靶向癌症、尤其是前列腺癌的合成性抗体模拟化合物(SyAMs)

摘要

本发明涉及作为抗体模拟化合物起作用的化合物。这些化合物为双官能/多官能化合物，其包含至少一个选择性结合至前列腺特异性膜抗原(PSMA)的癌细胞结合部分和调节FC免疫受体(优选FcγRI受体)的FC受体结合部分。根据本发明的化合物选择性结合至癌细胞，其上调PSMA，且通过该相互作用将该化合物的Fc受体结合部分置于接近Fc受体(优选FcγRI受体)的位置，其可调节(优选地，上调)患者中对癌细胞的体液应答。通过根据本发明的化合物的这一生物作用，癌细胞(包括转移性癌细胞、尤其是前列腺癌细胞)可被免疫调节，导致在患者中有利地治疗癌症。使用这些化合物治疗癌症和/或减少癌症转移的可能性的方法是本发明的其它方面。

说明书

技术领域

本发明涉及化合物，其作为合成性抗体模拟化合物(syntheticantibodymimeticcompounds)起作用。根据本发明的化合物为双官能/多官能化合物，其包含至少一个选择性结合至前列腺特异性膜抗原(PSMA)的癌细胞结合部分和调节FC免疫受体，优选FcγRI受体的FC受体结合部分。根据本发明的化合物选择性结合至上调PSMA的癌细胞，且通过该相互作用将该化合物的Fc受体结合部分置于接近Fc受体、优选FcγRI受体的位置，其可调节(优选地，上调)患者中对癌细胞的体液应答。通过根据本发明的化合物的该生物作用，癌细胞，包括转移性癌细胞、尤其是前列腺癌细胞可被免疫调节，导致在患者中有利地治疗癌症。使用这些化合物治疗癌症和/或减少癌症转移的可能性的方法是本发明的其它方面。

经费支持

本发明由国立卫生研究院支持，经费号为1DP2OD002913-01。因此，政府保留本发明的某些权利。

背景技术

增长的数据资源表明靶向治疗可调动患者自身的免疫系统以破坏恶性肿瘤，同时比常规化学治疗具有较少的副作用。因为估计2011年出生的41％的美国人–几乎二分之一的人–在他们的生命中会患癌症，形成更有效的癌症免疫治疗是高度优先的。这些治疗包括将先天免疫细胞导向至肿瘤相关抗原(TAA)的单克隆抗体(mAbs)，以及癌症“疫苗”，所述疫苗具有许多形式(包括具有佐剂的肿瘤蛋白质的注射剂或体外预处理的(primed)树突细胞)且被设计为意在诱导长效抗肿瘤T-细胞。

本发明者的研究目的是开发能刺激对肿瘤的免疫应答的新的化合物。单克隆抗体(mAbs)的引入已革新了免疫治疗领域、尤其是癌症治疗。尽管mAbs已变成癌症治疗的支柱，但它们具有严重缺点¹。mAbs受它们危险的免疫学副反应、缺少口服生物利用度和高成本的生产和给药而限制。开发模拟抗体功能的合成性分子可提供上述问题的有效解决方案。

目前的研究是探索开发利用免疫系统的自然响应的新的治疗。优化未缀合的单克隆抗体的Fc区以增加其功效和响应，已获得极大关注²³。一种最近开发的单克隆抗体衍生物，双特异抗体，连接两种具有不同靶特异性的Fabs。一个Fab区结合至感兴趣的靶蛋白而另一个结合至选择的免疫受体^4,5，包括FcγRI⁶，例如，靶向HER2和FcγRI的双特异抗体⁶。在一个替代方法中，本发明者以及其他人员，已经使用了合理的设计以构建合成的系统，其能够实施或模拟复杂的免疫学功能⁷。

因此，已出现多种可调节免疫系统的抗体-募集分子(ARMs)⁸。ARMs为双官能合成性分子，其包含结合至具有高亲和力和特异性的病原体表面蛋白的靶结合端(TBT)，和募集内源性抗体的抗体结合端(ABT)。我们已显示这些分子能诱发选择性针对癌症和病毒感染的细胞二者的靶向的免疫应答。该课题最近已有综述⁴。

尽管开发了ARMs，用完全合成的分子操纵免疫系统目前仍处于初期⁹。在本发明，相对小分子量的抗体模拟物可实施靶向和免疫效应物功能，该方法对于治疗癌症具有极大的希望，尤其是前列腺癌。为开发这种完全合成的抗体模拟物，我们选择前列腺癌作为我们的病原体靶标，但该方法可在表达PSMA的任何地方使用，包括几乎所有癌症，但尤其是前列腺癌和转移性前列腺癌。

选择前列腺癌作为靶标以用于本发明的开发反映了其在引起疾病和死亡方面的严重性。在美国男性中前列腺癌为引起癌症相关的死亡的第二主要原因，且目前的治疗策略经常导致复发和不希望的副作用¹⁰。已预测每6个美国人中有一个在其生命周期中将患有前列腺癌。目前，没有临床批准的基于单克隆抗体的靶向前列腺癌的药物。显然，治疗前列腺癌的免疫学方法代表具有极大潜力的方法，然而，目前免疫学方法的不利属性必须得到改善，以使得该一般方法成功。本发明代表一种解决这些问题的替代方法。

本发明

本申请提供的目前的工作已创造性地开发了抗体的完全合成的功能模拟物，其可克服限制单克隆抗体治疗潜能的一些缺点。这种新的方法利用下一代生物制剂(next-generationbiologics)的优点来补充传统小分子的优点以解决目前的限制。在此，我们报告了一种合理设计的合成性分子，称为“靶向前列腺癌的合成性抗体模拟物”(SyAM-P)，其能够将FcγRI的免疫学功能重新定向于显示前列腺特异性膜抗原(PSMA)的靶点，从而靶向和根除上调PSMA的癌细胞，包括前列腺癌细胞，包括转移性前列腺癌细胞。本发明者在此提供了显示抗体的性质和功能的合成性分子的首个实施例，该抗体需要免疫应答针对病原体靶点的选择性靶向，所述病原体靶点在该情况下为癌细胞，包括转移性癌细胞、尤其是前列腺癌细胞和转移性前列腺癌细胞。

本发明涉及称为SyAM-Ps的化合物。SyAM-Ps为多官能小分子，其被设计以刺激先天的和适应型抗肿瘤免疫应答、尤其是通过FcγRI调节的免疫应答。本发明者之前已开发了双官能抗体募集分子(ARMs)，其能够将内源性抗体重新定向至前表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)的前列腺癌细胞。本发明通过将FcγRI调节剂(有效的体液应答调节剂)连接至ARM骨架增强了ARM的免疫刺激性质。母体化合物的结合部分靶向显示PSMA上调的癌细胞，特别是前列腺癌细胞，而另外FcγRI基序活化局部体液应答以诱导对肿瘤的免疫记忆。该结果为一种提供协同抗癌活性的效果，其显著大于没有像本发明那样连接在一起的单独的功能性分子的抗癌活性。

附图简述

图1显示A)所提出的合成性抗体模拟物的作用机理的描述；B)显示结合至Fc受体的抗PSMA的单克隆抗体之间的相互作用期间膜距离和长度需求的模型；和C)显示SyAM-P设计从单克隆抗体模板演化的示意图。

图2示例根据本发明的化合物和相关的部分。CP33为FcγRI靶向基序1，SyAM-P1，第一代，显示了单一FcγRI和与氨基己酸单元连接的PSMA结合基序。2，SyAm-P2，第二代，显示了与单一CP33基序连接的一对PSMA靶向基序。3，SyAM-P3，第三代，显示了与单一CP33基序连接的一对PSMA靶向基序。生物素部分作为把手(handle)存在，使得该化合物易于在实验中分离或鉴定，其在本文另外公开。实践中，根据本发明的治疗化合物不包含生物素分子，且该化合物在与生物素部分键合的氨基处包含氢、烷基或酰基，如图中所述。3，SyAm-P3，第三代，显示了与一对CP33靶向部分/分子连接的一对PSMA靶向基序。

图3显示A)化合物1以剂量依赖性方式结合至表达PSMA的RM1.PGLS细胞；B)1(SyAm-P1)以剂量依赖性方式结合至表达FcγRI的IIA1.6细胞；C)1模拟表达FcγRI和可溶的重组人PSMA的IIA1.6细胞之间的三元复合物的能力；D)通过1诱导的IFN-γ预处理的U937细胞，相对PSMA标记的珠的超氧化物爆发产生。吞噬作用和超氧化物爆发数据是一式三份在三个单独情况下进行的代表性实验；E)使用IFN-γ预处理的U937细胞作为效应物和1诱导的荧光聚苯乙烯PSMA标记的珠以剂量依赖性方式和PSMA依赖性方式的吞噬作用。

图4显示A)通过IFN-γ预处理的U937细胞，相对PSMA标记的珠，化合物2(SyAMP-2)和3(SyAMP-3)诱导的吞噬作用的比较。相比化合物2，在化合物3中观察到随着有效范围和水平的增加有剂量和PSMA依赖性的响应；B)在化合物3的范围和量增加的情况下，通过预处理的U937细胞，相对PSMA标记的珠，以剂量依赖性方式比较化合物2和3的超氧化物爆发；C)使用IFN-γ，通过化合物3诱导的表达PSMA的RM1.PGLS细胞的吞噬作用；D)吞噬作用的amnis流式细胞术成像，其中具有完全吞噬作用的代表性图，与吞噬杯(phagocyticcup)形成进行比较。所示通道为亮视野、靶标(用Fl1染料DiO染色)、核素(染色的DAP1)、巨噬细胞(F12期DID)和合并图象。

图5，表1，显示在50nM化合物2存在的情况下，PSMA涂覆的6μm珠子被IFN-γ预处理的U937细胞的吞噬作用。该表列出每平方μm测量的PSMA，其使用藻红蛋白标记的抗PSMA抗体，8.2pmol/珠。关于负载能力，对5.7pmol/珠和2.9pmol/珠计算每平方μm的PSMA，与8.2pmol/珠比较。使用藻红蛋白抗PSMA抗体进行RM1.PGLS细胞的PSMA测量。靶标的吞噬作用使用预处理的U937细胞和50nM化合物2进行。

图6显示PSMA标记的6μm珠子被IFN-γ预处理的U937细胞的吞噬作用。比较不同浓度的化合物1或化合物2诱导的吞噬作用响应。

图7显示A)不同长度和疏水性的连接脲PSMA结合部分的不同配体的结构；B)显示PSMA标记的6μm珠子被IFN-γ预处理的U937细胞的吞噬作用。对不同浓度的SyAMs诱导的吞噬响应进行比较，该SyAMs具有一对连接至CP33的PSMA结合基序，该CP33具有不同连接基长度和组成。

图8显示A)前带现象，其中过量浓度引起Fc受体SyAM-P结合的减少(即使作为具有PSMA的SyAM-P也保持完整)；B)显示数据叠加拟合至分析的三元复合物模型。从SyAM-P1至SyAM-P2，功效和效力的增加与靶向亲和力的因子为5的增加一致。从SyAM-2至SyAM-P3，观察到的功效和效力的增加与两个数量级的增加一致。在分析模型中由于较弱的结合亲和力改善引起的SyAM-P3的增加具有较大净效应。

图9显示在50nMSyAM-P3存在下用6μm珠子涂覆的PSMA被IFN-γ预处理的U937细胞的吞噬作用。A)显示通过增加浓度(以nM)的人IgG对吞噬作用的抑制，该IgG抑制分子与Fc受体的相互作用。B)显示通过增加浓度的2-PMPA对吞噬作用的抑制，该2-PMPA抑制分子和PSMA的相互作用。

图10显示A)在不同浓度的SyAM-P3存在下比较+/-靶标PSMA+珠子的超氧化物爆发测试的曲线下面积(AUC)。随着测试时间观察到超氧化物很少积聚或没有积聚。B)显示在单独的SyAM-P3存在下相对很少背景超氧化物至没有背景的超氧化物的检测采取的峰值超氧化物产生时间(xmin)。

图11显示在6.25nMSyAM-P3存在下表达PSMA的RM1.PGLS细胞被IFN-γ预处理的U937细胞的吞噬作用。A)显示通过增加浓度(以nM)的人IgG对吞噬作用的抑制，该IgG抑制分子与Fc受体的相互作用。B)显示通过增加浓度的2-PMPA对吞噬作用的抑制，该2-PMPA抑制分子和PSMA的相互作用。

图12显示在不同浓度的化合物3或具有抗DNP抗体(133nM)的ArmP8的存在下RM1.PGLS细胞被Fn-γ预处理的U937细胞的吞噬作用。吞噬作用从无分子的背景减去。化合物3的柱证实在比ArmP8显著更低的浓度具有吞噬作用。

图13，表2显示Amnis吞噬作用：所附的双阳性物(doublepoisitives)是指在常规FACS中作为ADCP评分的所有事件，其中靶标和效应物被染色为两种不同颜色。然后将Amnis图像流流式细胞术收集的所有聚焦的(in-focus)事件分类为“完成的”(其中靶标完全被巨噬细胞吞食)或“开始的”(其中在巨噬细胞和靶标之间已形成清楚的吞噬杯)。

图14显示多种Fc受体结合部分，其具有作为FcγRI调节剂的活性且可用作本发明的[IBT]基团。在该图中，所示的各化合物在游离羟基(OH基)或胺(NH2)处具有连接键。

图15提供化学合成SyAm-P1的方案。该合成在说明书正文的化学合成部分讨论。

图16显示最终产物SyAM-P1，其通过图15所示的方法合成。应注意在诊断应用中，共价连接至CP33部分的赖氨酸氨基酸和生物素可容易被任意数量的具有不反应氨基酸侧链的氨基酸代替。

图17显示SyAM-P2的化学合成，其包含生物素基团以用于诊断应用。

图18显示SyAM-P3的某些部分的化学合成(脲形成)和连接基合成。

图19显示包含[MULTICON]基团的SyAM-P3的第二连接基的化学合成。

图20显示将CBT基团连接至包含叠氮基的[MULTICON]基团(以进一步修饰来提供SyAM-P3)的化学合成。随后显示该叠氮基与包含两个游离胺基的复杂炔属化合物发生反应，所述两个游离胺基连接至炔属部分与叠氮基部分反应时形成的三唑基团，从而形成复杂中间体，该复杂中间体可与两个CP33基团缩合以形成SyAM-P3。

图21显示将二酮连接基引入至CP33-赖氨酸中间体(赖氨酸的羧酸基团已被胺封端形成酰胺基)，该连接基被琥珀酰亚胺离去基团封端。最终中间体，如图所示，在二酮连接基的远端包含琥珀酰亚胺离去基团，其可与图20的中间体的两个游离胺基反应以提供图22的最终产物SyAM-P3。

图22显示最终产物SyAM-P3。

图23显示合成SyAm-P2化合物的替代连接基策略。该方案显示使用氨基己酸多肽连接基、聚乙二醇连接基和进一步通过酰胺基连接成延长的连接基的聚乙二醇连接基合成SyAM-P2。

图24显示使用替代连接基对SyAM-P2的化学合成步骤。

发明目的

本发明的一个目的是提供嵌合双官能和多官能化合物，其可用于治疗几乎任何癌症(包括转移性癌)，尤其包括前列腺癌和转移性前列腺癌。

本发明的另一个目的是提供化合物，其包含细胞结合部分和Fc受体结合部分，该细胞结合部分结合至癌细胞、尤其是前列腺癌细胞和转移性前列腺癌细胞的前列腺特异性膜抗原(PSMA)，该Fc受体结合部分结合至Fc受体、尤其是FcγRI受体，且调节对化合物结合的癌细胞的体液/抗体应答，以引起癌细胞死亡和治疗癌症。

本发明的另一个目的是提供嵌合双官能和多官能化合物，其可用于提供药物组合物，包括含另外的生物活性剂或辅助治疗癌症(尤其是前列腺癌，包括转移性前列腺癌)的药剂的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供使用根据本发明的嵌合双官能和多官能化合物治疗癌症(尤其是前列腺癌，包括转移性前列腺癌)的方法，所述化合物显示预料不到的且协同的抗癌活性。

本发明的另一个目的是提供抑制和/或减少癌症(尤其包括转移性前列腺癌)的转移可能性的方法。

本发明的这些和/或其它目的可容易通过审阅本文所述本发明而获得。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供双官能或多官能化合物，其结合至癌细胞上的前列腺特异性膜抗原(PMSA)，且分别通过[IBT]基团结合至Fc受体，通常为FcγRI受体。通过调节Fc受体(通常为Fcγ受体，最通常为FcγRI受体)，位于癌细胞(通常为前列腺癌细胞和/或转移性癌细胞)表面上的化合物刺激免疫效应细胞，从而增加以协同方式起作用的免疫信号转导和吞噬作用和/或细胞毒性响应以辅助从组织消除癌细胞，从而治疗疾病。

在一个实施方案中，本发明涉及根据以下通式的化合物：

其中[IBT]为Fc(通常为Fcγ受体，最通常为FcγRI受体)受体结合部分；

[CBT]为细胞结合部分，其结合至前列腺特异性膜抗原(PSMA)；

L₁和L₂为连接基(该基团可包括一个或多个双官能连接体基团[CON}或多于一个连接基以提供延长的连接基)；

[MULTICON}为双官能或多官能连接体基团(优选地，多官能)，当其存在时，通过连接基将至少一个[IBT)基团连接至至少一个[CBT]基团；

MCON为整数0至10，通常为1至10，更通常为1至5，通常为0，1或2；

n和n’各自独立地为整数1至15，通常为2至10，通常为2至5，更通常为2或3，或2、3、4、5或6；

NL1和NL2各自为整数0至10，通常为1至10，通常为2至5，更通常为2或3，条件是n≥NL1且n’≥NL2。

在另一实施方案中，[IBT]为CP33(参见图2和图14)，其作为FCγRI受体的调节剂具有优异的活性，且在增强免疫效应细胞(例如，巨噬细胞和嗜酸性粒细胞)以提供选择性吞噬作用和/或细胞毒性响应(包括调理癌细胞、尤其是前列腺癌细胞)方面特别有效，导致癌细胞和由此的癌组织的根除。此外，认为根据本发明的化合物诱导患者中对癌组织的长期免疫力，从而减少在观察到癌症缓解的患者中癌症复发的可能性。因此，根据本发明的化合物可用于治疗和预防癌症和转移性癌，尤其包括前列腺癌和转移性前列腺癌。根据本发明的化合物通常包含至少一个[IBT]基团和至少两个[CBT]基团，通常为至少两个[IBT]基团和两个[CBT]基团，且通常两个或三个[IBT]基团和两个或三个[CBT]基团。

根据本发明的其它化合物包括根据以下化学结构的化合物：

其中R₁为[IBT]基团，通常为CB33；

R₂为[CBT]基团；通常为其中k为4，其任选直接连接至连接体基团[CON]，通常在环氮处连接至三唑连接体基团

其中CL为

m为整数0至12，通常为0、1、2、3、4、5、6

且iL为0或1，通常为1；

X为本文另外描述的[MULTICON]基团，通常为以下基团

其中Y₄为C-H或N；且

各X”独立地衍生自亲电或亲核基团，优选(CH₂)_n”O、(CH₂)_n”N^RCON、(CH₂)_n”S、(CH₂)_n”或(CH₂)_n”C＝O，或一个或多个X”为[CON]基团，通常为

基团，其通过胺连接至[MULTICON]的环结构，其中CL与上述相同；

该取代基RCON为H或C₁-C₃烷基，优选H或CH₃且

n”为0、1、2或3，且

L为在本发明其它方面描述的连接基，通常为根据以下化学结构的基团(参见图2，化合物1、2或3，其将[CBT]部分连接至[MULTICON]分子)：

其中R_a为H或CH₃，最通常为H；

m为整数1至12，通常为1、2、3、4、5或6；

m”为整数1、2、3、4、5或6，通常为6；

t为0、1、2、3、4、5或6；且

iL为0或1，通常为1，其中L可在一端连接至[CON]基团和[CBT]基团和在另一端连接至[MULTICON]基团；或

或者，上述L将[IBT]基团直接或通过至少一个氨基酸(通常为包含1至10个氨基酸基团的寡肽，通常为赖氨酸或甘氨酸赖氨酸二肽，如图2的化合物1所示)连接至[MULTICON]分子(如图2的化合物1中)，或

或者，在连接基L将[IBT]连接至[MULTICON]基团的情况下(如图2的化合物2中)，该连接基L为包含1至10个肽的肽连接基，通常为赖氨酸氨基酸或二赖氨酸寡肽(赖氨酸的游离羧酸和胺可被胺(在羧酸的情况下)或酰基(在游离胺的情况下)或其它基团封端以防止进一步反应性)；或

或者，在连接基L将多于一个[IBT]基团连接至[MULTICON]基团的情况下，通常L为复合连接基(如图2的化合物3所示)，其由包含氧化乙烯的胺基和氨基酸(通常为赖氨酸)或氨基酸二肽(通常为二赖氨酸)构成，所述二赖氨酸之一直接键合至CP33，且另一氨基酸(通常为赖氨酸)将上述氧化乙烯胺基通过[CON]基团(最通常为三唑)连接至[MULTICON]基团，

