内蛋白 分子相互作用并内吞入细胞内；(JasonMercer,MarioSchelhaas,etal.VirusEntryby Endocytosis.AnnuRevBiochem.2010；79:803-833.)。在这些分子中，caveolin-1和 clathrin被证实分别参与了EV71感染JurkatT淋巴细胞和RD细胞的过程，而其它分子在 EV71感染中的作用还未有报道。

细胞自噬是继细胞凋亡之后，近十年在生命科学与医学领域的研究热点。细胞自 噬在真核细胞中作为一种保守的功能，通过特征性的双层膜囊泡隔离并降解废旧蛋白或衰 老细胞器，维持胞内代谢的平衡和稳定，与细胞的存活、增殖能力密切相关，并且在对抗肿 瘤、神经退行性病变等病程进展中担当重要角色。近年来，细胞自噬被发现在固有免疫与适 应性免疫中同样发挥重要作用。一个完整的自噬过程由自噬体形成与自噬体降解两个环节 组成，前者主要包括自噬起始、自噬体延伸闭合及自噬体成熟等步骤，后者主要负责自噬溶 酶体形成及内容物降解任务。现已证实埃可病毒7型(echovirus7)入侵Caco-2细胞依赖于 自噬机器的核心组分(ChonsaengK,JeffreyMB.Echovirus7EntryintoPolarized Caco-2IntestinalEpithelialCellsInvolvesCoreComponentsoftheAutophagy Machinery.JVI.2014；88(1):434-443.)，而口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus, FMDV)入侵CHO细胞则通过P62介导的自噬途径(StephenB,ElizabethB,etal.Foot-and- MouthDiseaseVirusInducesAutophagosomesduringCellEntryviaaClassIII Phosphatidylinositol3-Kinase-IndependentPathway.JVI.2012；86(23):12940- 12953.)。然而，自噬机制是否参与EV71的入侵阶段仍未见报道。

自噬最初发现于酵母，目前有30多个自噬相关基因(atg，autophagy-related genes)已被鉴定，其编码产物参与自噬的形成。人类自噬相关基因Atg12位于染色体5q21- q22上，编码的cDNA长为4330bp，开放阅读编码框表达一个包含140个氨基酸残基的蛋白质。 其表达产物ATG12的C-端为泛素样结合区域，与ATG16等自噬相关蛋白形成一个定位于自噬 体外膜的十二元复合物，驱动自噬体膜的延伸与弯曲，并且可能参与自噬体标记蛋白LC3与 磷脂酰乙醇胺的酯化反应。自噬体膜一旦闭合，ATG12将脱离自噬体进入自噬机器组装的再 循环。因此，ATG12是自噬体构建的关键性角色。然而在EV71感染的过程中，Atg12及其表达 产物ATG12发挥的作用还未有报道。

目前还没有任何关于ATG12分子在EV71感染HBMEC中作用的报道，对于该分子进行 深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的认识，也可以为预防与治疗EV71感染提供 新的思路与靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。

本发明的另一目的在于提供自噬相关蛋白12(ATG12)分子的新用途，特别是在抗 肠道病毒71型感染中的应用。

本发明的第三目的在于提供干扰ATG12分子表达的siRNA。

本发明的主要技术方案是：

本发明，以人脑微血管内皮细胞(HBMEC)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细 胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的宿主因子， 从而保护血脑屏障的功能。本实验选择了一组宿主细胞跨膜转运与膜泡组装相关分子来进 行筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成与成熟中发挥着重要作用，它们 往往也是在病毒感染过程中易被病毒“劫持”并利用的分子。这些分子包括：自噬相关蛋白 12(ATG12)、caveolin-1(CAV1)、P62、RAB7、网格蛋白重链(CLTC)、Flotillin蛋白1(FLOT1)、 突触结合蛋白1(SYT1)。通过检索NCBIGeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络 资源及常用软件对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列，然后设 计siRNA，通过下调这些分子，来观察对EV71感染的影响。

我们发现自噬相关蛋白12(autophagyrelated12,ATG12)在EV71感染HBMEC中发 挥着重要的作用，下调ATG12的表达，能明显抑制EV71的感染。

本发明的第一方面，提供了自噬相关蛋白12(ATG12)作为一种抗肠道病毒71型感 染的新靶点。

所述的自噬相关蛋白12(ATG12)，GENBANKID：NM_004707。

本发明的第二方面，提供了自噬相关蛋白12(ATG12)在制备预防或治疗肠道病毒 71型感染药物中的应用。

进一步地，本发明还提供自噬相关蛋白12(ATG12)在制备预防或治疗手足口病药 物中的应用。

本发明所述的自噬相关蛋白12(ATG12)在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物 中的应用，该药物具体是指能够抑制或下调ATG12的表达量的试剂。