包含氧化乙烯的胺基如下：

其中q为1、2、3或4且q’为1至12，通常为1、2、3、4、5或6，

该酮基连接至氨基酸基团

该氨基酸基团通过以下二酮基连接至[IBT]，通常为CP33，

在其它实施方案中，根据本发明的化合物可通过以下结构表示：

其中R₁为[IBT]基团，通常为CB33；

R₂为[CBT]基团；通常为其中k为4，其任选直接连接至连接体基团[CON]，通常在环氮处连接至三唑连接体基团，

X为本文另外上述的[MULTICON]基团，通常为以下基团

其中Y₄为C-H或N；且

各X”独立地衍生自亲电或亲核基团，优选(CH₂)_n”O、(CH₂)_n”N^RCON、(CH₂)_n”S、(CH₂)_n”或(CH₂)_n”C＝O或一个或多个X”为[CON]基团，

通过胺连接至[MULTICON]的环结构

其中CL为

CL中的m为整数0至12，通常为0、1、2、3、4、5或6；

且iL为0或1，通常为1；

该取代基RCON为H或C₁-C₃烷基，优选H或CH₃且

n”为0、1、2或3；

且Z和Y各自独立地为

或其可药用盐、立体异构体、溶剂合物或多晶形物。

在本发明另一方面，药物组合物包含有效量的如上所述的双官能/多官能化合物，任选且优选组合有可药用载体、添加剂或赋形剂。在替代方面，药物组合物包含有效量的本文所述的至少一种双官能/多官能化合物，以及组合有至少一种用于治疗癌症，包括前列腺癌(尤其包括转移性前列腺癌)、或癌症(尤其是前列腺癌)的继发性病症或作用(例如，在本发明其它方面描述的骨痛，增生，骨质疏松等)的其它药物。

在本发明另一方面，根据本发明的化合物用于在患者中治疗或减少癌症(包括转移性癌)的可能性、尤其是需要的男性患者中的前列腺癌，和减少癌症尤其是前列腺癌转移的可能性，或减少缓解的癌症复发的可能性。该治疗癌症的方法包括向需要的患者给药有效量的本文另外所述的三官能嵌合化合物以及可药用载体、添加剂或赋形剂，任选还组合有至少一种对治疗癌症有效的其它药物，所述癌症尤其包括前列腺癌、转移性癌或一种或多种其继发性症状或作用。

本发明还涉及抑制前列腺癌以减少或抑制癌症扩散或转移至患者身体的其它组织的方法，所述其它组织尤其包括骨、淋巴(淋巴结)系统、膀胱、输精管、肾、肝、肺和脑，等等。

本发明还涉及其中破坏具有PSMA的非癌细胞可具有治疗用途的情况，尤其在癌症治疗中。例如，由于PSMA在许多非前列腺癌细胞的新生血管上，而非正常血管系统上发现，本发明可用于其它形式的癌症的抗血管生成治疗，其通过靶向那些癌症的新血管系统和抑制癌症的生长和扩散实现。

发明详述

以下术语用于描述本发明。在术语未在本文具体定义的情况下，该术语由本领域技术人员在上下文中将其应用于描述本发明的用途时被给予本领域公认的意思。

术语“化合物”，如本文所述，除非另有所述，是指任何具体化学化合物，优选本文公开的SyAMs，且包括其互变异构体、区域异构体、几何异构体，且当适用的话，包括旋光异构体(对映异构体)，以及其可药用盐和衍生物(包括前药形式)。在本文的使用中，术语化合物通常是指单一化合物，但也可包括其它化合物如立体异构体，区域异构体和/或旋光异构体(包括外消旋混合物)以及具体的对映异构体或富含所公开的化合物的对映异构体的混合物。在本文该术语还指化合物的前药形式，其已被修饰以促进化合物至活性位点的给药和递送。应注意在描述本发明化合物时，描述了与其相关的多种取代基、连接基和连接体分子和变量，等等。本领域技术人员应理解本文描述的分子是下文通常描述的稳定的化合物。

术语“患者”或“受试者”在整个说明书中在上下文用于描述动物，通常为哺乳动物且优选人，向其提供使用本发明的组合物的治疗，包括预防性治疗(预防)。对于对具体动物如人患者或具体性别的患者，如男性患者特异的感染、病症或疾病状态的治疗，该术语患者是指该具体动物。根据本发明的化合物可用于治疗癌症，尤其包括前列腺癌，特别是转移性前列腺癌。

除非另有所述，本文使用的术语“有效的”是描述一定量的化合物或组合物(单独的一种或多种SyAMs或其组合)，其在上下文中用于产生或实现预期结果，无论该结果涉及抑制癌症或治疗受试者的癌症继发性症状、病症的疾病状态或表现，如在本发明其它方面描述。该术语包括所有其它有效量或有效浓度术语(包括术语“治疗有效的”)，它们在本申请另外描述。

术语“治疗(treat，treating)”、“处置(treatment)”等，如本文所述，是指向处于癌症风险、尤其是前列腺癌或前列腺癌转移风险的患者提供益处的任何作用，包括通过减轻或抑制至少一种症状改善病症，抑制癌症生长，减少癌细胞或组织，防止或延迟癌症转移进展，防止或延迟继发于癌症而发生的疾病状态或病症发作，或缓解或治愈癌症，等等。如本文所述，治疗包括预防性和治疗性处置。在治疗癌症的情况下，当使用时术语“预防性”是指减少发生可能性或发生的严重性，所述癌症包括上述本发明其它方面描述的癌症转移。

术语"瘤形成"是指在不会引发正常细胞增殖，或会引起正常细胞增殖停止的条件下不受控且进展的肿瘤细胞增殖。瘤形成导致"赘生物(neoplasm)"，其在本文定义为是指任何新的和异常的生长，特别是组织的新生长，其中细胞生长是不受控且进展的。因此，瘤形成包括"癌症"，其在本文是指失去正常控制的具有独特特点的肿瘤细胞增殖，其导致不受调节的生长，缺少分化，局部组织侵袭，和/或转移。

如本文所述，赘生物包括，但不限于，相比在相同类型的组织中的正常增殖，受试者或宿主的组织中细胞形态不规则，以及受试者组织中细胞的病理性增殖。此外，赘生物包括良性肿瘤和恶性肿瘤(例如，结肠肿瘤)，其为侵袭性或非侵袭性的。恶性肿瘤与良性肿瘤的不同在于前者显示更大程度的间变，或丧失细胞分化和取向，且具有侵袭和转移的性质。赘生物或瘤形成(本发明靶细胞可从其衍生)的实例包括，但不限于，癌(例如，鳞状细胞癌，腺癌，肝细胞癌和肾细胞癌)，特别是膀胱、肠、乳腺、子宫颈、结肠、食管、头、肾、肝、肺、颈、卵巢、胰腺、前列腺和胃的癌；白血病；良性和恶性淋巴瘤，特别是伯基特淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；良性和恶性黑素瘤；骨髓增生性疾病；肉瘤，特别是尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肉瘤、肌肉瘤、外周神经上皮瘤、和滑膜肉瘤；中枢神经系统肿瘤(例如，神经胶质瘤，星形细胞瘤，少突神经胶质细胞瘤，室管膜瘤，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，神经节瘤，神经节神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，松果体细胞肿瘤，脑膜瘤，脑膜肉瘤，神经纤维瘤和神经鞘瘤)；生殖系肿瘤(例如，肠癌，乳腺癌，前列腺癌，子宫颈癌，子宫癌，肺癌，卵巢癌，睾丸癌，甲状腺癌，星形细胞瘤，食管癌，胰腺癌，胃癌，肝癌，结肠癌和黑素瘤)；混合类型的瘤形成，特别是癌肉瘤和霍奇金病；和混合起源的肿瘤，如维尔姆斯肿瘤和畸胎癌，它们可通过根据本发明的一种或多种化合物治疗。参见，(Beers和Berkow(eds.)，TheMerckManualofDiagnosisandTherapy,17.sup.thed.(WhitehouseStation,N.J.:MerckResearchLaboratories,1999)973-74,976,986,988,991。

因为本发明化合物具有作为抗血管生成化合物的活性，本发明具有在任何组织治疗几乎任何癌症的通用适应性，因此本发明的化合物、组合物和方法通常适用于治疗癌症。由于蛋白质靶点在大多数非前列腺癌细胞的新血管系统上发现，本发明的化合物也可作为其它类型癌症的抗血管生成治疗。最通常，该化合物用于治疗前列腺癌和转移性前列腺癌，以及减少前列腺癌转移的可能性。

在本发明某些具体方面，治疗的癌症为前列腺癌或转移性前列腺癌。单独地，转移性前列腺癌在该疾病的晚期可在几乎癌症患者的所有组织中发现，通常转移性前列腺癌发现于精囊，淋巴系统/淋巴结(淋巴瘤)、骨、膀胱组织、肾组织、肝组织和几乎任何组织，包括脑(脑癌/肿瘤)。因此，本发明是普遍适用的且可用于治疗任何组织中的任何癌症，无论病因是什么。

术语“肿瘤”用于描述恶性或良性生长或肿胀。

术语“前列腺癌”用于描述一种疾病，其中癌症在前列腺(一种男性生殖系统的腺体)中发展。当前列腺细胞突变且开始不受控的增殖时发生前列腺癌。这些细胞可从前列腺转移(转移性前列腺癌)至身体的几乎任何其他部分，特别是骨和淋巴结，以及肾、膀胱和甚至脑等其它组织。前列腺癌可引起疼痛、排尿困难、性交问题、勃起功能障碍。在该疾病晚期可潜在发展其它症状。

前列腺癌的检出比率在整个世界变化很大，南亚和东亚的检出频率比欧洲尤其是比美国低。前列腺癌在年龄大于50岁的男性中最常见，且是男性最常见癌症类型之一。然而，许多患有前列腺癌的男性从没有症状，不进行治疗，且最终死于其他原因。这是因为前列腺癌症在大多数情况是缓慢发展的，且因为大多数患者年龄超过60。因此，他们经常死于与前列腺癌不相关的原因。许多因素，包括遗传和饮食，涉及前列腺癌的发展。前列腺癌的存在可通过症状、身体检查、前列腺特异性抗原(PSA)或活检而指示。对于PSA检测的精确性及其筛选的有用性存在忧虑。可疑的前列腺癌通常通过进行前列腺活检且在显微镜下检查而证实。可进行其它检测，如CT扫描和骨扫描，以确定前列腺癌是否扩散。

目的在于治愈前列腺癌的治疗方案主要是外科手术和放射治疗。根据临床情况和所需结果，也可存在其它治疗如激素治疗、化学治疗、质子治疗、冷冻手术、高强度聚焦超声(HIFU)。本发明可用于增强这些治疗的一种或多种或代替它们。

男性的年龄和潜在健康状况、转移程度、显微镜下的表现和癌症对初始治疗的响应在检测疾病结果方面是重要的。判定是否以治愈为目的地治疗局部前列腺癌(前列腺中包含的肿瘤)需要在关于患者存活和生活质量的预期益处和有害作用之间进行权衡。

评估前列腺癌的一个重要部分为确定癌症阶段，或癌症已扩散多远。知晓阶段有助于确定预后且当选择疗法时是有用的。最常见的系统为四阶段TNM系统(肿瘤/结节/转移的缩写)。其成分包括肿瘤尺寸、涉及的淋巴结数量和任何其他转移的存在。

任何分阶段系统所做的最重要的区分为是否该癌症仍然限定在前列腺或已经转移。在TNM系统，临床T1和T2癌症仅在前列腺中发现，而T3和T4癌症已扩散到其它地方且转移至其它组织。多种检测可用于寻找扩散的证据。这些包括计算机断层摄影术以评估骨盆中的扩散，骨扫描以寻找向骨的扩散，和直肠内线圈磁共振成像以密切评估前列腺囊和精囊。骨扫描经常由于在骨转移区域增加的骨密度而显示成骨细胞外观-与许多其它转移的癌症中所发现的不同。计算机断层摄影术(CT)和磁共振成像(MRI)目前不会在根据荟萃分析的前列腺癌患者的可能淋巴结转移评估中增加任何重要信息。

如果发现得早，前列腺癌相对容易治疗。经前列腺活检后，病理学家在显微镜下观察样品。如果存在癌症，病理学家报告肿瘤级别。该级别告知该肿瘤组织与正常前列腺组织的差异有多大，且建议肿瘤可能生长的速度。Gleason系统用于将前列腺肿瘤分级为2至10级，其中Gleason评分为10指示最异常情况。病理学家对在显微镜下观察到的最常见模式赋予1至5的数值，然后对次常见的模式进行同样的赋值。这两个数值的总和为Gleason评分。Whitmore-Jewett阶段为有时使用的另一方法。恰当的将肿瘤分级是关键的，因为肿瘤级别用于确定推荐治疗的主要因素。

早期前列腺癌通常不引起症状。通常其在常规检查中在检查到PSA升高时被诊断出。然而，有时前列腺癌确实引起症状，通常类似于如良性前列腺肥大的疾病症状。这些包括尿频、增加的夜间排尿、难以开始和保持尿的稳定流、尿血和尿痛。前列腺癌与排尿功能障碍相关，因为前列腺围绕前列腺尿道。前列腺改变因此直接影响排尿功能。因为输精管将精液沉积至前列腺尿道，且从前列腺本身的分泌物包括在精液内含物中，因此前列腺癌也可造成与性功能和表现相关的问题，如难以实现勃起或射精痛。

晚期前列腺癌可扩散至身体其他部分，且这可引起另外的症状。最常见症状为骨痛，通常在椎骨(脊柱骨)、骨盆或肋骨中。癌症扩散至其它骨如股骨通常到达骨的近端部分。在脊柱中前列腺癌也可压制脊髓，引起腿无力和大小便失禁。

前列腺癌的具体原因仍未知。男性患前列腺癌的风险与其年龄、基因、种族、饮食、生活方式、服药和其他因素相关、主要风险因素为年龄。前列腺癌在45岁之前是不常见的，但随着年龄增长变得常见。确诊的平均年龄为70岁。然而，许多男性从不知道他们患有前列腺癌。

男性的遗传背景对其患前列腺癌的风险有影响。这通过在某些种族人群、患前列腺癌的同卵双生男性和具有某些基因的男性中前列腺癌发病率的增加而证实。兄弟或父亲患有前列腺癌的男性患前列腺癌的风险是通常风险的两倍。斯堪的纳维亚的双胞胎研究表明40％的前列腺癌风险可通过内在因素解释。然而，没有单一基因促成前列腺癌；许多不同的基因都参与。作为女性中卵巢癌和乳腺癌的重要风险因素的两种基因(BRCA1和BRCA2)也涉及前列腺癌。

某些食物、维生素和矿物质的摄入量可导前列腺癌风险。可增加前列腺癌风险的饮食因素包括低水平摄入维生素E、矿物质硒、绿茶和维生素D。大量研究已牵涉到乳制品、尤其是低脂乳品和其它添加棕榈酸维生素A的乳制品。这种形式的合成维生素A已关联至前列腺癌，因为其与锌和蛋白质反应以形成不可吸收的复合物。前列腺癌也与在某些乳制品中加入牛生长激素激素有关。

在前列腺癌和药物、医疗手段和医疗条件之间有许多关联。每天服用抗炎药如阿司匹林、布洛芬或萘普生可降低前列腺癌风险。服用降低胆固醇的药物(已知为他汀类)也可降低前列腺癌风险。前列腺感染或发炎(前列腺炎)可增加前列腺癌几率，且感染性传播感染衣原体、淋病或梅毒似乎增加风险。肥胖症和血液中升高的睾酮水平可增加前列腺癌风险。

前列腺癌分类为腺癌或腺体癌症，当正常分泌精液的前列腺细胞突变为癌细胞时其开始发生。腺癌最常见的前列腺区域为外周区。起初，小的癌细胞簇保持局限在其它正常前列腺，该疾病称为原位癌或前列腺上皮内瘤(PIN)。尽管没有证据证明PIN为癌症前体，但其与癌症密切相关。这些癌细胞随着时间开始增殖且扩散至周围前列腺组织(间质)，以形成肿瘤。最终，肿瘤可生长的足够大以侵袭附近的器官如精囊或直肠，或肿瘤细胞可发展在血流和淋巴系统中运动的能力。前列腺癌被认为是恶性肿瘤，因为其为细胞团块，其可侵袭身体其它部分。这种对其它器官的侵袭称为转移。前列腺癌最经常转移至骨、淋巴结、直肠和膀胱。

在前列腺癌，正常前列腺的规则腺体被不规则腺体和细胞簇代替。当男性具有前列腺癌症状，或筛选检测指示癌症风险增加，提供了更多的侵袭性评价。可完全证实前列腺癌诊断的唯一检测为活检，去除小块的前列腺以用于显微镜检查。然而，在活检之前，可使用多种其它工具以收集更多前列腺和泌尿道有关的信息。膀胱镜检查从膀胱内部显示泌尿道，其使用薄的柔性摄像管插入尿道。经直肠的超声检查在直肠中使用来自探针的声波产生前列腺照片。

活检后，组织样品在显微镜下检查以确定是否存在癌细胞，且评估任何发现的癌症的显微特征(或Gleason评分)。此外，可将组织样品染色以确定PSA和其它肿瘤标记的存在，以确定转移的恶性细胞的起源。目前有多种诊断前列腺癌的其它可能的方法，如早期前列腺癌抗原-2(EPCA-2)和前列腺小体分析。

除了使用根据本发明的化合物进行治疗，食用硒、维生素E、番茄红素、大豆食品、维生素D、绿茶、ω-3脂肪酸和植物雌激素在前列腺癌治疗(包括预防性治疗)以减少前列腺癌中能提供支持作用。在早期试验中，选择性雌激素受体调节剂药物托瑞米芬显示出前景。阻断睾酮转化为二氢睾酮(且减少细胞生长的倾向)的两种药物，非那雄胺和度他雄胺，显示出是有用的。十字花科植物(花椰菜和西兰花)中发现的植物化学物质吲哚-3-甲醇和二吲哚基甲烷，具有有利的抗雄激素和免疫调节性质。前列腺癌风险在素食饮食中降低。

前列腺癌的治疗可包括主动监测、外科手术(前列腺切除术或睾丸切除术)、放射治疗(包括短距放射治疗(前列腺短距放射治疗)和外线束放射)以及激素治疗。存在多种形式的激素治疗，包括以下治疗，其每一个可与本发明的化合物组合。

·抗雄激素，如氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特和乙酸环丙孕酮，其直接阻断前列腺癌细胞中睾酮和DHT的作用。

·药物如酮康唑和氨鲁米特，其阻断肾上腺雄激素如DHEA的产生。这些药物通常仅与可阻断睾丸产生的95％的雄激素的其它方法组合使用。这些组合的方法称为全雄激素阻断(TAB)，其也可使用抗雄激素实现。

·GnRH调节剂，包括激动剂和拮抗剂。GnRH拮抗剂直接抑制LH的产生，而GnRH激动剂在初始刺激作用后通过下调过程抑制LH。阿巴瑞克为GnRH拮抗剂的一个实例，而GnRH激动剂包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林和布舍瑞林。

·乙酸阿比特龙可用于减少侵袭性晚期前列腺癌患者的PSA水平和肿瘤尺寸达70％。索拉非尼也可用于治疗转移性前列腺癌。

上述各治疗具有缺点，其限制其在某些情况的使用。GnRH激动剂最终引起与睾丸切除术相同的副作用，但在治疗开始可能造成更恶化的症状。当GnRH激动剂首次使用时，睾酮波动可导致转移性癌引起的骨痛增加，因此通常添加抗雄激素或阿巴瑞克以弱化这些副作用。通常不使用雌激素，因为它们增加心血管疾病和血凝块的风险。抗雄激素通常不引起阳萎且通常引起较少的骨和肌肉质量的丧失。长期使用酮康唑可引起肝损伤，而氨鲁米特可引起皮疹。

晚期前列腺癌的姑息治疗聚焦于延长寿命和缓解转移性疾病的症状。如上所述，乙酸阿比特龙在治疗晚期前列腺癌显示一些前景，如同索拉非尼。可提供化学治疗以减缓疾病进展和延迟症状。最常使用的方案将化学治疗性药物多西他赛与皮质类固醇如泼尼松组合。二膦酸盐如唑来膦酸已显示延迟骨骼并发症如骨折或在患有激素抵抗性转移性前列腺癌的患者中需要放射治疗。Alpharadin可用于靶向骨转移。II期实验显示延长的患者存活时间、减少的疼痛和改善的生活质量。

由于转移性疾病引起的骨痛使用阿片样物质的疼痛缓解物如吗啡和羟考酮治疗。针对骨转移的外线束放射治疗可提供疼痛缓解。注射某些放射性同位素，如锶-89、磷-32或钐-153，也靶向骨转移且可帮助缓解疼痛。

作为主动监测或确定性治疗的替代，替代疗法可用于治疗前列腺癌。已显示通过使用绝对素食者饮食(允许吃鱼)、规律的运动和降低压力，PSA在患有明显局部前列腺癌的男性中降低。在短期实验中，在患有局部癌症的男性中许多其它单一药物显示出减少PSA，减缓PSA加倍时间，或对继发性标记具有类似作用，如石榴汁或金雀异黄素(其为多种豆类中发现的异黄酮)。

转移性和晚期前列腺癌的表现或继发性病症或作用可包括贫血、骨髓抑制、体重减轻、病理性骨折、脊髓压迫、疼痛、血尿、输尿管和/或膀胱出口梗阻、尿滞留、慢性肾衰竭、尿失禁、和与骨或软组织转移相关的症状，等等。

可用于与根据本发明的嵌合抗体募集化合物组合使用的其他前列腺药物包括，例如，前列腺增大药物/药剂，以及氟他胺(eulexin)、氟他胺(flutamide)、戈舍瑞林、亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林(lupron)，尼鲁米特(nilandron)、尼鲁米特(nilutamide)、诺雷德及其混合物。上述前列腺增大药物/药剂，包括例如，ambenyl、ambophen、amgenal、atrosept、bromanyl、溴苯海拉明-可待因、bromotuss-可待因、多沙唑秦(cardura)、氯苯那敏-氢可酮、环吡酮、克霉唑-倍他米松、dolsed、度他雄胺、非那雄胺、flomax、gecil、hexalol、兰美抒、lanased、环吡司霜(loprox)、lotrisone、乌洛托品、methen-bella-methBl-phensal、meth-hyos-atrp-Mblue-BA-phsal、MHP-A、mybanil、prosed/DS、Ro-Sed、S-TForte、坦洛新、特比萘芬、trac、tussionex(氢可酮镇咳药)、ty-methate、胍、uratin、uretron、uridon、uro-ves、urstat、usept及其混合物。

术语“免疫结合末端部分”、“免疫结合末端”或[IBT]用于描述根据本发明的嵌合化合物的一部分，其包含结合至免疫效应细胞(巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，树突细胞等)的FcγRI.受体上的分子，且促进癌细胞的调理、吞噬作用、细胞毒性和死亡。用于本发明的优选的FcRI结合部分为CP33，如附图2所示。

用于本发明的代表性[IBT]基团包括在附图14中的那些。这些化合物的每一种可用于调节与免疫效应细胞(巨噬细胞，嗜酸性粒细胞，中性粒细胞)相互作用的FcγRI受体以诱导吞噬作用和这些效应细胞对癌细胞的其它活性，如在本发明其它方面所描述。此外，这些化合物也可提供在患者中诱导对癌细胞长期免疫应答的能力，从而减少癌症缓解后复发的可能性。

代表性[IBT]基团包括例如，CP33(一种优选IBT)，YU158145(4861-0063)，YU160469(7165-0402)，YU160642(7527-0236)，YU160645(7527-0311)，YU160647(7527-0320)，YU164313(D086-0504)，YU164340(D089-0267)，YU164343(D089-0287)，YU164367(D089-0353)，YU163512(C766-0140)，YU163538(C766-0571)，YU163540(C766-0578)，YU163511(C766-0135)，YU163552(C798-0145)，YU163554(C798-0169)，YU160794(7889-2431)，YU163387(C720-0562)，YU163388(C720-0563)，YU162384(C218-0192)，YU162389(C218-0271)，YU162392(C218-0284)，YU162393(C218-0288)，YU162402(C218-0460)，YU162408(C218-0524)，YU165568(D420-6099)，P680-0123(YU170286：01)，YU165561(D420-5349)，YU165531(D420-4922)，YU165550(D420-5220)，YU169577(M050-0297)，YU162636(C291-0121)，YU163100(C611-0416)，YU163102(C611-0421)，YU162257(C200-0357)，YU169182(K891-0143)，YU169197(K891-0201)，YU162415(C218-0870)，YU162417(C218-0879)，YU162413(C218-0864)，YU162414(C218-0868)和YU162730(C301-9341)，它们在游离羟基或游离胺处修饰以连接至本发明的化合物的其它组分。这些免疫调节化合物的每一种在图14中作为化学结构提供，其具有在化合物的游离羟基或游离胺处指示的连接。这些分子每一种上与连接基和本发明的分子剩余部分的连接是在游离羟基或游离胺上，如图14所示(相应地，在每种化合物中键与另一键在O或N处交叉)。本发明最常用的[IBT]为CP33，因为其已显示作为FcγRI调节剂更大的活性。CP33也在图14中提供。

术语“细胞结合末端部分”、“细胞结合末端”或“细胞结合部分”用于描述根据本发明的嵌合化合物的部分，其包含可特异结合至前列腺特异性膜抗原(PSMA)的至少一个小分子或部分。

用于本发明的优选的CBT基团如下所示：

其中X₁和X₂各自独立地为CH₂、O、NH或S；

X₃为O、CH₂、NR¹、S(O)、S(O)₂、-S(O)₂O、-OS(O)₂或OS(O)₂O；

R¹为H、C₁-C₃烷基或-C(O)(C₁-C₃)基团；

k为整数0至20，8至12，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4、5或6；

或其盐或对映异构体。

用于本发明的优选的CBT基团为以下基团

其中k为2、3或4，优选3。该CBT基团，以及其它基团，任选在亚烷基(k)的远端(distillend)具有胺基或其它官能团，使得k由例如赖氨酸氨基酸形成，使得该胺基或其它官能团可参与进一步反应以形成连接基、三唑或在本发明其它方面描述的其它双官能连接体基团[CON]或多官能基团[MULTICON]。

术语“连接基”是指将细胞结合末端部分[CBT]或免疫(Fc受体)结合末端[IBT]连接至双官能连接体部分部分/分子[CON]和/或多官能连接体部分/分子[MULTICON]的化学实体。应注意各连接基可通过本文另外公开的任选的双官能连接体分子[CON}连接至[MULTICON}。该连接基为稳定的且也可包含一个或多个连接基以提供本文另外公开的延长的连接基。各连接基可直接连接至[CBT]或[IBT]基团，尤其在[ABT]部分和多官能连接体分子[MULTICON}之间以及[CBT]部分和多官能连接体分子[MULTICON]之间。在一些情况下，该CBT基团可直接连接至双官能连接体基团[CON]，该双官能连接体基团[CON]进一步连接至连接基，且任选地，直接连接至[MULTICON]基团。分子的两种活性官能部分，即免疫结合末端[IBT]和细胞结合末端[CBT]之间的连接基，长度范围为约至约或更多，长度约至约长度约至约长度约至约长度约至约长度约至约长度约至约长度约至约长度约至约长度约至约长度约至约长度约至约等。经常使用在本发明其它方面描述的基于非天然氨基酸的连接基(即，具有在氨基酸单体单元的胺和酸之间有3至6，优选4或5个亚甲基的亚烷基)。通过具有长度为本文另外公开的连接基，可安置该一个或多个[IBT]部分和该一个或多个[CBT]部分以利用根据本发明的化合物的生物活性，该化合物通过[CBT]基团结合至前列腺特异性膜抗原(PSMA)，且调节Fc受体，特别是，免疫效应分子上的FcγRI受体，其通过与[CBT]基团单元协同起作用的[IBT]基团，以实现改善化合物通过免疫效应细胞调节肿瘤消退(例如吞噬作用)的能力和更好的刺激和促进与化合物相关的免疫记忆。这导致选择性和靶向的(协同的)癌细胞死亡，包括转移性癌细胞，特别是，前列腺癌细胞和转移性前列腺癌细胞，无论它们会位于在哪些组织。连接基成分的选择是基于其记载的生物相容性、水和有机介质中的溶解性，和低免疫原性/抗原性的性质。

基于或包括寡聚氨基酸单元的连接基优选用于本发明。这些优选的连接基的长度为2至100个氨基酸单元，但优选可为长度为2至14个氨基酸单元或4至8个氨基酸单元的那些。在优选方面，各氨基酸单元为在本发明其它方面描述的非天然的氨基酸单元，优选在各氨基酸单体单元中具有3至6个亚甲基。各连接基可通过本文另外公开的一个或多个双官能连接体分子[CON]与多官能连接体分子[MULTICON]连接。

尽管如本发明其它方面描述可使用多种连接基，但通常使用基于以下的连接基(非-不稳定的)：聚乙二醇(PEG)连接基、聚丙二醇连接基或聚乙二醇-共-聚丙二醇聚合物(例如，嵌段共聚物，其中嵌段的聚乙二醇部分长度为1至12个聚乙二醇单元且所述嵌段的聚丙二醇部分长度为1至12个聚丙二醇单元，聚乙二醇单元、聚丙二醇单元或聚乙二醇-共-聚丙二醇嵌段共聚物单元的总数为1至100，1至75，1至，1至15，1至12，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或经常高达约100个单元，约1至100，约1至75，约1至60，约1至50，约1至35，约1至25，约1至20，约1至15，1至10，约8至12，约1至8)。在这些之中，更经常使用聚乙烯(PEG)连接基。

供选的优选的连接基可包括，例如，下述的聚脯氨酸连接基和/或胶原连接基(n为约1至100，约1至75，约1至60，约1至50，约1至45，约1至35，约1至25，约1至20，约1至15，2至10，约4至12，约5至10，约4至6，约1至8，约1至6，约1至5，约1至4，约1至3等)。

聚脯氨酸连接基

胶原连接基。

其它连接基包括根据以下化学结构的那些：

其中R_a为H、C₁-C₃烷基或烷醇或与R³形成环(脯氨酸)且R³为衍生自氨基酸的侧链，该氨基酸优选选自丙氨酸(甲基)，精氨酸(亚丙基胍)，天冬酰胺(亚甲基羧基酰胺)，天冬氨酸(乙酸)，半胱氨酸(硫醇，还原或氧化的二硫醇)，谷氨酰胺(乙基羧基酰胺)，谷氨酸(丙酸)，甘氨酸(H)，组氨酸(亚甲基咪唑)，异亮氨酸(1-甲基丙烷)，亮氨酸(2-甲基丙烷)，赖氨酸(亚丁基胺)，蛋氨酸(乙基甲基硫醚)，苯丙氨酸(苄基)，脯氨酸(R³与R_a形成环，且与相邻的氮基团形成吡咯烷基)，羟基脯氨酸，丝氨酸(甲醇)，苏氨酸(乙醇，1-羟基乙烷)，色氨酸(亚甲基吲哚)，酪氨酸(亚甲基酚)或缬氨酸(异丙基)；

m”为整数0至25，优选1至10，1至8，1、2、3、4、5或6；

m(在该背景中)为整数1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；且

n(在该背景中)为整数约1至100，约1至75，约1至60，约1至50，约1至45，约1至35，约1至25，约1至20，约1至15，2至10，约4至12，约5至10，约4至6，约1至8，约1至6，约1至5，约1至4，约1至3等)。

根据本发明的另一连接基包括聚乙二醇连接基，其包含1至1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5个乙二醇单元，该乙二醇单元可进一步通过以下基团连接：酰胺基(其在包含1至5个亚甲基单元的酰胺基的单侧或两侧包含亚烷基)，酮基(其包括包含1至5个亚甲基单元的亚烷基酮基)，胺基(其包括包含1至5个亚甲基单元的亚烷基胺基)，亚烷基(包含1至5个亚甲基单元)，氨基酸或其它与聚乙二醇基相容的部分，包括双官能连接基团[CON])、[CBT]基团、[IBT]基团、[MULTICON]基团和其它连接基，包括其它聚乙二醇基(通常在任意位置具有1至12个乙二醇单元(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)。其它连接基包括氨基酸残基(D或L)的多肽。在另一实施方案中，如本发明其它方面描述，多肽可包括稳定连接基的非天然存在的氨基酸(非天然存在，除了甘氨酸)，其各自在任意位置具有1-15个或更多个将氨基与酸基分开的亚甲基，通常为3至6个亚甲基(3，4、5或6)，和1至100个肽基，以向该部分提供连接基，优选1至12(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。应注意本申请鉴定的多肽连接基和其它连接基(包括不稳定连接基)的每一种可进一步通过以下基团连接至连接体分子/部分[CON]、[MULTICON]分子/部分、[IBT]基团和/或[CBT]基团：酰胺基(其在包含1至5个亚甲基单元的酰胺基的单侧或两侧包含亚烷基)，酮基(其包括亚烷基酮基，在酮基的单侧或两侧包含1至5个亚甲基单元)，胺基(其包括亚烷基胺基，在胺基的单侧或两侧包含1至5个亚甲基单元)，尿烷基(其在尿烷部分的单侧或两侧包括含1至5个亚甲基单元的亚烷基)，亚烷基(包含1至5个亚甲基单元)，氨基酸或其它与连接基化学相容的部分，以将分子组分连接。应注意在聚乙二醇和多肽连接基的情况下，可使用其它基团(例如，亚烷基胺或其它如上所述的基团)或第二连接基以将连接基连接至分子的其它组分。此外，本文鉴定的多于一个连接基可连接在一起以形成本发明化合物其它方面使用的连接基，并与连接基化学的稳定性一致。这些延长的连接基经常通过[CON}连接基团或在本发明其它方面描述的基团连接。

其它优选的连接基包括根据以下结构的那些：

其中R_a为H或C₁-C₃烷基，优选CH₃，最通常为H；

m为整数1至12，通常为1、2、3、4、5或6；

m”为整数1、2、3、4、5或6，通常为6；

t为0、1、2、3、4、5或6；且

iL为0或1，通常为1，其中所述连接基在一些情况下可优选在一端连接至[CON]基团和[CBT]基团且在另一端连接至[MULTICON]基团；或

根据以下结构的连接基：

其中q为整数0-12，优选1、2、3、4、5或6；且

q’为1至12，通常为1、2、3、4、5或6。

上述两个连接基可连接在一起以提供通常在本发明的化合物中使用的其它连接基：

其中q为整数0-12，优选0、1、2、3、4、5或6；

q’为1至12，通常为1、2、3、4、5或6；

iL为0或1；且

R_L为在本发明其它方面描述的氨基酸或寡肽(该术语包括二肽)，尤其包括赖氨酸、二赖氨酸或甘氨酸赖氨酸。

根据本发明另一连接基包括基于根据以下化学式的琥珀酰亚胺的连接基：

其中各X^S独立地为S、O或N-R^S，优选S；

R^S为H或C₁-₃烷基，优选H；

S_c为CH_2；CH₂O；或CH₂CH₂O；

i为0或1；且

m^S为0、1、2、3、4、5或6。

可用于本发明的其它连接基包括根据以下化学式的连接基：

其中Z和Z’各自独立地为键、-(CH₂)_i-O、-(CH₂)_i-S、-(CH₂)_i-N-R，

其中所述Z或Z’基团任选键合至另一连接基、连接体[CON]、[MULTICON]基团、IBT或CBT；

每个R为H，或C₁-C₃烷基或烷醇基；

每个R²独立地为H或C₁-C₃烷基；

每个Y独立地为键、O、S或N-R；

每个i独立地为0至100，优选1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，0、1、2、3、4或5；

D为

键，或D可为

或聚丙二醇或聚丙烯-共-聚乙二醇连接基，其具有1至100个二醇单元(1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或52和50，3和45)；

条件是Z、Z’和D各自不同时为键；

各i与上述相同；

j为1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；

m(在该背景中)为整数1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；且

n(在该背景中)为整数约1至100，约1至75，约1至60，约1至50，约1至45，约1至35，约1至25，约1至20，约1至15，2至10，约4至12，约5至10，约4至6，约1至8，约1至6，约1至5，约1至4，约1至3等)。

m’为1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；

m”为整数0至25，优选1至10，1至8，1、2、3、4、5或6；

n’为1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；

X¹为O，S或N-R；

R如上所述；

R_a为H、C₁-C₃烷基或烷醇或与R³形成环(脯氨酸)；且R³为衍生自氨基酸的侧链，该氨基酸优选选自丙氨酸(甲基)，精氨酸(亚丙基胍)，天冬酰胺(亚甲基羧基酰胺)，天冬氨酸(乙酸)，半胱氨酸(硫醇，还原或氧化的二硫醇)，谷氨酰胺(乙基羧基酰胺)，谷氨酸(丙酸)，甘氨酸(H)，组氨酸(亚甲基咪唑)，异亮氨酸(1-甲基丙烷)，亮氨酸(2-甲基丙烷)，赖氨酸(亚丁基胺)，蛋氨酸(乙基甲基硫醚)，苯丙氨酸(苄基)，脯氨酸(R³与R^a形成环，且与相邻的氮基团形成吡咯烷基)，羟基脯氨酸，丝氨酸(甲醇)，苏氨酸(乙醇，1-羟基乙烷)，色氨酸(亚甲基吲哚)，酪氨酸(亚甲基酚)或缬氨酸(异丙基)，或它们的可药用盐，其中所述氨基酸(通常为赖氨酸)的所述侧链任选连接。在某些实施方案中，该氨基酸可通过氨基酸的侧链连接。在某些实施方案中，该氨基酸通常为赖氨酸，这是由于其三官能度，其中侧链的胺用于连接其它连接基和/或分子的其它组分。应注意氨基酸具有三官能度且侧链用于产生连接基，该氨基酸(通常为赖氨酸)可在羧酸处被胺基封端，该胺基任选被C₁-C₁₂烷基，优选C₁-C₃烷基取代，或在胺末端被酰基封端。

应注意对于各连接基，本文所述的一个或多个连接基团可通过结合至一个或多个双官能连接体基团[CON]而延长，其将下文更详细描述。例如，聚乙二醇连接基(例如1至12个乙二醇单元，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)通过在本发明其它方面描述的一个或多个[CON]基团(包括酰胺[CON]基团)延伸至一个或多个聚乙二醇连接基(例如各连接基为1至12个乙二醇单元，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)，其代表本发明的其它实施方案。

如上所讨论，用于本发明的某些优选的连接基包括图2的化合物1、2或3所示的连接基，其通常将[CBT]部分连接至根据以下化学结构的[MULTICON]分子：

其中R_a为H或CH₃，最通常为H；

m为整数1至12，通常为1、2、3、4、5或6；

m”为整数1、2、3、4、5或6，通常为6；

t为0、1、2、3、4、5或6；且

iL为0或1，通常为1，其中L可任选在一端连接至[CON]基团和[CBT]基团且在在另一端连接至[MULTICON]基团；或

如上所述，或者，通常L为复合连接基(如图2的化合物3所示)，其由包含氧化乙烯的胺基和氨基酸(通常为赖氨酸)或氨基酸二肽(通常为二赖氨酸)构成，

所述包含氧化乙烯的胺基如下：

其中q为0至12，1、2、3、4、5或6；

q’为1至12，通常为1、2、3、4、5或6,

iL为0或1，其中该酮基连接至氨基酸基团或连接至寡肽(包括二肽)，且该胺基任选通过二酮基连接(通常连接至[IBT]，更通常为CP33),

其中q与上述相同。在优选方面，二肽的赖氨酸之一直接键合至CP33，且另一氨基酸(通常为赖氨酸)通过[CON]基团，最通常为三唑，将上述氧化乙烯胺基连接至[MULTICON]基团。上述复合连接基的化学结构可通过以下化学结构表示：

其中q为整数0-12，优选0、1、2、3、4、5或6；

q’为1至12，通常为1、2、3、4、5或6；

iL为0或1；且

R_L为在本发明其它方面描述的氨基酸或寡肽(该术语包括二肽)，尤其包括赖氨酸、二赖氨酸或甘氨酸赖氨酸。

在某些其它实施方案，该连接基L为氨基酸、二肽或包含1至12，优选1至6个氨基酸单体或更多的寡肽。在某些实施方案中，该寡肽为二肽且该二肽为二赖氨酸或甘氨酸赖氨酸二肽。当赖氨酸用作寡肽连接基中的氨基酸时，该侧链亚烷基胺通常用于连接分子中其它连接基或其它组分。

术语“多官能连接体”，由[MULTICON]表示，用于描述任选包含在根据本发明的嵌合化合物中的化学基团或分子，该嵌合化合物由活化的IBT-连接基与CBT部分(其也优选为活化的)或IBT部分与活化的连接基-CBT的反应产物形成，如在本发明其它方面描述。多种其它合成方法是可能的。用于合成根据本发明的化合物的合成化学在本文详细示出。该连接体基团为所得部分，其由包含可提供连接体基团的反应性基团的至少三个单独的化学片段的简易缩合形成(如本文另外所述)，以制备根据本发明的嵌合化合物。应注意多官能连接体部分或分子[MULTICON]易于与连接基区分，因为该多官能连接体是用于提供根据本发明的嵌合化合物的具体化学方法的结果。

本发明中的连接部分包括至少一个包含三个或更多个官能团的多官能部分或分子[MULTICON]，该三个或更多个官能团可用于共价结合(优选地，通过连接基)至至少一个[IBT]基团和至少一个[CBT]基团，从而将这些官能团的每一个连接为单一化合物。用于本发明的多官能连接体基团包括具有至少三个或更多个官能团的部分，该官能团可结合至与[IBT]和[CBT]基团结合的连接基以提供本发明的包含至少一个且优选多于一个[IBT]和[CBT]的化合物。这些多官能连接体部分也可结合至其它多官能连接体分子以产生包含多个本文定义的[IBT]和[CBT]基团的化合物。

多官能连接体分子[MULTICON]包括任何包含至少三个基团的分子或部分，该基团可连接至[IBT]和[CBT]基团、连接基和/或其它连接体基团(包括双官能和多官能连接体基团)的，且优选包括多官能、尤其是三官能或四官能芳基或杂芳基示例的5或6-元芳基或杂芳基(尤其6-元环基团)，包括苯基、吡啶基、嘧啶基、1,3,5-三嗪基、1,2,3-三嗪基、1,2,4-三嗪基，其每一个被至少3个且至多6个本文定义的官能团或其它基团取代。这些官能团可衍生自多官能连接体分子前体(形成本发明的最终化合物中的[MULTICON]部分的多官能连接体分子)上的亲核或亲电子基团，该前体与连接基(包含，例如[IBT]基团和[CBT]基团，该[IBT]基团和[CBT]基团包含可连接至[MULTICON]部分的基团)缩合。用于本发明的[MULTICON]基团优选包括取代的苯基、吡啶基、嘧啶基和1,3,5-三嗪基、1,2,3-三嗪基、1,2,4-三嗪基，尤其是根据以下化学结构的基团：

其中Y₄为C-H或N；且

各X”独立地衍生自亲电或亲核基团，优选(CH₂)_n”O、(CH₂)_n”N^RCON、(CH₂)_n”S、(CH₂)_n”或(CH₂)_n”C＝O，或当所述[MULTICON]基团为环结构，X”任选为[CON]基团，通常为三唑基团，其连接至环结构，通常直接连接至环结构；

该取代基RCON为H或C₁-C₃烷基，优选H或CH₃且

n”为0、1、2或3，且

r为整数1-12，通常为1、2、3、4、5或6。

术语“双官能连接体基团”或[CON]用于描述双官能团，其连接连接基的两个(或更多个)部分以延长连接基的长度。在某些实施方案中，连接基与另一连接基反应或与另一连接基形成[CON]基团以形成延长的连接基。这些基团的反应产物产生可识别的连接体基团[CON]，其与在本发明其它方面描述的连接基可区分。还应注意在双官能连接体基团的描述和连接基之间可能有一些重叠，尤其是关于在本发明其它方面描述的更通常的连接体基团如酰胺基、氧(醚)、硫(硫醚)或胺连接基、脲或碳酸酯–OC(O)O-基团。应注意下文使用的双官能连接体分子[CON]经常连接至连接基的两部分，该连接基将[IBT]和[CBT]连接至多官能连接体分子[MULTICON]。或者，[CON]基团可直接连接至[IBT]基团或更通常的[CBT]基团，以及本文所述的[MULTICON]基团。

用于本发明的通常的双官能连接体基团[CON](主要将连接基的一端连接至连接基的另一端以提供更长的连接基)包括以下化学基团：

其中X²为O、S、NR⁴、S(O)、S(O)₂、-S(O)₂O、-OS(O)₂或OS(O)₂O；

X³为O、S、NR⁴；且

R⁴为H、C₁-C₃烷基或烷醇基，或-C(O)(C₁-C₃)基团.