所述的抑制下调ATG12的表达量的试剂可以是siRNA、shRNA、包含siRNA、shRNA的 重组载体(如质粒)等。

本发明的第三方面，本发明提供了自噬相关蛋白12(ATG12)的干扰RNA在制备预防 或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用，或自噬相关蛋白12在制备预防或治疗手足口病药 物中的应用，所述的药物为干扰RNA(siRNA)，其序列如下：

GCAGCUUCCUACUUCAAUUUU(SEQIDNO:1)

GCGAACACGAACCAUCCAAUU(SEQIDNO:2)

GCAGUGAUGGUAAACUGGUUU(SEQIDNO:3)

其中，以如SEQIDNO:1所示的siRNA下调ATG12的表达量效果最佳，且降低EV71对 HBMEC细胞的感染最为明显。

本发明筛选到能够抑制EV71感染HBMEC细胞的一个新的宿主细胞分子ATG12。 ATG12基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了EV71对HBMEC细胞的感染。

因此本发明为临床预防和治疗因EV71感染所导致的血脑屏障的失能提供了新的 靶点和治疗方案。

附图说明

图1为转染有效siRNA后的干扰效率及细胞毒性检测，图中主坐标轴表示干扰效 率，次坐标轴表示对细胞毒性的影响；

CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；

NT：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组(实验组)。

图2为免疫荧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，其中A为下调各分子 后对病毒感染性的荧光检测图，B为下调各分子后对病毒感染的抑制率图；

CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；

NT：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组(实验组)。

图3为ATG12下调后对EV71感染的影响，其中A为WesternBlot检测ATG12蛋白的表 达图，B为观察EV71的细胞病变效应图，C为检测EV71病毒量图；

CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；

ATG12：转染针对ATG12基因的siRNA(SEQIDNO:1)的HBMEC细胞组。

图4为转染ATG12分子的不同干扰序列后的干扰效率及对EV71感染性的影响图，A 为ATG12基因的mRNA水平检测图，B为EV71病毒量检测图；

CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；

ATG12-1：转染针对ATG12基因的siRNA(SEQIDNO:1)的HBMEC细胞组；

ATG12-2：转染针对ATG12基因的siRNA(SEQIDNO:2)的HBMEC细胞组；

ATG12-3：转染针对ATG12基因的siRNA(SEQIDNO:3)的HBMEC细胞组。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：

1设计、合成各宿主细胞分子的特异性siRNA序列。

1.1针对各个目的基因，检索NCBIGeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的 网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。 参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确 保无同源性；排除aitisense链的5’端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何 一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定，选择3 个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见表1。

1.2单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。

表1.siRNA靶点的设计

2siRNA序列筛选与干扰效果鉴定

2.1RNA转染

转染步骤参照Lipofectamine2000说明书

1)提前12-16小时将HBMEC细胞(购自Sciencell，保藏号：1000)铺在24孔细胞培养 板上培养，使得转染时细胞密度为80％-90％。

2)取2μLLipofectamine2000加入50μLopti-MEM中并轻柔混匀，室温孵育5分 钟；另取5μL浓度为5μM的干扰RNA和50μLopti-MEM混合。孵育结束后，将稀释的 Lipofectamine2000转染试剂加入稀释的RNA中，并轻柔吹吸混匀。室温孵育20min后，加入 HBMEC细胞中，补加400μLopti-MEM，使得RNA终浓度为50nM。

3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。

2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平

1)TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，具体步骤如下：

转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1mlTRIzol，充分混合室温裂解细胞3- 5分钟。加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15秒。于4℃、12,000转离心15分钟。取上层水相 并转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充分混合，室温沉淀10分钟。于4℃、12,000转离 心10分钟。弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇。于4℃、12,000离心5分钟。充分弃上清，室温晾 干RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀，得到总RNA。

2)利用takara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA，具体步骤如下：

在PCR管中加入如下反应体系，

轻柔混合混匀，置于37℃反应15分钟，然后置于85℃加热5秒钟灭活逆转录酶。

3)荧光定量RT-PCR检测

利用takara的SYBRPremixExTaq试剂盒进行反应，反应体系如下，

利用RotorGene3000A仪器进行两步法扩增，95℃预变性2min，进行40个PCR循 环，95℃5秒，60℃30秒。

3细胞毒性实验

采用CCK-8方法检测转染siRNA后对细胞增殖的影响，具体步骤如下：

收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。待细胞过夜贴壁后，转 染各siRNA，培养48小时后检测细胞增殖情况。弃去原有培养基，每孔加入含10μLCCK-8的 新鲜培养基110μL，培养3h后用多功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。实验独立重 复3次，计算平均值。

4EV71病毒感染HBMEC细胞

4.1HBMEC细胞的EV71病毒感染实验

HBMEC细胞转染RNA后72小时，进行EV71病毒感染实验。将培养上清吸出，用预温 PBS润洗2次，以MOI＝0.1的病毒量接种EV71，37℃孵育2h后弃去病毒液，并用预温PBS润洗3 次，加入新鲜培养基继续培养。