在实施方案中，[CON]通常为

基团；

其中CL为

CL中的m为整数0至12，通常为0、1、2、3、4、5或6；

且iL为0或1，通常为1；

在某些实施方案中，该[CON]基团通常通过三唑的胺连接至[MULTICON]的环结构。

如上文所讨论，应注意[ABT]和[CBT]官能团的每一个可进一步连接至化学部分，该化学部分结合两个或更多个上述连接体/多连接体基团成为更大的多官能连接体，从而提供在多官能化合物中包含多于一个[IBT]和[CBT]基团的复合多官能化合物。

术语“封端”或“封端的”用于描述非反应性化学部分，其结合至通常用作本发明的化合物的连接基的氨基酸中的游离羧酸基团或游离胺基。本发明中用于羧酸的优选的封端基团为胺基，其任选被C₁-C₁₂烷基，优选C₁-C₃烷基取代。通过与活性羧酸形成酰胺，该羧酸在本化合物中变为稳定的非反应性部分。在胺基的情况下，这些优选被酰基或尿烷基，优选酰基封端，以形成稳定的非反应性酰胺。

术语“酰基”用于描述根据以下化学结构的基团，其通常包含连接至酮基的C₁至C₂₀，通常为C₂至C₂₀的直链、支链或环状烷基链，从而与本发明的化合物中的游离胺形成非反应性酰胺。游离胺(通常为根据本发明的化合物中连接基使用的氨基酸)上的酰基导致稳定的非反应性酰胺(尽管该酰胺可在本发明的化合物给药后断裂)，从而在一些情况下，提供根据本发明的化合物的前药实施方案。根据本发明的酰基可通过以下结构表示：

其中R₄为C₁至C₂₀直链、支链或环状烷基，烷氧基烷基，芳基氧基烷基，如苯氧基甲基，芳基，烷氧基，等等。优选的酰基为其中R₄为C₁至C₁₀烷基的那些。根据本发明的酰基还包括，例如，衍生自苯甲酸和相关的酸的那些酰基，如取代的苯甲酸、琥珀酸、癸酸和己酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸基团，等等。本领域技术人员将理解在本发明有用的酰基，或者封端反应性胺基以制备没有反应性的、稳定的酰胺，或在某些实施方案中，作为根据本发明的化合物的前药形式。

术语“可药用盐”或“盐”在整个说明书中用于描述一种或多种本文所述组合物的盐形式，其用来增加化合物在盐水中的溶解度以用于肠胃外递送，或增加在患者胃肠道中的胃液的溶解度以促进化合物的溶解和生物利用度。可药用盐包括衍生自可药用无机或有机碱和酸的盐。合适的盐包括衍生自碱金属如钾和钠，碱土金属如钙、镁和铵的盐，以及衍生自药物领域众所周知的多种其它酸的盐。钠盐和钾盐可优选作为根据本发明的包含羧酸和游离酸磷酸的组合物的中和盐。术语“盐”应是指与根据本发明的化合物的用途一致的任何盐。在其中化合物用于药物适应症(包括治疗前列腺癌，包括转移性前列腺癌)的情况下，术语“盐”应是指与作为药物的化合物的用途一致的可药用盐。

术语“共同给药”是指至少两种化合物或组合物同时给药于患者，使得在给定时间点可在患者中发现有效量或浓度的两种或更多种化合物的每一种。尽管根据本发明的化合物可同时共同给药于患者，该术语包括同时或不同时给药两种或更多种药物，条件是在给定时间在受试者中发现有效浓度的所有共同给药的化合物或组合物。根据本发明的嵌合抗体-募集化合物可与一种或多种其他抗癌剂或用于治疗或改善癌症症状的其它药物一起给药，所述癌症尤其是前列腺癌，包括转移性前列腺癌。可与根据本发明的一种或多种嵌合化合物共同给药的示例性抗癌剂包括，例如，抗代谢物、拓扑异构酶I和II抑制剂、烷化剂和微管抑制剂(例如，紫杉酚)。用于本发明的具体抗癌化合物包括，例如，阿地白介素；阿仑单抗(aemtuzumab)；阿利维A酸；别嘌醇；六甲蜜胺；氨磷汀；阿那曲唑；三氧化二砷；门冬酰胺酶；活卡介苗(BCGLive)；贝沙罗汀胶囊；贝沙罗汀凝胶；博来霉素；白消安静脉剂型；白消安口服剂型；卡普睾酮；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；含聚苯丙生20的卡莫司汀植入剂(carmustinewithPolifeprosan20Implant)；塞来考昔；苯丁酸氮芥；顺铂；克拉屈滨；环磷酰胺；阿糖胞苷；阿糖胞苷脂质体；达卡巴嗪；更生霉素；放线菌素D；阿法达贝泊汀(Darbepoetinalfa)；柔红霉素脂质体；柔红霉素，道诺霉素；地尼白介素-毒素连接物(Denileukindiftitox)，右雷佐生；多西他赛；多柔比星；多柔比星脂质体；丙酸屈他雄酮(domostanolonepropionate)；Elliott'sB溶液；表柔比星；阿法依伯汀、雌莫司汀；磷酸依托泊苷；依托泊苷(VP-16)；依西美坦；非格司亭(flgrastim)；氟尿苷(动脉内)；氟达拉滨；氟尿嘧啶(5-FU)；氟维司群；吉妥珠单抗奥唑米星；乙酸戈舍瑞林；羟基脲；替伊莫单抗；伊达比星；异环磷酰胺；甲磺酸伊马替尼；干扰素α-2a；干扰素α-2b；伊立替康；来曲唑；甲酰四氢叶酸；左旋咪唑；洛莫司汀(CCNU)；二氯甲基二乙胺(氮芥)；乙酸甲地孕酮；美法仑(L-PAM)；疏基嘌呤(6-MP)；美司钠；甲氨蝶呤；甲氧沙林；丝裂霉素C；米托坦；米托蒽醌；苯丙酸诺龙；诺非单抗(nfetumomab)；LOddC；奥普瑞白介素(orelvekin)；奥沙利铂；紫杉醇；帕米膦酸盐(pamidronate)；培加酶；培门冬酶；聚乙二醇非格司亭；喷司他丁；哌泊溴烷；普卡霉素；光神霉素；卟吩姆钠；丙卡巴肼；喹纳克林；拉布立酶；利妥昔单抗；沙格司亭；链佐星；替比夫定(talbuvidine)(LDT)；滑石；他莫昔芬；替莫唑胺；替尼泊苷(VM-26)；睾内酪；硫鸟嘌呤(6-TG)；塞替派；拓扑替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲妥单抗；维甲酸(ATRA)；尿嘧啶氮芥；戊柔比星；伐托他滨(monovalLDC)；长春碱；长春瑞滨；唑来膦酸；及其混合物，等等。

除了抗癌剂，多种其它药物可与根据本发明的嵌合化合物共同给药以治疗癌症(尤其是前列腺癌，包括转移性前列腺癌)。这些药物包括活性剂、矿物质、维生素和营养补充剂，它们在抑制前列腺癌组织或其生长中已显示一些功效或在另外方面可用于治疗前列腺癌。例如，一种或多种食用硒、维生素E、番茄红素、大豆食品、维生素D、绿茶，ω-3脂肪酸和植物雌激素，包括β-谷固醇，可与本发明的化合物组合使用以治疗前列腺癌。

此外，与传统抗癌剂不同的活性剂已在治疗前列腺癌中显示一些应用性。该选择性雌激素受体调节剂药物托瑞米芬可与本发明化合物组合使用以治疗癌症(尤其是前列腺癌，包括转移性前列腺癌)。此外，阻断睾酮转化为二氢睾酮的两种药物非那雄胺和度他雄胺，当与本发明的化合物共同给药时也可治疗前列腺癌。植物化学物质吲哚-3-甲醇和二吲哚基甲烷，也可与本发明化合物共同给药以实现治疗前列腺癌。可与根据本发明的化合物组合的其它药物包括抗雄激素，例如，氟他胺，比卡鲁胺，尼鲁米特和乙酸环丙孕酮以及减少肾上腺雄激素(例如DHEA)产生的药物，如酮康唑和氨鲁米特。可与根据本发明的化合物组合的其它活性剂包括，例如，GnRH调节剂，包括激动剂和拮抗剂。GnRH拮抗剂直接抑制LH的产生，而GnRH激动剂在初始刺激作用后通过下调过程抑制LH。阿巴瑞克为GnRH拮抗剂的实例，而GnRH激动剂包括亮丙瑞林，戈舍瑞林，曲普瑞林和布舍瑞林，等等。这些药物可与根据本发明的化合物以有效量组合。此外，乙酸阿比特龙也可与根据本发明的一种或多种化合物组合以治疗前列腺癌，尤其包括转移性前列腺癌。

可与根据本发明的一种或多种化合物组合的其它药物包括二膦酸盐如唑来膦酸，其已显示延迟骨骼并发症如患有转移性前列腺癌的患者中发生的骨折。另一药物Alpharadin，可与根据本发明的化合物组合以靶向骨转移。此外，由于转移性前列腺癌引起的骨痛可用阿片样物质疼痛缓解剂如吗啡和羟考酮等治疗，它们可与本发明的化合物组合。

本发明优选涉及根据以下通式化学结构的化合物：

其中n和n’各自独立地为整数1至15，通常为2至10，通常为2至5，更通常为2或3；

NL1和NL2各自为整数0至10，通常为1至10，通常为2至5，更通常为2或3，条件是n≥NL1且n’≥NL2；

MCON为整数0至10，通常为1至10，更通常为1至5，通常为0，1或2；

[IBT]为根据图14所示化学式的免疫结合部分，优选地，[IBT]为根据以下化学结构的CP33基团：

[CBT]为根据以下化学式的细胞结合部分：

其中X₁和X₂各自独立地为CH₂、O、NH或S；

X₃为O、CH₂、NR¹、S(O)、S(O)₂、-S(O)₂O、-OS(O)₂或OS(O)₂O；

R¹为H、C₁-C₃烷基或-C(O)(C₁-C₃)基团；

k为整数0至20，8至12，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4、5或6；

L₁和L₂各自独立地为根据以下化学式的连接基：

其中R_a为H或C₁-C₃烷基，优选CH₃，最通常为H；

m为整数1至12，通常为1、2、3、4、5或6；

m”为整数1、2、3、4、5或6，通常为6；

t为0、1、2、3、4、5或6；且

iL为0或1，通常为1，其中所述连接基在一些情况下可优选在一端连接至[CON]基团和[CBT]基团且在另一端连接至[MULTICON]基团；或

根据以下结构的连接基：

其中q为整数0-12，优选1、2、3、4、5或6；

q’为1至12，通常为1、2、3、4、5或6，且

iL为0或1，优选1。

上述两个连接基可连接在一起以提供通常在本发明的化合物中使用的其它连接基：

其中q为整数0-12，优选0、1、2、3、4、5或6；

q’为1至12，通常为1、2、3、4、5或6；

iL为0或1；且

R_L为在本发明其它方面描述的氨基酸或寡肽(该术语包括二肽)，尤其包括赖氨酸、二赖氨酸或甘氨酸赖氨酸。

在某些其它实施方案，该连接基L为氨基酸、二肽或包含1至12，优选1至6个或更多个氨基酸单体的寡肽。在某些实施方案中，该寡肽为二肽且该二肽为二赖氨酸或甘氨酸赖氨酸二肽。当赖氨酸用作寡肽连接基中的氨基酸时，该侧链亚烷基胺通常用于连接分子中的其它连接基或其它组分。

在某些其它实施方案，该连接基L为以下基团

聚脯氨酸连接基

胶原连接基，

以下基团

或聚丙二醇或聚丙烯-共-聚乙二醇连接基，其具有1至100个二醇单元(1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或52和50、3和45)；

其中R_a为H、C₁-C₃烷基或烷醇或与R³形成环(脯氨酸)且R³为衍生自氨基酸的侧链，该氨基酸优选选自丙氨酸(甲基)，精氨酸(亚丙基胍)，天冬酰胺(亚甲基羧基酰胺)，天冬氨酸(乙酸)，半胱氨酸(硫醇，还原或氧化的二硫醇)，谷氨酰胺(乙基羧基酰胺)，谷氨酸(丙酸)，甘氨酸(H)，组氨酸(亚甲基咪唑)，异亮氨酸(1-甲基丙烷)，亮氨酸(2-甲基丙烷)，赖氨酸(亚丁基胺)，蛋氨酸(乙基甲基硫醚)，苯丙氨酸(苄基)，脯氨酸(R³与R_a形成环，且与相邻的氮基团形成吡咯烷基)，羟基脯氨酸，丝氨酸(甲醇)，苏氨酸(乙醇，1-羟基乙烷)，色氨酸(亚甲基吲哚)，酪氨酸(亚甲基酚)或缬氨酸(异丙基)；

m”为整数0至25，优选1至10，1至8，1、2、3、4、5或6；

m为整数1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；且

n为整数1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；或

L为根据以下化学式的连接基：

其中Z和Z’各自独立地为键、-(CH₂)_i-O、-(CH₂)_i-S、-(CH₂)_i-N-R，

其中所述-(CH₂)_i基团，如果存在于Z或Z’中，则结合至[MULTICON]、[ABT]、[CBT]或[TLR]或任选的双官能连接体基团[CON]，如果这些基团存在的话；

每个R独立地为H，或C₁-C₃烷基或烷醇基；

每个R²独立地为H或C₁-C₃烷基；

每个Y独立地为键、O、S或N-R；

每个i独立地为0至100，1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、

4或5；

D为

或键，或D可为

或具有1至100个二醇单元的聚丙二醇或聚丙烯-共-聚乙二醇连接基(1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或52和50，3和45)；

条件是Z、Z’和D各自不同时为键；

j为1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；

m(在该背景中)为整数1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；且

n(在该背景中)为整数约1至100，约1至75，约1至60，约1至50，约1至45，约1至35，约1至25，约1至20，约1至15，2至10，约4至12，约5至10，约4至6，约1至8，约1至6，约1至5，约1至4，约1至3等)。

m’为1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；

m”为整数0至25，优选1至10，1至8，1、2、3、4、5或6；

n’为1至100，1至75，1至60，1至55，1至50，1至45，1至40，2至35，3至30，1至15，1至10，1至8，1至6，1、2、3、4或5；

X¹为O，S或N-R；

R如上所述；

R_a为H、C₁-C₃烷基或烷醇或与R³形成环(脯氨酸)且R³为衍生自氨基酸的侧链，该氨基酸优选选自丙氨酸(甲基)，精氨酸(亚丙基胍)，天冬酰胺(亚甲基羧基酰胺)，天冬氨酸(乙酸)，半胱氨酸(硫醇，还原或氧化的二硫醇)，谷氨酰胺(乙基羧基酰胺)，谷氨酸(丙酸)，甘氨酸(H)，组氨酸(亚甲基咪唑)，异亮氨酸(1-甲基丙烷)，亮氨酸(2-甲基丙烷)，赖氨酸(亚丁基胺)，蛋氨酸(乙基甲基硫醚)，苯丙氨酸(苄基)，脯氨酸(R³与R_a形成环，且与相邻的氮基团形成吡咯烷基)，丝氨酸(甲醇)，苏氨酸(乙醇，1-羟基乙烷)，色氨酸(亚甲基吲哚)，酪氨酸(亚甲基酚)或缬氨酸(异丙基)。

[MULTICON]优选为根据以下化学结构的多官能连接体基团或分子：

其中Y₄为C-H或N；且

各X”独立地衍生自亲电或亲核基团，优选(CH₂)_n”O、(CH₂)_n”N^RCON、(CH₂)_n”S，(CH₂)_n”、(CH₂)_n”C＝O或[CON]基团；

该取代基RCON为H或C₁-C₃烷基，优选H或CH₃且

n”为0、1、2或3.

任选的双官能连接体基团或分子[CON]，如果存在的话，为根据以下化学结构的部分：

其中X²为O、S、NR⁴、S(O)、S(O)₂、-S(O)₂O、-OS(O)₂或OS(O)₂O；

X³为NR⁴、O或S；且

R⁴为H、C₁-C₃烷基或烷醇基，或-C(O)(C₁-C₃)基团；或

其可药用盐，溶剂合物或多晶形物。

在本发明优选方面，免疫结合末端[IBT]为CP33，如上所述。

在本发明优选方面，[CBT]为

其中k为整数0至20，1至20，1至8，2至6，3至5，3至4，1、2、3、4、5或6。

在某些优选的方面，该多官能连接体部分[MULTICON]为根据以下结构的1,3,5-三嗪基：

其中各X”独立地为O、S、C＝O或NR^CON,

且R^CON为H或CH₃，优选H。

在某些优选的方面，该化合物包含根据以下结构的双官能连接体部分[CON}：

基团，其可在与IBT基团或CBT基团共价连接，或者，优选结合至两个连接基以形成延长的连接基或直接连接至[IBT]或[CBT]基团。在某些其它优选的方面，该[CON]基团为

在某些实施方案中，[CON]通常为

基团；

其中CL为

CL中的m为整数0至12，通常为0、1、2、3、4、5或6；

且iL为0或1，通常为1；

在某些实施方案中，该[CON]基团通常通过三唑的胺连接至[MULTICON]的环结构。

在其它方面该连接基为以下结构的寡聚乙二醇或聚乙二醇部分：

其中m为1至100或在本发明其它方面描述的，优选1至12，2至10，4至8，2至6，8至12，2，3，4，5，6，7，8，9，1011或12。应注意在本发明化合物中聚丙二醇或聚乙二醇-共-聚丙二醇连接基(嵌段共聚物，其中嵌段的聚乙二醇部分长度为1至12个聚乙二醇单元，且所述嵌段的聚丙二醇部分长度为1至12聚丙二醇单元，嵌段共聚物单元的总数为1至100，1至50，1至25，1至15，1至12，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)可替代PEG基团。该基团也可连接至两个其它连接基以提供延长的连接基或直接连接至一个或两个官能团[IBT]和/或[CBT]。

根据本发明的优选化合物描述于附图2。基于这些化合物的其它优选的化合物优选消除图2中化合物的生物素部分(其作为这些示例化合物中的报道物存在)，其通过例如，将化合物1的[IBT]基团连接至氨基酸或二肽如甘氨酸或丙氨酸或甘氨酸丙氨酸以提供最终化合物，或如化合物2和3中，通过封端该赖氨酸基团(优选用胺封端羧基以形成酰胺，如本发明其它方面描述，或用酰基封端胺，也在本文描述)。

包含有效量的至少一种根据本发明的三官能嵌合化合物SyAM化合物，以及一种或多种在本发明其它方面描述的化合物(都为有效量)，以及药学有效量的载体、添加剂或赋形剂的组合的药物组合物，代表本发明另一方面。

本发明的组合物可以常规方式使用一种或多种药学上可接受的载体配制，并且也可以控释制剂形式施用。可在这些药物组合物中使用的药学上可接受的载体包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、诸如人血清白蛋白的血清蛋白、诸如磷酸盐的缓冲物质、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或诸如硫酸醇溶谷蛋白(prolaminesulfate)的电解质、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧基甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯/盐、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的组合物可口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道给药或经由植入式贮库给药。如本文所使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内(intra-synovial)、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，所述组合物经口服、腹膜内或静脉内给药。

本发明的组合物的注射用无菌形式可以为水性悬浮液或油性悬浮液。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制这些悬浮液。注射用无菌制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的注射用无菌溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂有水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)和等渗氯化钠溶液。另外，照惯例使用无菌的非挥发油作为溶剂或悬浮介质。为了此目的，可以使用任何温和的非挥发性油，其包括合成的甘油单酯和甘油二酯。诸如油酸的脂肪酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，天然的药学上可接受的油也可以，如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化的形式。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如Ph.Helv或类似的醇。

本发明的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型口服给药，所述剂型包括但不限于：胶囊、片剂、水性悬浮剂或溶液剂。在用于口服使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当需要将水性悬浮液用于口服使用时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合在一起。如有需要，还可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。

替代地，本发明的药物组合物可以用于直肠施用的栓剂形式施用。所述栓剂可通过将药剂与合适的无刺激性赋形剂混合在一起来制备，所述合适的无刺激性赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，并因此将在直肠内融化而释放出药物。此类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

本发明的药物组合物还可局部施用，尤其是用于治疗皮肤癌、牛皮癣或皮肤中或皮肤上出现的其它疾病。对于这些区域或器官中的每一个，容易制备合适的局部制剂。对于下肠道的局部应用可以以直肠栓剂制剂(见上文)或以合适的灌肠制剂实现。也可使用局部可接受的透皮贴剂。

对于局部应用，可以将药物组合物配制成含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性组分的合适的软膏。用于本发明化合物的局部施用的载体包括但不限于：矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。

替代地，可以将所述药物组合物配制成含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适的洗剂或乳膏。合适的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。

对于眼部使用，可以将所述药物组合物配制成在等渗的pH调节的无菌生理盐水中的微粒化悬浮剂，或优选地，配制成在等渗的pH调节的无菌生理盐水中的溶液剂，其可含有或不含防腐剂如苯扎氯铵。替代地，对于眼部使用，可以将所述药物组合物配制成乳膏如矿脂。

本发明药物组合物还可以通过鼻气雾剂或鼻吸入剂施用。此类组合物根据药物制剂领域熟知的技术制备，并且可使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物，和/或其他常规增溶剂或分散剂将其制备成在生理盐水中的溶液。

可与载体材料组合而产生单一剂型的本发明药物组合物中的化合物的量将随着所治疗的主体和疾病及具体施用途径而变化。优选地，所述组合物应被配制成含有介于约0.05毫克至约750毫克或更高之间，更优选约1毫克至约600毫克，甚至更优选约10毫克至约500毫克的活性成分，其单独或与至少一种其它非抗体吸引化合物(non-antibodyattractingcompound)组合，该非抗体吸引化合物可由于治疗癌症、前列腺癌或转移性前列腺癌或其继发性作用或病症。

还应理解，对于任何具体患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合，及治疗医生的判断和受治疗的具体疾病或病症的严重性。

患有癌症的患者或受试者(例如男性)可通过向患者(受试者)给药有效量的根据本发明的嵌合抗体募集化合物而治疗，该嵌合抗体募集化合物包括其可药用盐、溶剂合物或多晶形物，任选在可药用载体或稀释剂中，可以单独或与其它已知抗癌或药用试剂，优选可辅助治疗前列腺癌，包括转移性前列腺癌的药物或改善与前列腺癌相关的继发性作用和病症的药物组合。该治疗也可与其它常规癌症治疗，如放射治疗或外科手术一起给予。

这些化合物可通过任何合适的途径给予，例如，口服、肠胃外、静脉内、皮内、皮下或局部，以液体、乳膏、凝胶或固体形式，或通过气溶胶形式。

该活性化合物在可药用载体或稀释剂中的量足以向患者递送针对所需适应症的治疗有效量，而不在治疗患者中引起严重毒性作用。对本文所述所有病症的活性化合物的优选剂量范围为约每天10ng/kg至300mg/kg，优选每天0.1至100mg/kg，更通常每天0.5至约25mg/kg受试者体重/患者。在合适的载体中典型的局部剂量范围为0.01-3％wt/wt。

该化合物方便地以任何合适的单位剂型给药，包括但不限于以下单位剂型，其单位剂型包含少于1mg，1mg至3000mg，优选5至500mg活性成分。约25-250mg的口服剂量通常是方便的。

优选给药该活性成分以实现活性化合物的峰值血浆浓度为约0.00001-30mM，优选约0.1-30μM。这可通过例如，静脉注射活性成分的溶液或制剂，任选在盐水或水性介质中，或作为活性成分的推注给药而实现。口服给药也适合产生活性剂有效的血浆浓度。

药物组合物中活性化合物的浓度将取决于药物的吸收、分布、失活和排泄速率以及本领域技术人员已知的其它因素。应注意剂量值也将随着待改善的病症的严重性而改变。还应理解对于任何具体受试者，具体剂量方案应根据个体需求和给予或监管组合物给药的人的专业判断随时间而调节，且本文上述的浓度范围仅为示例性的且不应限制本发明组合物的范围或实践。活性成分可一次给予，或可分成多个较小的剂量在不同时间间隔给药。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体、它们可包封在明胶胶囊中或压制成片剂。出于口服治疗给药的目的，该活性化合物或其前药衍生物可与赋形剂掺合且以片剂、糖锭或胶囊形式使用。药学上相容的粘合剂和/或辅料材料可作为组合物的部分包含。

片剂、团块、胶囊、糖锭等可包含任何以下成分，或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，分散剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或矫味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。当剂量单位形式为胶囊，除了上述类型的物质，其可包含液体载体如脂肪油。此外，剂量单位形式可包含修饰剂量单位的物理形式的多种其它物质，例如，糖包衣、虫胶或肠溶试剂。

该活性化合物或其可药用盐可作为酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)、口香糖等的组分给药。糖浆除了活性化合物，还可包含蔗糖作为甜味剂以及一些防腐剂、染料和着色剂和香料。

该活性化合物或其可药用盐也可与其它不损害所需作用的活性物质混合，或与补充所需作用的物质混合，所述物质如其它抗癌剂、抗生素、抗真菌剂，抗炎剂或抗病毒化合物。在本发明某些优选的方面，一种或多种本发明的嵌合抗体-募集化合物与另一抗癌剂和/或另一生物活性剂共同给药，如在本发明其它方面描述。

用于肠胃外、皮内、皮下或局部施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节等渗性的试剂如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可封装在玻璃或塑料制备的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

如果静脉内给药，优选的载体为生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

在一个实施方案中，活性化合物与防止化合物在体内快速消除的载体一起制备，如控释制剂，包括植入剂和微囊化递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯和聚乳酸。制备该制剂的方法对本领域技术人员是明显的。

脂质体悬浮液也可为可药用载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，美国专利4,522,811所述的方法(其整体在此引入作为参考)。例如，脂质体制剂可通过以下制备，将合适的脂质(如硬脂基磷脂酰乙醇胺，硬脂基磷脂酰胆碱，花生四烯酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶于无机溶剂，然后蒸发，从而在容器表面得到干燥脂质的薄膜。然后将活性化合物的水溶液引入容器。该容器然后手动涡旋以从容器侧壁释放脂质物质，且分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。

设计化合物的基本原理

构造该SyAM-Ps的首要目标是设计一种能结合至FcγRI受体和PSMA二者的合适的双官能分子。我们推断将[CBT](即，PSMA结合基序)连接至IBT(即，FcγRI结合基序)可能会使双官能分子(SyAM-P1)模拟抗体-募集分子，因此能模拟细胞表面PSMA和FcγRI之间的三元复合物。

PSMA

PSMA为在前列腺癌细胞上高度表达(相比正常前列腺细胞)的细胞表面蛋白质。已开发了多种选择性结合PSMA且具有高亲和力的小分子配体，包括2-PMPA和谷氨酸脲。相应地选择[CBT](PSMA结合部分)且用于本发明。

对于免疫活化，我们选择Fc受体家族的靶向免疫活化成员，FcγRI，其在免疫系统的多种细胞上表达。具体地，FcγRI为负责引发针对抗体-调理的靶标的促炎响应的细胞表面免疫受体。该受体结合至IgG的Fc部分，且其在多种免疫细胞的表面表达，包括单核细胞和巨噬细胞。该受体的连接导致不同的促炎响应，其包括吞噬作用和活性氧簇生成。显示FcγRI结合基序多个拷贝的靶标，诱导受体交联和随后的信号转导，其导致促炎响应¹¹。最近，报告了能结合至Fc-γ家族中受体的肽^12,13,14。具体地，使用噬菌体展示发现了CP33，其为可结合至FcγRI的肽¹²。因此，本发明者优选使用CP33肽开发了SyAM的IBT部分以允许选择性募集和随后活化表达FcγRI的效应细胞。

因此，本发明者首先合成了SyAM-P1分子，其使用Fmoc固相肽合成方法以连接两部分(图2)。由于该化学合成，本发明者尝试确定是否连接该两部分会以选择性方式影响其结合它们各蛋白质靶标的能力(图3A,B)。本发明者随后评估了第一代SyAM-P分子(鉴定为SyAM-P1)结合RM1.PGLS细胞上的PSMA(图3A)或IIA1.6细胞上的FcγRI(图3B)的能力。这些实验使用用生物素功能化的SyAM-P1分子进行，且结合的SyAM-P1使用荧光标记的链亲和素通过流式细胞术检测。SyAM-P1证实了结合至其各自靶点的能力。

本发明者随后评估了SyAM-P1诱导三元复合物形成的能力，其使用表达可溶的PSMA和FcγRI的细胞(IIA1.6细胞)(图3c)。PSMA与细胞的结合使用藻红蛋白抗PSMA抗体探测，且使用流式细胞术分析。本发明者发现在IIA1.6细胞的表面表达的FcγRI和可溶的重组PSMA之间的三元复合物形成通过SyAM-P1介导。

总之，该数据清楚表明SyAM-P1可同时与FcγRI和PSMA相互作用，从而在细胞环境形成三元复合物。这种三元复合物的形成模拟抗体结合其靶蛋白和Fc受体的能力。这些结果作为用作其基础的一般结构设计和计算模型的关键校验。此外，将两个结合部分与疏水连接基连接不会抵消个体成分选择性结合至它们各自的配对物的能力。

SyAM-P1能选择性结合至PSMA和FcγRI，因此在显示PSMA的靶点和预处理的效应细胞之间形成三元复合物应诱导促炎响应。本发明者随后尝试确定SyAM-P1分子是否可交联FcγRI和通过免疫效应细胞诱导免疫应答。为此，为评估SyAM分子介导的促炎响应，本发明者分析了超氧化物爆发和免疫效应细胞的吞噬作用响应。(图3D,E)。本发明者使用永生的单核细胞效应细胞系(U937细胞)以评估SyAM-P1-介导的免疫效应物响应。937细胞用IFN-γ预处理，其诱导FcγRI上调且预处理该细胞以用于促炎响应(超氧化物爆发和吞噬作用)。超氧化物爆发的特征为释放活性氧簇(ROS)，其可在促炎响应中发生。该响应的大小可使用光泽精(lucigenin)测试测量。吞噬作用为调理的靶点的主动吞食。

使用的吞噬作用测试包括在SyAM-P1的存在下用Fl4染色的IFN-γ预处理的U937细胞培养PSMA标记的Fl1荧光珠子。吞噬作用通过流式细胞术和显微镜检查观察。该结果表明SyAM-P1能以剂量依赖性方式诱导超氧化物爆发(图3D)和PSMA涂覆的珠的吞噬作用(图3E)。特别是，SyAM-P1能以靶点依赖性方式在100nM和1μM的浓度诱导超氧化物爆发。在吞噬作用测试中，该化合物具有的EC₅₀为26nM。当该测试在PSMA抑制剂(2-PMPA)或FcγRI抑制剂(IgG)存在下进行时，以上鉴定的这些免疫效应响应被废除。(数据未显示)

这些结果证实三元复合物结合结果翻译为主动免疫应答。这些SyAM-P1的原理实验的证据支持以下假设，即完全合成的分子可诱导针对显示PSMA的靶点的FcγRI-依赖性免疫应答。抗体的靶向和效应物功能都可有效被完全合成的双官能分子模拟。

因为SyAM-P1能诱导效应细胞介导的对靶蛋白涂覆的珠的响应，本发明者然后评估了该分子是否可引发对表达PSMA的细胞的作用。为此，本发明者评估了SyAM-P1诱导的通过预处理的U937效应细胞的免疫应答(针对表达PSMA的RM1.PGLS细胞)。他们测试了U937-介导的免疫作用，其通过评估超氧化物爆发和效应细胞的吞噬作用二者，类似于蛋白质涂覆的珠子实验。在该实验中，IFN-γ预处理的U937细胞与表达PSMA的RM1.PGLS细胞一起培养，且用不同浓度的SyAM-P1处理。所得超氧化物爆发响应使用光泽精(lucigenin)测试测量(数据未显示)。此外，在不同浓度的SyAM-P1存在下预处理的U937细胞(用DiD，一种FL4膜染料染色)与靶RM1.PGLS细胞(用DiI，一种FL1膜染料染色)一起培养。所得吞噬作用–通过FL1和FL4双阳性细胞介导–使用双色流式细胞术测量。作为阳性对照，使用与抗-DNP抗体结合的ARM-P8。尽管ARM-P8能诱导显著的响应，但SyAM-P1不能诱导任何对靶细胞的免疫应答(数据未显示)。在Arm-P8对照中观察到阳性响应，这可能是由于抗体连接免疫效应细胞上FcyRI和FcyRIIA二者的能力，增加了免疫信号转导和吞噬作用响应。

由于SyAM-P1分子能诱导效应细胞-介导的针对用PSMA标记的珠子的吞噬作用，但不能对表达PSMA的细胞引起类似的响应，我们假设这可能是由于两种不同靶标每μm²表面面积不同水平的PSMA分子而造成的(图5)。这些结果提示本发明者将珠子表面的PSMA标记与RM1.PGLS细胞的那些进行比较。

靶细胞的调理水平与观察到的效应细胞介导的免疫应答成正比，且重要的是，在观察到任何响应之前必须实现阈值调理。SyAM-P1介导吞噬作用的能力使用装载不同量的PSMA的珠子评估。珠子被预处理的U937细胞的吞噬水平与表面显示的PSMA水平直接相关(图5)。在RM1.PGLS细胞表面表达PSMA的水平使用藻红蛋白抗PSMA抗体测量，且用藻红蛋白荧光校准珠子计算。RM1.PGLS细胞每μm显示比最低水平的测试珠子较少的PSMA蛋白(图5)。RM1.PGLS细胞显示约918PSMA蛋白/um²，而该测试使用的珠子显示约5577PSMA蛋白/um²。由于效应物应答和调理水平之间的直接相关性，靶细胞表面的PSMA表达水平不足以诱导SyAM-P1介导的响应。由于该表面的PSMA水平与SyAM-P1分子的功效直接相关，本发明者然后假设增加分子TBT区域的亲和力，通过二价展示，可能增加平衡时结合至具有PSMA的表面的SyAM-P1分子的量。本发明者推测：通过增加PSMA结合部分的局部浓度，表观Kd将增加，这将增强有效浓度范围和增加平衡时显示的分子水平。

根据该假设，SyAM-P分子重新设计为掺入二价展示的靶向基序以增强其功效(SyAM-P2)(图2，化合物2)。首先，他们验证了结合且比较了SyAM-P2至PSMA涂覆的珠子的亲和力。随后，评估了SyAM-P2介导的预处理的U937细胞对PSMA涂覆的珠子的免疫应答(图4A)。最后，本发明者测试了SyAM-P2对其在预处理的U937细胞中(相对RM1.PGLS细胞)诱导超氧化物爆发响应或吞噬作用响应的能力的作用(数据未显示)。SyAM-P1至PSMA涂覆的珠子的结合(EC₅₀＝40nM)不如SyAM-P2(EC₅₀＝26nM)的有效。

相比SyAM-P1，SyAM-P2能诱导高得多的PSMA涂覆的珠子的吞噬水平(SI图2A)，且具有更宽的功效范围。受这些结果的鼓舞，本发明者继续评估SyAM-P2介导针对RM1.PGLS细胞的免疫作用的能力。不幸地是，超氧化物爆发或吞噬作用都没有观察到响应(数据未显示)。然而，增加结合基序的展示，直接增加超氧化物爆发响应和对PSMA涂覆的珠子的吞噬作用水平。这证实了以下假设，即增加PSMA结合侧的效价将增加表观Kd(SI图4)。在细胞存在下FcγRI被SyAM-P2连接的水平，仍然不足以诱导有利的临床相关的免疫应答(针对表达PSMA的细胞)。

本发明者还在该第二代分子中研究了连接基长度和组成，当使用SyAM-P2中展示的氨基己酸连接基时其显示最稳健的结果(SI图3)。第二代SyAM分子增加了PSMA-珠子实验的功效，但仍然证实不能诱导对RM1.PGLS细胞的有利的响应。本发明者假设这是由于Fc受体不足的交联。出于该考虑，本发明者通过二价展示的PSMA靶向基序和FcγRI靶向基序二者优化了SyAM-P2以增强其功效；该分子称为SyAM-P3(图1、3)。

本发明者然后测试了SyAM-P3-诱导的对PSMA涂覆的珠子的免疫作用(即，U937介导的超氧化物爆发和吞噬作用)(图4A和B)。相比SyAM-P2，在超氧化物爆发产生(图4A)和吞噬作用(图4b)二者中，SyAM-P3能诱导对PSMA-珠子高得多的免疫应答；该响应在吞噬作用效能和有效范围方面都更大。在对照实验，显示超氧化物爆发依赖于分子和珠子的PSMA标记二者的存在(SI图6)。在2-PMPA和人IgG中都可完成珠子的吞噬(SI图5)。最后，本发明者还评估了SyAM-P3对促进U937介导的表达PSMA的RM1.PGLS细胞的吞噬作用的功效(图4C)。在该情况下，针对RM1.PGLS细胞，SyAM-P3能以剂量依赖性方式有效诱导U937介导的吞噬作用(图4C)。本发明者能目测验证RM1.PGLS细胞的吞噬作用，其使用具有图象采集能力的流式细胞术(Amnis)(图4D)。使用该方法，本发明者显现了形成吞噬杯的早期吞噬作用，以及完全吞噬的RM1.PGLS的晚期。2-PMPA和人IgG都可完成该吞噬作用(SI图7)。在超氧化物爆发测试中SyAM-P3和RM1.PGLS细胞都未观察到响应。

基于三元复合物模型，[ref](SI图4B)增加FcγRI连接基序的数量，增强了SyAM-P分子引发对PSMA涂覆的珠子的靶向的免疫应答的效力和功效。SyAM-P3有效刺激表达PSMA的细胞的免疫效应细胞介导的吞噬作用。SyAM-P3的响应在10nM分子浓度达到峰值，其为从使用ARM-P8和抗-DNP抗体观察到的最大响应峰的位移(SI图8)。三元复合物平衡最大值中的该位移显示我们的分子可在比ARM-P8分子更好的数量级浓度诱导免疫应答。

讨论

本申请讨论的化合物是独特的，因为它们是最早报告的能以高度具体方式直接模拟单克隆抗体通过FcγRI诱导免疫应答的能力的完全合成性分子。由于本发明的SyAMs为能通过直接结合至免疫细胞引发免疫应答的合成性分子，它们可不依赖内源性抗体而介导其功能，不同于ARM分子^8b，c。本发明的SyAM分子通过单一激活受体，FcγRI起作用，限制与免疫系统其它方面的交叉反应。该分子对FcγRI的特异性防止抑制性FcγRIIb的交叉连接，所述交叉连接已涉及体内降低mAbs的功效。通过选择性靶向受体的Fc家族，存在交叉呈递抗原序列和引发进一步的适应性免疫应答的潜能。该SyAMs具体解决了mAbs的不利方面，如缺少化学均一性、限制的病原体靶标范围、损害Fc响应的补体沉积的活化¹⁵，和预测体外作用机理的困难。

除了易于合成和纯化，本发明的骨架和会聚合成使其本身快速修饰。这允许我们快速添加其它TBTs，从而扩大了该方法实用性的范围。更广泛的，使用小分子重新定向免疫细胞的细胞毒性功能的一般策略具有在宽范围的病理生理不相关的人疾病，如病毒和细菌感染中应用的潜能。

化学合成

根据本发明的化合物的化学合成分步进行，其通过制备多种组分的构造嵌段，然后将这些构造嵌段彼此缩合以得到根据本发明的化合物。尽管本专利申请鉴定的化合物的具体合成以分步方式用单独的组分进行，使用的多种替代方式可易于使用类似化学方法被其它组分代替以合成本发明所有化合物。以下合成方案为用于制备根据本发明的化合物的化学方法的实例。该化学方法可直接使用或以类似方式使用以制备本发明所有化合物。

SyAM-P1(具有生物素)

该化合物根据图15所示的化学合成方案合成以提供图16的SyAM-P1。根据图15所示的方案，在抗坏血酸钠、硫酸铜、水、叔丁醇中在升高的温度在微波中将包含叠氮基的三酯脲CBT基团(在下文的SyAM-P3的反应方案中示出)与炔属己炔酸反应以形成共价连接至[CBT]的三唑[CON]基团。然后该中间体的游离羧酸基团转化为酰基氯衍生物，其在DIPEA中与赖氨酸尿烷衍生物反应以形成包含尿烷部分的CBT-赖氨酸中间体。固相肽合成将甘氨酸基团置于赖氨酸的羧酸基上，且胺基被脱保护且用包含氨基己酸单元的肽连接基取代(图2显示5个氨基己酸单元)。该中间体进一步与CP33-连接的赖氨酸基团(如果需要生物素连接)或CP33-氨基酸(丙氨酸或甘氨酸)反应以将CP33基团连接至CBT部分分子(不含生物素连接)。或者，该CP33基团可连接至另一氨基酸、寡肽，包括二肽(如甘氨酸丙氨酸、甘氨酸甘氨酸或丙氨酸丙氨酸，以及多种其它组合)以提供SyAM-P1分子。