4.2免疫荧光染色检测EV71抗原表达

HBMEC细胞感染病毒后继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，具体 步骤如下：

1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入100μl预 冷甲醇，于-20℃条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。

2)透膜：固定后的细胞每孔加入100μl0.1％TritonX-100，室温孵育15min，用预 冷PBS洗涤3次。

3)封闭：每孔加入100μl3％BSA，于室温下孵育1h。

4)一抗孵育：每孔加入EV71特异性鼠源单抗10F0(1:2000稀释)100μl，室温孵育 1h，用预冷的PBS洗涤3次。

5)二抗孵育：每孔加入AF488荧光标记抗鼠IgG(1:1000稀释)100μl，室温避光孵 育1h，用预冷的PBS避光洗涤2次。

6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000，PBS稀释)，室温避光孵育 15min，用预冷的PBS避光洗涤3次。

7)荧光显微镜下检测并计算绿色AF488阳性细胞克隆数。

4.3蛋白免疫印迹。

(1)用蛋白裂解液分别提取对照组与ATG12干扰组HBMEC细胞的总蛋白。

(2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并 截取相应条带用电转仪转到PVDF膜上。

(3)蛋白的非特异性位点用5％的脱脂牛奶封闭，然后用ATG12抗体封闭，4℃过夜， 用TBST缓冲液洗三遍，洗去一抗。

(4)然后用HRP标记的二抗室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。

(5)最后，利用显色液显色并拍照分析.

4.4RT-PCR检测细胞中EV71病毒量

HBMEC细胞感染病毒后继续培养48h，采用TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总 RNA，并逆转录获得cDNA，通过RT-PCR检测EV71病毒量。具体步骤同2.2所示。

实验结果：

1设计、合成并筛选有效的siRNA

针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰靶点序列，并利用设计软件进行 预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰 序列，如表1所示。

采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到HBMEC细胞中去，48h后通过 RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，最终筛选到干扰效果最佳的siRNA序列(表2中加粗序 列)进行后续实验，其干扰效率如表2所示。

表2RT-PCR法检测siRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率

注：CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)

NT：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组(实验组)。

2siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测

挑选出的针对各宿主分子的有效siRNA转染HBMEC细胞，转染后48h通过RT-PCR法 检测各干扰RNA的干扰效率，同时采用CCK8检测转染后对HBMEC细胞毒性的影响。

结果如图1所示，转染有效siRNA组与CTRL组相比，转染各siRNA后能够明显抑制相 应基因的表达水平(P＜0.01)。转染ATG12siRNA(SEQIDNO:1)的抑制效率可达到80％。

细胞毒性实验表明，各siRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P＞0.05)，对细 胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。

3siRNA干扰后对EV71病毒感染的影响

转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染相同剂量 的EV71病毒，感染48h后，采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，发现 与对照组相比，转染ATG12siRNA(SEQIDNO:1)使ATG12基因下调后，明显降低了EV71对 HBMEC细胞的感染(图2A)。通过计算病毒量发现，ATG12基因下调后对病毒的抑制率达到 84.33％，而其余分子的下调并没有明显抑制EV71对HBMEC细胞的感染(P＞0.05)(图2B)。

为明确ATG12对EV71感染的抑制作用，在转染ATG12分子siRNA后，通过免疫印迹法 检测ATG12蛋白分子的表达，并在感染EV71后观察细胞病变情况，以及通过RT-PCR检测EV71 病毒量。结果显示，转染ATG12分子siRNA(SEQIDNO:1)后，能够明显抑制ATG12蛋白分子的 表达(图3A)。与对照组相比，ATG12蛋白表达下调后，能够抑制细胞病变且HBMEC细胞中的病 毒量也显著下降(图3B,C)，与免疫荧光法检测结果相一致。这些结果表明，与对照细胞相 比，下调ATG12基因后EV71对HBMEC细胞的感染能力明显下降，病毒量减少。

进一步，分别转染三条ATG12分子的siRNA观察对病毒感染性的影响。结果表明不 同的siRNA对ATG12分子的下调效率不同(图4A)，其中siRNA(SEQIDNO:1)的干扰效率最 高，与前面的结果相一致。检测干扰后对EV71感染性的影响发现，三条ATG12分子的siRNA对 病毒感染的抑制率均可达到66％以上，而且随着对ATG12分子的下调效率的增高，对EV71感 染的抑制率也在升高(图4B)，提示ATG12分子在EV71感染HBMEC中发挥着重要作用。因此， ATG12可作为抑制EV71对HBMEC细胞感染的新的宿主靶点。

通过以上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制EV71感染HBMEC细胞的一个新的 宿主细胞分子ATG12。ATG12基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了EV71 对HBMEC细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗因EV71感染所导致的血脑屏障的失能 提供了新的靶点和治疗方案。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。