SyAM-P2

SyAM-P2的合成根据图17所示的反应方案进行。根据该合成，在赖氨酸侧链包含叠氮基的三酯嵌段的谷氨酸-赖氨酸二肽与包含炔属基团的氨基封端的聚乙二醇反应以形成具有游离胺的中间体CBT复合物(图17的s-2)。该游离胺与[MULTICON]部分(图17的s-3)反应以将两个CBT基团缩合至[MULTICON]部分S-3，如步骤b所示。所得中间体包含两个CBT基团，一个连接基将X-2的[CON]基团连接至[MULTICON]基团(s-3)以提供中间体S-4(其可随着连接至三唑[CON]基团的连接基上的取代基而变化)，其可与中间体2-7缩合，该中间体2-7包含连接至二肽或寡肽的CP33基团。该二肽或寡肽可被封端以提供非反应性基团或进一步反应以提供生物素部分以用于诊断/实验应用。图17中S-7通过丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸三肽连接CP33，其中远端赖氨酸的侧链结合至生物素部分，但可易于进行S-7的修饰。或者，不含生物素的SyAM-P2可简单地具有被非反应性基团(例如酰胺)封端的第一赖氨酸，而非将化合物延长至另一连接生物素部分的赖氨酸。在图17的化学合成中，该[IBT]基团(包含CP33的中间体S-7)缩合至中间体s-4的活化酯以将包含CP33的组分连接至[MULTICON]基团，该[MULTICON]基团连接两个CBT连接基(s-2)。这导致最终产物SyAM-P2，其可包含生物素基团或其它报道物组分以用于诊断/分析或可避免存在报道物组分以用作治疗剂以治疗前列腺癌，如在本发明其它方面描述。

SyAM-P3(不含生物素)

其为本发明的优选化合物。该化合物具有两个CBT基团和两个IBT基团，它们通过中心{MULTICON]三官能1,3,5-苯基连接。该化合物的合成起始于根据图17所示的化学合成方案制备优选的CBT基团(在脲形成的标题下)。该二酯保护的谷氨酸类似物首先与三光气反应，然后与二保护的赖氨酸化合物(α-氨基保持未保护)反应以形成四保护的中间体，其被氢化(pd/C)以去除赖氨酸的侧链胺位置的Cbz保护基，将其使用TfN₃、硫酸铜和碳酸钾转化为叠氮基部分以形成包含叠氮基部分的三保护的脲。该化合物为大多数本发明化合物的合成中使用的CBT合成子，因为叠氮基可与炔属基团缩合以容易形成三唑[CON]基团，该三唑[CON]基团直接结合至根据本发明的化合物中的优选的[CBT]部分。

在同样图17，非天然的氨基连接基从合成的二保护的氨基酸化合物制备，其通过在强酸在二噁烷中去除保护胺功能的Boc基团，然后在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)中将胺保护的氨基酸缩合至胺-脱保护氨基酸的游离氨基以提供苄基保护的三肽。然后将所得三肽的末端胺基保护(Fmoc)且将苄基使用氢化条件脱保护以得到N-末端保护的连接基三肽。其为第一连接基。

第二连接基通过在EDC、HOBt和DIPEA的存在下将炔属胺基缩合至二-N保护的(Fmoc)赖氨酸化合物的游离羧酸基团而合成。所得炔属保护的赖氨酸化合物然后脱保护且与上述获得的胺保护的第一连接基反应以形成二连接基取代的炔属赖氨酸中间体，其被脱保护(在二乙基胺中去除两个Fmoc基团)且随后与叠氮基二羧酸苯类似物缩合。该苯类似物(其成为[MULTICON]基团)然后在EDC、HOBt、DIPEA中与苄基-保护的三肽连接基反应以形成包含两个三肽连接基的苯基叠氮化物。上述制备的叠氮基-封端的脲部分[CBT]与炔属胺化合物缩合以在具有亚甲基胺基的叠氮基位置形成三唑[CON]基团。该中间体与胺保护的三肽连接基反应以将三肽连接基缩合至三唑部分的游离胺基。三肽连接基的胺端上的保护基(Fmoc)用二乙基胺去除。该中间体然后缩合至二连接基叠氮基苯基[MULTICON]中间体以提供已缩合至叠氮基苯基[MULTICON]中间体的两个CBT连接基。苯基中间体上的叠氮基缩合至以上制备的第二连接基的炔属部分，以形成三唑基团作为苯基[MULTICON]部分上的第三基团。该中间体在苯基[MULTICON]部分上包含两个CBT-连接基且在[MULTICON]部分上包含三唑[CON]部分。该三唑[CON]部分还包含两个通过赖氨酸连接且用胺基封端的游离胺-三乙二醇连接基，其可与CP33缩合以制备最终SyAM-P3化合物。

因此，制备CP33以用于缩合至两个游离胺基，其通过将制备CBT脲基团中使用的二-嵌段的赖氨酸中间体与CP33的游离羧酸末端反应以形成赖氨酸反应的CP33中间体进行，该中间体经历胺化以形成具有赖氨酸基团的未反应的羧酸基团的游离酰胺。CP33-赖氨酸中间体上的赖氨酸的游离胺与二琥珀酰亚胺基二酮连接基前体反应以形成包含琥珀酰亚胺基(作为离去基团)的CP33-赖氨酸连接的中间体。这些CP33-赖氨酸连接的中间体中的两个缩合至之前制备的包含所述两个CBT基团的中间体，该两个CBT基团通过[MULTICON]苯基连接且包含两个游离胺基，其易于缩合至包含琥珀酰亚胺基-活化的酯基的CP33-赖氨酸连接的中间体以形成图23所示的最终化合物SyAM-P3。

合成根据本发明的化合物的替代方法描述于图24。图24显示SyAM-P2的替代合成，其可使用图中所示的替代连接基适用于根据本发明的其它化合物。所有反应是直接的且得到多种化合物，可以看出这些化合物随着所用的连接基而改变。

实施例

一般信息

合成：所有起始材料和试剂购自可商购的来源且不用进一步纯化而使用。¹HNMR位移使用溶剂残余峰作为内标测量(CDCl₃d7.26，MeODd3.31)，且报告如下：化学位移，多重性(s＝单峰，bs＝宽单峰，d＝双峰，t＝三重峰，dd＝双双峰，dt＝双三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰)，偶合常数(Hz)，积分。¹³CNMR位移使用溶剂残余峰作为内标测量(CDCl₃d77.20，MeODd49.00，或DMSOd39.52)，且报告为化学位移。红外(IR)光谱带表征为宽(br)、强(s)、中(m)和弱(w)。

缩写

AcOH＝乙酸

Acn＝乙腈

Ahx＝氨基己酸

AMC＝7-氨基-4-甲基香豆素

Boc＝叔丁氧基羰基

BSA＝牛血清白蛋白

Cbz＝苄基氧基羰基

DCM＝二氯甲烷

DIPEA＝二异丙基乙基胺

DMF＝N,N-二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲基亚砜

DPBS＝Dulbecco磷酸盐-缓冲盐水

EDC＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺

EDTA＝乙二胺四乙酸，二钠盐

EGTA＝乙二醇-二(2-氨基乙基)-N,N,N’,N’-四乙酸

EtOAc＝乙酸乙酯

Fmoc＝9-芴基甲基氧基羰基

HI-FBS＝热灭活的胎牛血清

HOBt＝羟基苯并三唑

iPrOH＝异丙醇

MeCN＝乙腈

MeOH＝甲醇

MTT＝甲基-三苯甲基

NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺

NMP＝N-甲基吡咯烷酮

Pbf＝2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

Pd/C＝10％钯/碳

Quant.＝定量转化

TBS＝Tris-缓冲盐水

Tbu＝叔丁基

TEA＝三乙胺

TFA＝三氟乙酸

TFAA＝三氟乙酸酐

THF＝四氢呋喃

TiPS＝三异丙基硅烷

Trt＝三苯甲基

固相肽合成的一般步骤：

固相肽合成(SPPS)在CEMDiscoverLiberty微波肽合成仪中进行。合成中使用的树脂、氨基酸和试剂的量使用制造商建议的方案基于0.1mmol规模的合成计算。完成SPPS后，通过真空过滤收集树脂且用CH₂Cl₂清洗多次。风干后，将树脂添加至包含任一断裂混合物(cocktail)(TFA：TIPS：H₂O的92：4：4混合物)的烧瓶中且轻微搅拌下文指明的时间。随后，将树脂通过塞了棉花的移液管过滤，且将滤液直接收集至包含35mL冷(-78℃)Et₂O的50mL圆锥管中，此时立即形成白色沉淀。将悬浮液再冷却至-78℃，然后在4400rpm离心5分钟。倾析上清液后，残余团块倒入50％MeCN/H₂O且使用反相HPLC分6-7份纯化。合并HPLC级分且冻干得到相应的肽，其为白色蓬松状物质。

合成

5-(1-((R)-6-(叔丁氧基)-5-(3-((S)-1,5-二叔丁氧基-1,5-二氧代戊-2-基)脲基)-6-氧代己基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)戊酸

在5mL微波反应管中将S.1(98mg，0.191mmol，1.0当量)和庚炔酸(120mg，0.954mmol，5当量)的混合物溶于H₂O(1.25mL)和叔丁醇(1.25mL)的混合物中。向该混合物添加0.1M抗坏血酸钠(0.059mmol，0.2当量)和0.1M硫酸铜(II)(0.012mmol，0.04当量)。将管封盖，且在110℃进行微波照射10分钟。然后将反应混合物在减压下浓缩，且进行色谱纯化(1x15cm硅胶，在CHCl₃中的20％MeOH，然后在CHCl₃中的20％MeOH+1％TFA)，得到s-x，其为无色油状物，C₃₁H₅₃N₅O₉的计算值(M+H)640.7806实测值

SyAM-P1

Fmoc-VNS(Tbu)C(Trt)LLLPN(Trt)LLGC(Trt)GD(Tbu)D(Tbu)K(生物素)-Ahx₅-Lys(MTT)-G-树脂的0.1mmol规模的标准固相肽合成。树脂Mtt基团使用DCM5mL中的1％TFA脱保护，同时在旋转器上保持5分钟，重复三次，洗掉黄色上清液。中和的树脂用DMF0.1mMDIPEA洗涤。将Sx(160mg，0.25mmol，2.5当量)溶于3mLDMF且与HBTU(95mg，0.25mmol，2.5当量)和86uLDIPEA(64mg，5mmol，5eq)一起添加至树脂。将混合物在75℃进行微波照射10分钟。树脂用DMF清洗3x且Fmoc基团在室温用DMF中的20％哌啶脱保护20分钟。在室温在搅拌下整体脱保护且用TFA：H₂O：TIPS的92：4：4混合物从固体载体(support)断裂90分钟。随后，通过塞了棉花的移液管过滤树脂，且滤液直接在包含35mL冷(-78℃)Et2O的50mL圆锥管中收集，此时立即形成白色沉淀。将悬浮液再冷却至-78℃，然后在4400rpm离心5分钟。倾析上清液后，残余团块倒入25mL20％ACN/H₂O，且加入1mLDMSO和40mg碳酸钾，且在空气中搅拌48小时以氧化为二硫化物。氧化后，使用反相HPLC纯化肽。

HRMS(ES+)C₁₄₂H₂₃₈N₃₆O₄₁S₃(M+3H)m/z的计算值1601.91实测值(M+3H)1601.53

(S)-2-(3-((S)-6-(4-(25-氨基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己-2-基)脲基)戊二酸二叔丁基酯(s-2)

在5mL微波反应管中将s-1(152mg，0.295mmol，1.0当量)和3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-26-炔-1-胺(120mg，0.295mmol，1.0当量)的混合物溶于H₂O(1.1mL)和叔丁醇(1.1mL)的混合物中。向该混合物添加0.1M抗坏血酸钠(0.6mL，0.2当量)和0.1M硫酸铜(II)(0.12mL，0.04当量)。将管封盖，且在110℃进行微波照射2.5分钟。然后将反应混合物在减压下浓缩，且进行色谱纯化(1x15cm硅胶，CH₂Cl₂中的10％MeOH，然后CH₂Cl₂中的10％MeOH+2.5％Et₃N)，得到s-2(254mg，80％)，其为棕色油状物。IR(薄膜)2869(m)，1729(s)，1680(w)，1534(m)，1456(w)，1367(m)，1252(w)，1152(s)，1113(s)cm-1.1HNMR(400MHz，CDCl3)d7.71(s，1H)，5.32(d，J＝8Hz，1H)，5.25(d，J＝8Hz，1H)，4.72-4.64(dd，J＝8Hz，XXHz，2H)，4.38-4.28(m，4H)，3.68-3.64(m，30H)，2.98-2.93(m，2H)，2.35-2.28(m，2H)，2.08-2.05(m，1H)，1.97-1.77(m，4H)，1.65-1.59(m，1H)，1.46(s，9H)，1.43(s，18H)，1.49-1.27(m，2H).13CNMR(100MHz，CDCl3)d172.5，172.1，156.9，145.0，123.0，81.9，81.9，90.5，70.6，70.5，70.5，70.5，70.4，70.4，70.4，70.2，69.6，64.6，53.1，53.0，49.9，32.3，31.7，29.6，28.3，28.1，28.1，28.0，21.9.HRMS(ES+)C₄₃H₈₀N₆O₁₅的计算值(M+H)m/z921.5754实测值921.5754。

5-(4-(5-甲氧基-5-氧代戊基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)间苯二甲酸(s-3)

在5mL微波反应管中将叠氮基间苯二甲酸(100mg，0.483mmol，1.0当量)和庚-6-炔酸甲酯(100mg，0.714mmol，1.45当量)的混合物溶于H₂O(1.7mL)和叔丁醇(1.7mL)的混合物。向该混合物添加0.1M抗坏血酸钠(0.059mmol，0.2当量)和0.1M硫酸铜(II)(0.012mmol，0.04当量)。将管封盖，且在110℃进行微波照射2.5分钟。然后将反应混合物在减压下浓缩，且进行色谱纯化(1x15cm硅胶，在CHCl₃中的20％MeOH，然后在CHCl₃中的20％MeOH+1％TFA)，得到s-3，其为米色固体。IR(薄膜)3151(w)，2951(w)，1721(s)，1604(w)，1463(w)，1291(m)，1248(m)，1071(m)cm-1.1HNMR(400MHz，MeOD)d8.70(s，1H)，8.66(s，2H)，8.51(s，1H)，3.66(s，3H)，2.83(t，J＝7.4Hz，2H)，2.41(t，J＝6.8Hz，2H)，1.81-1.70(m，4H).13CNMR(100MHz，DMSO-d₆)d173.3，165.9，148.3，137.2，133.5，129.1，123.7，120.6，118.0，51.2，33.0，27.9，24.7，24.0.HRMS(ES+)C₁₆H₁₇N₃O₆的计算值(M+H)m/z348.1190实测值348.1184。

s-4

在火焰干燥的圆底烧瓶中向s-3(20mg，0.06mmol，1当量)在1mL无水CH₂Cl₂中的溶液中添加EDC(29mg，0.15mmol，2.5当量)和HOBt(23mg，0.15mmol，2.5当量)，然后添加s-2(122mg，0.133mmol，2.2当量)在1mL无水CH₂Cl₂中的溶液和吡啶(15μL，0.181mmol，3当量)。将反应混合物在室温搅拌13小时，然后将其在37℃在减压下浓缩且进行色谱纯化(硅胶，2x15cm，CHCl₃中的5％MeOH)，得到s-4，其为浅棕色油状物(90mg，73％)。IR(薄膜)2867(w)，2405(br)，1728(s)，1661(m)，1456(s)，1367(m)，1250(w)，1149(s)，1098(s)，846(w)cm-1.1HNMR(500MHz，MeOD)d8.50(s，1H)，8.50(s，1H)，8.42(t，J＝1.5Hz，1H)，7.96(s，2H)，6.36-6.33(dd，J＝4，4.5Hz，3H)，4.60(s，4H)，4.40(t，J＝7.5Hz，4H)，4.22-4.11(m，4H)，3.70(t，J＝5.5Hz，4H)，3.67-3.54(m，66H)，2.83(t，J＝7Hz，2H)，2.40(t，J＝7Hz，2H)，2.37-2.27(m，4H)，2.07-2.00(m，2H)，1.96-1.89(m，4H)，1.84-1.70(m，8H)，1.69-1.61(m，2H)，1.47(s，19H)，1.44(s，21H)，1.41(s，17H)，1.40-1.34(m，4H).13CNMR(100MHz，MeOD)d175.6，173.7，173,6，173.4，167.9，159.9，150.1，146.0，138.7，138.0，127.4，125.0，122.8，121.8，82.8，82.6，81.7，71.6，71.6，71.5，71.3，70.8，70.4，65.0，54.7，54.1，52.1，51.1，41.3，34.4，32.9，32.5，30.8，29.8，29.0，28.4，28.3，26.0，23.5.HRMS(ES+)C₁₀₂H₁₇₃N₁₅O₃₄的计算值(M+H)2153.2369实测值(M+2H)m/z1077.1271。

s-5

将s-4(90mg，0.042mmol，1当量)溶于MeOH(1mL)。向该溶液添加H₂O中的1MLiOH(4当量)。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后添加另外4当量的1MLiOH水溶液。将反应混合物在室温再搅拌2小时，然后将其用6当量1MHCl水溶液中和。将反应混合物浓缩且进行色谱纯化(1x15cm硅胶，在CHCl₃中的20％MeOH)。将包含产物的级分浓缩且用80％MeCN水溶液吸收，并用HPLC纯化(C18反相，5mL/min，50％-75％MeCN水溶液，经40分钟)。将产物分离且冻干，得到s-5，其为白色粉末(10mg，12％)。IR(薄膜)3341(br)，3108(w)，2931(m)，1729(s)，1667(s)，1556(w)，1457(w)，1151(s)cm-1.1HNMR(500MHz，MeOD)d8.73(t，J＝5.5Hz，1H)，8.51(s，3H)，8.42(s，1H)，7.97(s，2H)，4.64(s，1H)，4.60(s，4H)，4.41(t，J＝7.2Hz，4H)，4.18(dd，J＝5，9Hz，2H)，4.13(dd，J＝5，8Hz，2H)，4.06(s，1H)，4.01(s，1H)，3.99-3.96(m，1H)，3.74-3.55(m，80H)，3.48-3.44(m，1H)，3.17-3.13(m，1H)，2.84(t，J＝7.2Hz，2H)，2.66(s，1H)，2.39-2.29(m，6H)，2.07-2.00(m，2H)，1.96-1.89(m，4H)，1.84-1.76(m，6H)，1.75-1.70(m，2H)，1.69-1.61(m，2H)，1.60-1.52(m，2H)，1.48-1.41(m，4H)，1.47(s，18H)，1.44(s，18H)，1.43(s，18H)，1.40-1.30(m，6H).13CNMR(125MHz，MeOD)d177.2，173.7，173.7，173.4，168.0，159.9，138.8，138.0，127.4，125.0，122.7，121.8，82.8，81.8，71.5，71.4，71.4，71.4，71.3，70.7，70.5，65.0，54.7，54.2，41.3，34.6，32.9，32.5，30.8，29.8，29.0，28.4，28.3，26.1，25.5，23.5.HRMS(ES+)C₁₀₁H₁₇₁N₁₅O₃₄的计算值(M+H)m/z2139.2213实测值(M+2H)m/z1070.1426。

cp33-二(Peg8-脲)

将s-5(45mg，0.021mmol，1.0当量)溶于CH₂Cl₂。相继添加EDC、HOBt和N-羟基琥珀酰亚胺，然后添加DIPEA，且将反应混合物在室温搅拌6小时，然后通过LCMS观察转化。将反应混合物浓缩，且添加95％TFA、2.5％PBS、2.5％TIPS的混合物。将反应混合物搅拌30分钟，然后将其浓缩。立即向烧瓶添加1mLPBS和1.5mL饱和碳酸氢钠溶液，然后添加cp33肽(16mg，0.007mmol，0.3当量)。将反应混合物在室温搅拌12小时，随后通过HPLC纯化(C18反相，5mL/min，30％-42％MeCN水溶液，经66分钟)。将包含产物的级分收集且冻干，得到白色粉末(1.2mg，11.2％)。

(S)-2-(3-((S)-6-(4-(1-(9H-芴-9-基)-3,31-二氧代-2,7,10,13,16,19,22,25,28,35,38,41,44,47,50,53,56-十七氧杂-4,32-二氮杂五十七烷-57-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己-2-基)脲基)戊二酸二叔丁基酯(s-6)

在火焰干燥的烧瓶中将s-2(90mg，0.135mmol，1当量)溶于1mL无水CH₂Cl₂，且相继添加EDC^.HCl(29mg，0.15mmol，1.1当量)和HOBt^.H2O(23mg，0.15mmol，1.1当量)，然后添加Fmoc-N-酰胺基-dPEG8-酸(QuantaBiodesignLtd.138mg，0.15mmol，1.1当量)在1mL无水CH₂Cl₂中的溶液和DIPEA(28μL，0.162mmol，1.2当量)。将反应混合物搅拌2.5小时，然后添加1mLMeOH。然后将反应混合物在减压下浓缩且进行色谱纯化(硅胶，1x15cm，CHCl₃中的2.5％MeOH，然后CHCl₃中的5％MeOH，然后CHCl₃中的10％MeOH)，得到s-6，其为澄清油状物(149mg，70％)。IR(薄膜)3332(br)，2868(m)，1727(m)，1672(w)，1547(m)，1451(w)，1367(w)，1251(m)，1149(s)，1110(s)cm-1.1HNMR(500MHz，CDCl3)d7.75(d，J＝7.5Hz，2H)7.62(s，1H)，7.61(d，J＝7.5Hz，2H)，7.39(t，J＝7.5Hz，2H)，7.31(t，J＝7.5Hz，2H)，6.63(s，1H)，5.42(s，1H)，5.24(d，J＝8Hz，1H)，5.15(d，J＝8Hz，1H)，4.67(dd，J＝10Hz，25Hz，2H)，4.40(d，J＝7Hz，2H)，4.37-4.27(m，4H)，4.22(t，J＝7Hz，1H)，3.72(t，J＝6Hz，2H)，3.68-3.55(m，66H)，3.54(t，J＝5Hz，2H)，3.43(dd，J＝5.5，12Hz，2H)，3.39(dd，J＝5.5，12Hz，2H)，2.46(t，J＝6Hz，2H)，2.37-2.24(m，2H)2.10-2.03(m，2H)，1.95-1.76(m，5H)，1.64-1.57(m，1H)，1.46(s，9H)，1.43(s，18H)，1.39-1.29(m，2H).13CNMR(100MHz，CDCl3)d172.4，172.1，172.1，171.4，156.8，145.1，144.0，141.3，127.7，127.0，125.1，122.9，120.0，81.9，81.9，80.6，70.6，70.6，70.6，70.5，70.4，70.4，70.3，70.3.70.1，69.9，69.6，67.3，66.6，64.6，53.1，53.0，49.9，47.3，41.0，39.2，37.0，32.4，31.7，29.6，28.3，28.1，28.1，28.0，21.8.HRMS(ES+)C₇₇H₁₂₇N₇O₂₆的计算值(M+H)m/z1566.8904实测值1566.8892。

(S)-2-(3-((S)-6-(4-(53-氨基-27-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,30,33,36,39,42,45,48,51-十六氧杂-26-氮杂五十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己-2-基)脲基)戊二酸二叔丁基酯(s-7)

将s-6(135mg)溶于3mLEt₂NH和3mLCH₂Cl₂。将反应混合物在室温搅拌3小时，然后将其在减压下浓缩且进行色谱纯化(硅胶，2x15cm，CHCl₃中的2.5％MeOH，然后CHCl₃中的5％MeOH，然后CHCl₃中的10％MeOH，然后CHCl₃中的20％MeOH，然后CHCl₃中的20％MeOH+2.5％Et₃N)，得到s-7，其为澄清油状物(86mg，75％)。IR(薄膜).1HNMR(400MHz，MeOD)d8.01(s，1H)，4.64(s，2H)，4.42(t，J＝7.2Hz，3H)，4.20-4.17(m，1H)，4.15-4.11(m，1H)，3.77-3.63(m，72H)，3.54(t，J＝5.6Hz，2H)，3.37(t，J＝5.6Hz，2H)，3.14(t，J＝5.2Hz，2H)，3.00(dd，J＝7.2，15.2Hz，1H)，2.61(t，J＝6Hz，1H)，2.48(t，J＝6Hz，2H)，2.38-2.25(m，2H)，2.08-2.00(m，1H)，1.98-1.90(m，2H)，1.85-1.74(m，2H)，1.70-1.60(m，1H)，1.48(s，9H)，1.44(s，18H)，1.40-1.36(m，2H)，1.29(t，J＝7.2Hz，2H).13CNMR(100MHz，MeOD)d173.9，173.8，173.7，173.5，159.9，146.0，125.1，82.8，82.7，81.8，71.6，71.5，71.5，71.4，71.4，71.3，71.3，71.2，71.2，71.1，71.1，70.8，70.7，70.6，68.5，68.3，67.6，65.0，54.7，54.2，52.2，51.1，43.7，40.8，40.5，37.5，35.7，32.9，32.5，30.9，29.0，28.4，28.4，23.5.HRMS(ES+)C₆₂H₁₁₇N₇O₂₄的计算值(M+H)m/z1344.8223实测值1344.8251。

s-8

将s-3(8mg，0.023mmol，1.0当量)溶于CH₂Cl₂(1mL)。向该溶液添加EDC^.HCl(15mg，0.076mmol，3.3当量)、HOBt^.H₂O(12mg，0.076mmol，3.3当量)和s-7(102mg，0.076mmol，3.3当量)在CH₂Cl₂(4mL)中的溶液。添加吡啶(5.5mg，5.7μL，0.7mmol，3.0当量)，且将反应在室温进行16小时，然后将其浓缩且部分纯化(1x15cm，硅胶，在CHCl₃中的10％MeOH)。将包含产物的级分浓缩且立即用MeOH(1mL)吸收。将1MLiOH水溶液(92μL，0.092mmol，4当量)添加至该溶液，且将反应混合物在室温搅拌3小时，然后添加1MLiOH水溶液(92μL，0.092mmol，4当量)。将反应混合物在室温再搅拌2小时，然后将其用1MHCl水溶液(138mL，0.138mmol，6.0当量)中和。将反应混合物浓缩，吸收于80％MeCN水溶液，且通过HPLC纯化(反相，C18，5mL/min，50％-75％MeCN水溶液，经40分钟)。将产物分离且冻干，得到s-8，其为白色粉末(8mg，)。IR(薄膜)2873(m)，1729(m)，1666(s)，1555(w)，1456(w)，1368(w)，1140(s)950(w)，846(w)cm-1。1HNMR(500MHz，MeOD)d8.72(t，J＝5.2Hz，1H)，8.51(s)，3H)，8.42(s，1H)，7.99(s，2H)，7.90(s)，3H)，4.62(s，4H)，4.41(t，J＝7Hz，4H)，4.18(dd，J＝5，7.2Hz，2H)，4.13(dd，J＝5，6Hz，2H)，3.71-3.69(m，10H)，3.66-3.57(m，118H)，3.52(t，J＝5.5Hz，4H)，3.36-3.34(m，8H)，2.84(t，J＝6Hz，2H)，2.44(t，J＝6.2Hz，4H)，2.37(t，J＝7.2Hz，2H)，2.33-2.28(m，4H)，2.06-2.00(m，2H)，1.96-1.90(m，4H)，1.83-1.77(m，6H)，1.75-1.68(m，2H)，1.67-1.63(m，2H)，1.46(s，18H)，1.44(s，18H)，1.43(s，18H)，1.39-1.34(m，4H).13CNMR(125MHz，MeOD)d177.2，174.0，173.7，173.7，173.5，167.9，159.9，150.2，146.0，138.8，138.0，127.4，125.1，122.8，121.8，82.8，82.7，81.8，79.5，71.5，71.5，71.5，71.4，71.4，71.4，71.3，71.3，71.3，70.7，70.6，70.5，68.3，65.0，54.7，54.2，51.1，41.3，40.4，37.5，34.6，32.9，32.5，30.8，29.8，29.0，28.4，28.3，28.3，26.1，25.5，25.3，23.5.HRMS(ES+)C₁₃₉H₂₄₅N₁₇O₅₂的计算值(M+H)m/z2985.7150实测值(M+2H)m/z1493.3458。

s-9

将s-8(22mg，0.0074mmol，1.0当量)溶于1mLDMF。向该溶液相继添加EDC(14.2mg，0.074mmol，10.0当量)、HOBt(11.3mg，0.074mmol，10.0当量)和NHS(8.5mg，0.074mmol，10.0当量)，然后添加DIPEA(13.0μL，0.074mmol，10.0当量)。将反应混合物在室温搅拌13小时，然后通过将N₂稳恒流经过反应混合物而去除DMF。将97.5％TFA/2.5％TIPS的混合物添加至烧瓶，且将反应混合物搅拌1小时，然后在减压下去除TFA。粗反应混合物通过HPLC纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用50％MeCN至80％MeCN水溶液梯度，经66分钟，以5mL/min)，得到s-9，其为白色粉末(2.5mg)，其立即在下一步使用。

cp33-二(Peg16-脲)

将s-9(2.5mg，0.9μmol，1.0当量)溶于2mLPBS和1mL饱和碳酸氢钠水溶液。添加cp33肽(2.5mg，0.11mmol，1.2当量)，且将反应混合物在室温搅拌4小时，然后将其直接注射至HPLC且纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用于水中的30％MeCN至42％MeCN梯度，经39分钟，以5mL/min)。将包含产物的级分分离且冻干，得到白色粉末(1.4mg，32.5％)。

6-(6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰胺基)己酸苄基酯(s-9)

将6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(2.58g，11.15mmol，1.1当量)溶于50mLDCM。向该溶液添加EDC^.HCl(2.14g，11.15mmol，1.1当量)、HOBt^.H2O(1.71g，11.15mmol，1.1当量)和6-氨基己酸苄基酯(2.24g，10.14mmol，1.0当量)在CH₂Cl₂(50mL)中的溶液。添加DIPEA(2.0mL，11.15mmol，1.1当量)，且将溶液在室温搅拌90分钟，然后将反应用10％柠檬酸(100mL)、饱和NaHCO₃(100mL)和盐水(100mL)洗涤。收集有机层，用MgSO₄干燥，且浓缩，得到s-9(3.17g，73％粗品)，其为白色粉末，将其继续进行而不用进一步纯化。

6-(6-氨基己酰胺基)己酸苄基酯(s-10)

将s-9(3.1g)溶于15mLTFA且在室温搅拌1小时，然后在减压下部分去除TFA。所得油状物用150mL乙醚洗涤，且将乙醚小心倾析至50mL离心管。将离心管以3.0rcf旋转沉降10分钟，得到沉降至底部的产物，且小心去除乙醚层。将产物与甲醇合并，在减压下浓缩，且与氘代氯仿共沸，得到s-10，其为绿色油状物(2.27g，92％粗品)，将其继续进行而不用纯化。

1-(9H-芴-9-基)-3,10,17-三氧代-2-氧杂-4,11,18-三氮杂二十四烷-24-酸苄基酯(s-11)

将6-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)己酸(2.39g，6.78mmol，1当量)溶于CH₂Cl₂(35mL)。向该溶液添加EDC^.HCl(1.56g，8.14mmol，1.2当量)和HOBt^.H₂O(1.25g，8.14mmol，1.2当量)。在单独的烧瓶中，将s-10(2.27g，6.78mmol，1当量)溶于CH₂Cl₂(40mL)，且添加DIPEA(3mL，17mmol，2.5当量)以中和剩余TFA。将该溶液添加至原始反应，且烧瓶用另外10mLCH₂Cl₂洗涤，将其也添加至原始反应。将反应混合物在室温搅拌75分钟，然后将其用10％柠檬酸(100mL)、饱和碳酸氢钠(100mL)和饱和盐水(100mL)洗涤。收集有机层，用MgSO₄干燥，在减压下浓缩，且部分纯化(硅胶，3x25cm，CHCl₃中的5％MeOH，然后CHCl₃中的10％MeOH)以去除偶合剂。将包含产物的级分收集且再次进行色谱纯化(CHCl₃中的50％MeCN+2.5％DIPEA)，得到白色固体，第三次进行色谱纯化(CHCl₃中的5％MeOH，然后CHCl₃中的10％MeOH)，得到s-11，其为纯白色固体(1.5g，33％，3步)。IR(薄膜)3306(br)，2936(m)，2861(w)，1719(s)，1647(s)，1544(s)，1450(m)，1254(s)，1160(m)，741(m)cm-1.1HNMR(400MHz，MeOD)d7.80(d，J＝8Hz，2H)，7.64(d，J＝8Hz，2H)，7.39(t，J＝8Hz，2H)，7.35-7.32(m，5H)，7.30(t，J＝8Hz，2H)，5.10(s，2H)，4.33(d，J＝6.4Hz，2H)，4.21(t，J＝7.2Hz，1H)，3.16-3.08(m，6H)，2.36(t，J＝7.2Hz，2H)，2.19-2.13(m，4H)，1.65-1.58(m，6H)，1.53-1.46(m，6H)，1.36-1.30(m，6H).13CNMR(100MHz，MeOD)d176.0，175.0，158.9，145.3，142.6，137.7，129.5，129.2，128.8，128.1，126.2，120.9，67.6，67.1，41.6，40.2，40.1，37.0，37.0，34.9，30.6，30.0，27.5，27.4，27.4，26.7，25.7.HRMS(ES+)C₄₀H₅₁N₃O₆的计算值(M+H)m/z670.3850实测值670.3847。

1-(9H-芴-9-基)-3,10,17-三氧代-2-氧杂-4,11,18-三氮杂二十四烷-24-酸(s-12)

将s-11溶于90％iPrOH/10％MeOH(30mL)且添加至10％Pd/C在10mL90％iPrOH/10％MeOH中的浆液中。40mL90％iPrOH/10％MeOH用于添加剩余的起始材料，且将烧瓶用N₂吹洗15分钟。然后将H₂气鼓泡通过浆液达5分钟，且将反应混合物在H₂气氛在室温搅拌2小时，然后将其用硅藻土过滤且进行色谱纯化(3x25cm硅胶，在CHCl₃中的10％MeOH)，得到s-12，其为白色固体(580mg，45％)。IR(薄膜)3312(br)，2935(m)，2861(w)，1705(s)，1647(s)，1546(s)，1450(w)，1255(m)cm-1.1HNMR(400MHz，MeOD)，7.97(s，2H)，7.83(d，J＝8Hz，2H)，7.67(d，J＝8Hz，2H)，7.62(t，J＝8Hz，2H)，7.35-7.32(t，J＝8Hz，2H)，7.13(s，1H)，4.37(d，J＝6.4Hz，2H)，4.22(t，J＝7.2Hz，1H)，3.20-3.12(m，6H)，2.31(t，J＝7.2Hz，2H)，2.22-2.16(m，4H)，1.66-1.59(m，6H)，1.56-1.49(m，6H)，1.42-1.33(m，6H).13CNMR(100MHz，MeOD)d177.6，176.1，158.9，145.4，142.6，128.8，128.2，126.2，121.0，67.6，41.6，40.2，37.0，37.0，30.6，30.1，27.6，27.5，27.4，26.8，26.7，25.8.HRMS(ES+)C₃₃H₄₅N₃O₆的计算值(M+H)m/z580.3381实测值580.3377。

6-(6-(6-氨基己酰胺基)己酰胺基)己酸苄基酯(s-13)

将s-12(1.17g)溶于1：1Et₂NH/CH₂Cl₂(37mL)的混合物，且将反应混合物在室温搅拌8小时，然后将其在减压下浓缩且进行色谱纯化(3x25cm硅胶，在CHCl₃中的20％MeOH，然后在CHCl₃中的20％MeOH+2.5％Et₃N)，得到s-13，其为白色固体(630mg，81％)。IR(薄膜)3221(w)，3277(w)，2941(m)，2862(w)，1727(m)，1633(s)，1542(m)，1477(w)，1262(w)，1184(w)cm-1.1HNMR(400MHz，CDCl3)d7.38-7.30(m，5H)，5.89(s，1H)，5.67(s，1H)，5.11(s，2H)，3.26-3.20(m，6H)，2.27(t，J＝7.2，2H)，2.19-2.14(m，4H)，1.69-1.62(m，6H)，1.55-1.48(m，6H)，1.40-1.32(m，6H)。13CNMR(100MHz，CDCl3)d173.5，173.0，172.9，136.0，128.4，128.3，128.2，66.2，41.7，39.2，39.1，36.6，36.5，34.1，32.5，29.3，29.2，26.4，25.4，25.1，24.5.HRMS(ES+)C₂₅H₄₁N₃O₄的计算值(M+H)m/z448.3170实测值448.3150。

6,6'-((6,6'-((6,6'-((5-叠氮基间苯二甲酰基)二(氮烷二基))二(己酰基))二(氮烷二基))二(己酰基))二(氮烷二基))二己酸(s-14)

将叠氮基间苯二甲酸(100mg，0.483mmol，1当量)在5mL无水CH₂Cl₂中的混合物在火焰干燥的烧瓶中制备。向该混合物相继添加EDC^.HCl(233mg，1.21mmol，2.5当量)、HOBt^.H2O(183mg，1.21mmol，2.5当量)、s-13(476mg，1.06mmol，2.2当量)和吡啶(0.117mL，1.45mmol，3当量)。将反应混合物在室温搅拌18小时，然后将其直接负载至硅胶柱，且部分纯化以去除偶合剂(硅胶，2x15cm，在CHCl₃中的10％MeOH)。将粗物质溶于5mLMeOH和5mLTHF。添加1MLiOH水溶液(1.9mL，4当量)，且将反应混合物在室温搅拌24小时。添加1MHCl溶液(0.95mL，2当量)，且反应混合物在减压下浓缩。然后将粗混合物进行色谱纯化(硅胶，2x15cm，在CHCl₃中的20％MeOH，然后在CHCl₃中的20％MeOH+1％TFA)且收集包含产物的级分，并在减压下浓缩，得到浅棕色油状物。然后将50mL95％乙醚/5％MeOH添加至油状物。然后倾析醚/MeOH混合物，且将油状物在减压下干燥，得到s-14，其为白色固体(383mg，89％，2步)。IR(薄膜)3310(br)，2937(m)，2865(w)，2112(m)，1650(s)，1553(m)，1439(w)，1202(m)，1139(m)cm-1。1HNMR(400MHz，MeOD)d8.05(s，1H)，7.65(s，2H)，3.39(t，J＝5.6Hz，4H)，3.15(dd，J＝3.2，6.6Hz，8H)，2.29(t，7.2Hz，4H)，2.22-2.15(m，8H)，1.68-1.58(m，16H)，1.51-1.47(m，8H)，1.42-1.32(m，12H)。13CNMR(100MHz，MeOD)d177.4，176.0，168.3，138.1，123.6，121.5，41.0，40.2，37.0，34.8，30.1，30.1，27.6，27.5，26.7，25.7.HRMS(ES+)C₄₄H₇₁N₉O₁₀的计算值(M+H)m/z886.5397实测值886.5408。

(S)-2-(3-((S)-6-(4-(氨基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己-2-基)脲基)戊二酸二叔丁酯(s-15)

在5mL微波反应管将s-1(180mg，0.35mmol，1当量)和炔丙基胺(117μL，1.75mmol，5当量)的混合物溶于H₂O(1.25mL)和叔丁醇(1.25mL)的混合物。向该混合物添加0.1M抗坏血酸钠(0.7mL，0.2当量)和0.1M硫酸铜(II)(0.14mL，0.04当量)。将管封盖，且在110℃进行微波照射2.5分钟。然后将反应混合物在60℃在减压下浓缩，且进行色谱纯化(硅胶，1x15cm，在CHCl₃中的10％MeOH，然后在CHCl₃中的10％MeOH+2.5％Et₃N)，得到s-15，其为淡绿色油状物(152mg，77％)。IR(薄膜)2978(m)，2933(w)，1730(s)，1647(m)，1559(m)，1456(w)，1368(m)，1255(w)，1154(s)cm-1。1HNMR(400MHz，MeOD)d7.90(s，1H)，4.90(t，J＝7.2Hz，2H)，4.20-4.16(m，1H)，4.14-4.12(m，1H)，3.96(s，2H)，2.36-2.26(m，2H)，2.08-2.00(m，1H)，1.95-1.89(m，2H)，1.84-1.73(m，2H)，1.69-1.59(m，1H)，1.46(s，9H)，1.44(s，18H)，1.39-1.31(m，2H)。13CNMR(100MHz，MeOD)d173.7，173.7，173.5，159.9，147.7，123.8，82.8，82.7，81.8，54.2，51.1，37.1，32.9，32.5，30.8，29.0，28.4，28.3，23.5.HRMS(ES+)C₂₇H₄₈N₆O₇的计算值(M+H)m/z568.3657实测值568.3637。

(S)-2-(3-((S)-6-(4-(1-(9H-芴-9-基)-3,10,17,24-四氧代-2-氧杂-4,11,18,25-四氮杂二十六烷-26-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己-2-基)脲基)戊二酸二叔丁基酯(s-16)

将6-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)己酸(156mg，0.267mml，1当量)的混合物在1.5mL无水CH₂Cl₂中制备。向该浆液添加EDC^.HCl(56mg，0.294mmol，1.1当量)和HOBt^.H₂O(45mg，0.294mmol，1.1当量)。向该浆液添加s-16(152mg，0.267mmol，1当量)在3mL无水CH₂Cl₂中的溶液，然后添加DIPEA(32μL，0.294mmol，1.1当量)。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后添加EDC-HCl(28mg，0.247mmol，0.5当量)、HOBt-H₂O(23mg，0.247mmol，0.5当量)和DIPEA(32μL，0.294mmol，1.1当量)。将反应混合物在室温搅拌另外2小时，然后将反应混合物在减压下浓缩且进行色谱纯化(硅胶，2x15cm，在CHCl₃中的10％MeOH)，得到s-16，其为粘性淡绿色油状物(235mg，78％)。IR(薄膜)2933(m)，2862(w)，2413(br)，1729(s)，1630(s)，1453(s)，1367(m)，1251(w)，1153(s)，742(w)cm-1。1HNMR(400MHz，MeOD)d7.84(s，1H)，7.80(d，J＝7.2Hz，2H)，7.64(d，J＝7.2Hz，2H)，7.39(t，J＝8Hz，2H)，4.40(d，J＝2Hz，2H)，4.37(t，J＝6.8Hz，2H)，4.33(d，J＝6.8Hz，2H)，4.21-4.17(m，2H)，4.13(dd，J＝5.2，8Hz，1H)，3.17-3.08(m，6H)，2.34-2.29(m，2H)，2.23-2.13(m，6H)，2.08-2.00(m，1H)，1.94-1.86(m，2H)，1.84-1.73(m，2H)，1.64-1.57(m，7H)，1.52-1.43(m，5H)，1.46(s，9H)，1.43(s，18H)，1.39-1.29(m，9H).13CNMR(100MHz，MeOD)d176.0，175.9，173.7，173.6，173.4，159.9，158.8，146.2，145.3，142.6，128.8，128.1，126.2，124.1，120.9，82.8，82.6，81.7，67.6，54.6，54.1，51.3，41.6，40.2，37.0，37.0，36.7，35.6，32.9，30.8，30.6，30.1，29.0，28.4，28.3，27.5，27.4，26.7，26.7，26.5，23.4.HRMS(ES+)C₆₀H₉₁N₉O₁₂的计算值(M+H)m/z1130.6860实测值1130.6848。

(S)-2-(3-((S)-6-(4-((6-(6-(6-氨基己酰胺基)己酰胺基)己酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己-2-基)脲基)戊二酸二叔丁基酯(s-17)

将s-16(195mg)溶于2.5mLEt₂NH和2.5mLCH₂Cl₂。将反应混合物在室温搅拌26小时，然后将其在减压下浓缩且进行色谱纯化(硅胶，2x15cm，在CHCl₃中的20％MeOH，然后在CHCl₃中的20％MeOH+2.5％Et₃N)，得到s-17，其为粘稠淡黄色固体(137mg，90％)。IR(薄膜)3271(br)，2934(m)，2864(w)，1731(s)，1643(s)，1556(s)，1457(w)，1367(m)，1256(w)，1154(s)cm-1。1HNMR(400MHz，MeOD)d7.99(s，1H)，7.88(s，1H)，6.40(dd，J＝12，14Hz，1H)，4.42(s，2H)，4.41(t，J＝9Hz，2H)，4.21-4.11(m，2H)，3.22-3.14(m，4H)，2.93(t，J＝8Hz，2H)，2.35-2.30(m，2H)，2.25-2.16(m，6H)，2.08-2.01(m，1H)，1.95-1.90(m，1H)，1.83-1.74(m，2H)，1.71-1.58(m，9H)，1.55-148(m，4H)，1.48(s，9H)，1.45(s，18H)，1.42-1.29(m，10H)。13CNMR(100MHz，MeOD)d176.0，175.7，173.8，173.7，173.5，159.9，146.3，124.2，82.8，82.7，81.8，81.7，40.6，40.2，40.2，37.0，36.8，36.6，35.6，32.9，32.5，30.8，30.6，30.2，29.0，28.4，28.3，27.6，27.0，26.8，26.5，26.4，23.5.HRMS(ES+)C₃₄H₈₁N₉O₁₀的计算值(M+H)m/z908.6179实测值908.6165。

s-18

向s-14(150mg，0.169mmol，1.0当量)在CH₂Cl₂(1.5mL)中的溶液中添加EDC^.HCl(81mg，0.423mmol，2.5当量)、HOBt^.H₂O(65mg，0.423mmol，2.5当量)，然后添加s-15(212mg，0.373mmol，2.2当量)在CH₂Cl₂(3.5mL)中的溶液。将吡啶(82μL，0.507mmol，3当量)添加至所得溶液，且将反应混合物在室温搅拌20小时，然后将其在减压下浓缩且通过硅胶色谱法部分纯化(1x15cm，硅胶，CHCl₃中的5％MeOH，然后CHCl₃中的10％MeOH)，得到暗红色油状物(190mg，57％粗品)，将其用于下一步。

s-19

在5mL微波瓶中将部分纯的s-18(100mg，0.05mmol，1.0当量)溶于H₂O(1.25mL)和叔丁醇(1.25mL)。向该溶液添加6-庚炔酸(6.4μL，0.05mmol，1.0当量)、0.1M抗坏血酸钠(0.5mL，0.05mmol，1.0当量)和0.1M硫酸铜(II)(0.25mL，0.025mmol，0.5当量)。将瓶密封且在110℃进行微波照射1小时，然后将反应混合物浓缩且通过HPLC纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用水中的50％MeCN至80％MeCN梯度，经66分钟，以5mL/min)。将产物分离且冻干，得到白色粉末(11mg，11％)。IR(薄膜)2938(w)，1634(s)，1553(m)，1461(m)，1369(w)，1141(s)，975(w)，841(w)，800(w)，722(w)cm-1.1HNMR(400MHz，MeOD)d8.78(t，J＝5.4Hz，1H)，8.48(s，1H)，8.45(d，J＝1.6Hz，2H)，8.36(s，1H)，7.88(s，2H)，4.41-4.37(m，8H)，4.18(dd，J＝5，8.8Hz，2H)，4.12(dd，J＝5.2，8Hz，2H)，3.67-3.64(m，1H)，3.43(t，J＝6.8Hz，4H)，3.14(t，J＝6.4Hz，8H)，2.84(t，J＝7Hz，2H)，2.37(t，J＝7.2Hz，2H)，2.34-2.29(m，4H)，2.26-2.13(m，12H)，2.08-1.99(m，2H)，1.95-1.87(m，4H)，1.84-1.71(m，6H)，1.69-1.54(m，20H)，1.50-1.42(m，10H)，1.46(s，18H)，1.44(s，18H)，1.43(s，18H)，1.38-1.26(m，12H).13CNMR(100MHz，MeOD)d176.0，173.7，173.7，173.5，167.9，159.9，138.2，122.6，82.8，82.7，81.7，54.6，54.2，40.2，37.0，32.9，32.5，30.1，29.0，28.4，28.3，27.6，26.7，23.4.HRMS(ES+)C₁₀₅H₁₇₃N₂₁O₂₄的计算值(M+H)m/z2113.3062实测值(M+2H)1057.1462。

s-20

将部分纯的s-19(35mg，0.018mmol，1.0当量)溶于THF。向该溶液添加三氟乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺基酯(19mg，0.09mmol，5.0当量)和吡啶(10mg，0.125mmol，7.0当量)。将反应混合物在室温搅拌1.5小时，然后将其用0.5mLPBS淬灭且在减压下浓缩。向所得混合物添加2mL95％TFA/5％TIPS，且将反应混合物在室温搅拌1小时，然后在减压下去除TFA。反应混合物通过HPLC纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用水中的0％MeCN至80％MeCN梯度，经51分钟，以5mL/min)且将包含产物的级分分离且冻干，得到s-20(1.9mg)，其直接在下一反应使用。

cp33-二(Ac3-脲)

将s-20溶于975μLPBS和325μL饱和碳酸氢钠水溶液。添加cp33肽(2.4mg，0.0011mmol，1.1当量)，且将反应混合物在室温搅拌7小时，然后将反应混合物直接装载至HPLC且纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用水中的0％MeCN至80％MeCN梯度，经51分钟，以5mL/min)。将包含产物的级分收集且冻干，得到白色粉末(1.1mg，25.6％)。

s-21

在CH₂Cl₂(5mL)中制备s-14(190mg，0.214mmol，1.0当量)的溶液。添加EDC^.HCl(103mg，0.535mmol，2.5当量)和HOBt^.H₂O(82mg，0.535mmol，2.5当量)，然后添加s-17(428mg，0.472mmol，2.2当量)在CH₂Cl₂(5mL)中的溶液。添加吡啶(52μL，0.642mmol，3.0当量)，且将反应混合物在室温搅拌24小时，然后将其在减压下浓缩且进行色谱纯化(硅胶，1x15cm，在CHCl₃中的10％MeOH，然后CHCl₃中的15％MeOH，然后在CHCl₃中的20％MeOH)，得到部分纯的淡黄色固体(250mg，44％粗品)。

s-22

在2mL微波瓶中将s-21(50mg，0.019mmol，1.0当量)溶于H₂O(0.5mL)和叔丁醇(0.5mL)。向该溶液添加6-庚炔酸(2.5μL，0.019mmol，1.0当量)、0.1M抗坏血酸钠(0.2mL，1.0当量)和0.1M硫酸铜(II)(0.1mL，0.5当量)。将瓶密封且在110℃进行微波照射1小时，然后将反应混合物浓缩且进行色谱纯化(1x15cm，硅胶，在CHCl₃中的20％MeOH，然后在CHCl₃中的20％MeOH+1％TFA)。将包含产物的级分浓缩，用乙醚(50mL)洗涤，且与CDCl₃共沸，得到部分纯的绿色固体(27mg)，其用于下一步。

s-23

将部分纯的s-22(37mg，0.013mmol，1.0当量)溶于DMF(0.5mL)。相继添加EDC(7.7mg，0.04mmol，3.0当量)、HOBt(6.2mg，0.04mmol，3.0当量)和N-羟基琥珀酰亚胺(4.6mg，0.04mmol，3.0当量)，然后添加DIPEA(7.1μL，0.04mmol，3.0当量)。将反应混合物搅拌1小时，然后添加EDC(7.7mg，0.04mmol，3.0当量)和DIPEA(7.1μL，0.04mmol，3.0当量)。将反应再搅拌2小时，然后通过将N2稳恒流经过反应混合物而去除DMF。将1mL98％TFA/2％TIPS混合物添加至烧瓶，且将反应混合物在室温搅拌30分钟，然后在减压下去除TFA。该反应通过HPLC纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用水中的0％MeCN至80％MeCN梯度，经51分钟，以5mL/min)。将包含产物的级分收集且冻干，得到s-23，其为白色粉末(2.5mg)，其直接在下一步使用。

cp33-二(Ac6-脲)

将s-23(2.5mg，0.86μmol，1.0当量)溶于0.9mLPBS和0.4mL7.5％碳酸氢钠水溶液。添加cp33(2mg，0.65μmol，0.75当量)，且将反应混合物在室温搅拌1小时，然后添加1mLDMF。将反应混合物在室温搅拌另外6小时，然后将反应混合物直接注射至HPLC且纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用水中的10％MeCN至65％MeCN梯度，经66分钟，以5mL/min)。将包含产物的级分收集且冻干，得到cp33-二(Ac6-脲)，其为白色粉末(0.2mg，4.5％)。

s-22

将3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七-26-炔-1-胺(3mg，0.007mmol，1.0当量)添加至2mL微波瓶，然后添加s-20(20mg，0.007mmol，1.0当量)水溶液(0.25mL)和叔丁醇(0.25mL)。向该溶液添加0.1M抗坏血酸钠(70μL，0.007mmol，1.0当量)和0.1M硫酸铜(II)(35μL，0.0035mmol，0.5当量)。将瓶密封且在110℃进行微波照射1小时，然后将反应混合物浓缩，得到粗制深红色油状物。在5mL瓶中将该油状物用67％TFA在CH₂Cl₂(3mL)中的溶液吸收，且在70℃将瓶进行微波照射2分钟。将反应混合物浓缩，溶于50％MeCN水溶液，且通过HPLC纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用5水中的0％MeCN至80％MeCN梯度，经66分钟，以5mL/min)。将产物分离且冻干，得到s-22，其为白色粉末(3mg，15％)。IR(薄膜)3296(br)，2934(m)，2864(w)，1643(s)，1556(m)，1463(w)，1202(m)，1134(m)cm-1.1HNMR(500MHz，MeOD)d8.70(s，1H)，8.48(d，J＝1.5Hz，2H)，8.38(t，J＝1.5Hz，1H)，7.86(s，2H)，4.78(s，2H)，4.42(d，J＝3.2Hz，4H)，4.39(t，J＝7.2Hz，4H)，4.30(dd，J＝5，9Hz，2H)，4.27(dd，J＝5，8.5Hz，2H)，3.77-3.75(m，4H)，3.72-3.60(m，32H)，3.47(t，J＝7.2Hz，4H)，3.15(t，J＝7.2Hz，22H)，2.43-2.39(m，4H)，2.24-2.14(m，26H)，1.94-1.84(m，10H)，1.70-1.64(m，12H)，1.63-1.55(m，20H)，1.53-1.37(m，30H)，1.35-1.29，(m，20H).HRMS(ES+)C₁₂₉H₂₁₈N₂₈O₃₆的计算值(M+H)m/z2737.6191实测值2737.6153。

(S)-(6-氧代-6-(丙-2-炔-1-基氨基)己烷-1,5-二基)二氨基甲酸二((9H-芴-9-基)甲基)酯(s-23)

向Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(1g，1.69mmol，1.0当量)在CH₂Cl₂(30mL)中的溶液中添加EDC^.HCl(391mg，2.03mmol，1.2当量)、HOBt^.H₂O(311mg，2.03mmol，1.2当量)，然后添加炔丙基胺(93mg，0.11mL，1.69mmol，1.0当量)和DIPEA(264mg，0.36mL，2.03mmol，1.2当量)。将反应混合物在室温搅拌90分钟，此时该反应混合物变为凝胶。将凝胶用刮勺破碎且用CH₂Cl₂(50mL)吸收。将混合物超声处理且过滤。收集滤液，用10％柠檬酸(50mL)、饱和碳酸氢钠(50mL)和盐水(50mL)洗涤。收集有机层，用MgSO₄干燥，且在减压下浓缩，得到s-23，其为白色粉末(330mg，31％产率)。IR(薄膜)3297(s)，3068(br)，2937(br)，1687(s)，1650(s)，1539(m)，1450(w)，1264(w)cm-1.1HNMR(500MHz，CDCl3)d7.75(t，J＝7.8Hz，4H)，7.56(d，J＝7.4Hz，4H)，7.39(q，J＝7.5Hz，4H)，7.30(q，J＝7.5Hz，4H)，6.28(bs，1H)，5.44(bs，1H)，4.85(bs，1H)，4.43-4.35(m，4H)，4.21-4.30(m，3H)，4.02(s，2H)，3.25-3.15(m，2H)，2.18(t，J＝2.4Hz，1H)，1.95-1.85(m，1H)，1.75-1.65(m，1H)，1.60-1.50(m，2H)，1.42-1.32(m，2H).13CNMR(125MHz，CDCl3)d171.4，156.9，144.1，144.0，143.9，143.8，141.5，141.4，127.9，127.8，127.2，127.2，125.1，125.1，120.2，120.1，79.3，72.0，67.2，66.8，47.4，40.3，31.7，29.6，29.4，22.3.HRMS(ES+)C₃₉H₃₇N₃O₅的计算值(M+H)m/z628.2806实测值628.2802。

(S)-2,6-二氨基-N-(丙-2-炔-1-基)己酰胺(s-24)

将s-23(300mg)溶于10mLEt₂NH和10mLCH₂Cl₂。将反应混合物搅拌24小时，然后将其浓缩且通过柱色谱法纯化(在CH₂Cl₂中的25％MeOH，然后在CH₂Cl₂中的25％MeOH+2％NH₄OH)，得到s-24，其为白色固体(48mg，55％)。IR(薄膜)3278(br)，2931(m)，2861(w)，1649(s)，1554(s)，1345(w)，1262(w)，920(w)cm-1.1HNMR(400MHz，MeOD)d3.96(dd，J＝2.4，7.2Hz，2H)，3.26(t，J＝7Hz，1H)，2.71(t，J＝7.6Hz，2H)，2.59(m，1H)，1.69-1.61(m，1H)，1.58-1.47(m，3H)，1.46-1.34(m，2H).13CNMR(100MHz，MeOD)d177.3，80.1，72.3，55.9，41.7，36.0，31.8，29.3，23.8.HRMS(ES+)C₉H₁₇N₃O的计算值(M+H)m/z184.1444实测值184.1441。

(S)-(11,19-二氧代-13-(丙-2-炔-1-基氨基甲酰基)-3,6,9,21,24,27-六氧杂-12,18-二氮杂二十九烷-1,29-二基)二氨基甲酸二((9H-芴-9-基)甲基)酯(s-25)

将Fmoc-miniPEG3-COOH(164mg，0.38mmol，2.2当量)溶于CH₂Cl₂(5mL)。向该溶液添加EDC^.HCl(84mg，0.44mmol，2.5当量)和HOBt^.H2O(67mg，0.44mmol，2.5当量)。所得溶液转移至包含s-24(32mg，0.174mmol，1.0当量)的烧瓶。添加DIPEA(68mg，92μL，0.52mmol，3.0当量)，然后添加1mLDMF。将反应混合物在室温搅拌6小时，然后将其浓缩且进行色谱纯化(5％MeOH在CHCl₃)，得到澄清油状物(122mg，70％)。IR(薄膜)3307(br)，3063(w)，2918(s)，1712(m)，1659(m)，1535(s)，1450(w)，1253(m)，1105(m)cm-1.1HNMR(500MHz，CDCl3)d7.76(d，J＝7.5Hz，4H)，7.60(d，J＝7.5Hz，4H)，7.39(t，J＝7.5Hz，4H)，7.30(t，J＝7.5Hz，4H)，6.97(bs，1H)，6.84(bs，1H)，5.74(bs，1H)，5.63(bs，1H)，4.44-4.38(m，5H)，4.21(t，J＝7Hz，2H)，4.05-3.96(m，6H)，3.65-3.61(m，16H)，3.57-3.55(m，4H)，3.42-3.35(m，4H)，3.28-3.21(m，3H)，2.15(t，J＝2Hz，1H)，1.93-1.87(m，1H)，1.72-1.66(m，1H)，1.56-1.50(m，2H)，1.39-1.34(m，2H).13CNMR(125MHz，CDCl3)d171.2，170.6，170.1，156.8，144.2，144.1，141.5，127.8，127.8，127.2，125.3，125.2，120.1，71.7，71.1，71.0，70.6，70.5，70.5，70.4，70.4，70.2，70.2，66.7，66.7，52.5，47.4，47.4，41.1，38.6，31.5，29.2，23.1.HRMS(ES+)C₅₅H₆₇N₅O₁₃的计算值(M+H)m/z1007.4840实测值1007.4839。

(S)-N,N'-(6-氧代-6-(丙-2-炔-1-基氨基)己烷-1,5-二基)二(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酰胺)(s-26)

将s-25(120mg)溶于5mLCH₂Cl₂和5mLEt₂NH。将反应混合物在室温搅拌24小时，然后将其浓缩且进行色谱纯化(1x15cm硅胶，在CH₂Cl₂中的25％MeOH，然后在CH₂Cl₂中的25％MeOH+2％NH₄OH)，得到无色油状物(42mg，63％)。IR(薄膜)3289(br)，2865(m)，1655(s)，1532(m)，1457(w)，1103(m)cm-1.1HNMR(400MHz，MeOD)d4.40(dd，J＝5.4，8.8Hz，1H)，4.04(s，2H)，3.98-3.95(m，4H)，3.73-3.61(m，16H)，3.53(dt，J＝2，5.2Hz，4H)，3.24(t，J＝7Hz，2H)，2.62(t，J＝1.5Hz，1H)，1.89-1.80(m，1H)，1.76-1.68(m，1H)，1.59-1.52(m，2H)，1.43-1.33(m，2H).13CNMR(100MHz，MeOD)，d173.5，172.6，172.6，80.5，73.3，73.2，72.4，72.0，71.9，71.6，71.5，71.4，71.4，71.2，71.2，71.2，53.9，42.1，42.1，39.7，33.1，30.1，29.5，24.1.HRMS(ES+)C₂₅H₄₇N₅O₉的计算值(M+H)m/z562.3447实测值562.3448。

s-27

在5mL微波瓶将s-21(162mg，0.091mmol，1当量)和s-26(34mg，0.091mmol，1当量)溶于H₂O(1.5mL)和叔丁醇(1.5mL)。向该溶液添加0.1M抗坏血酸钠(0.6mL，1当量)和0.1M硫酸铜(II)(0.3mL，0.5当量)。将瓶密封且在110℃进行微波照射1小时，然后将反应混合物在减压下浓缩，得到粗制棕色油状物。在5mL微波瓶将粗油状物吸收于在CH₂Cl₂(3mL)中的67％TFA。将瓶密封且在70℃进行微波照射2分钟，然后反应混合物在减压下浓缩且使用HPLC纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用水中的50％MeCN至80％MeCN梯度，经66分钟，以5mL/min)。将产物分离且冻干，得到白色粉末(25mg，14％，2步)。IR(薄膜)3300(br)，3093(w)，2935(m)，2866(w)，1640(s)，1552(m)，1459(w)，1201(w)，1135(w)cm-1.1HNMR(500MHz，MeOD)d8.56(s，1H)，8.45(d，J＝1.6Hz，2H)，8.37(t，J＝1.5Hz，2H)，7.86(s，2H)，5.49(s，2H)，4.58(s，2H)，4.45-4.40(m，6H)，4.39(t，J＝7Hz，4H)，4.30(dd，J＝5，9Hz，2H)，4.26(dd，J＝5，9Hz，2H)，4.07(s，2H)，4.00(s，2H)，3.73-3.66(m，24H)，3.43(t，J＝7Hz，4H)，3.23(dt，J＝3.1，7.5Hz，2H)，3.17-3.13(m，26H)，2.43-2.39(m，4H)，2.24-2.13(m，28H)，1.96-1.82(m，10H)，1.78-1.71(m，2H)，1.71-1.63(m，12H)，1.63-1.54(m，24H)，1.53-1.46(m，24H)，1.44-1.37(m，12H)，1.35-1.29(m，22H)，1.04(d，J＝5.6Hz，2H).13CNMR(125MHz，MeOD)d176.3，176.1，175.9，175.8，174.1，172.6，172.5，171.1，167.8，161.5，161.2，160.1，147.4，138.6，138.3，127.9，124.3，122.7，122.6，118.4，116.1，71.8，71.7，71.4，71.2，71.2，71.1，67.9，67.9，54.8，54.2，53.7，53.5，51.1，41.1，40.7，40.6，40.2，39.6，37.0，36.8，35.6，32.9，32.8，31.1，30.7，30.1，30.1，28.8，27.6，27.5，26.7，26.5，25.7，24.1，23.4，17.6，12.9.HRMS(ES+)C₁₃₅H₂₂₈N₃₂O₃₇的计算值(M+3H)m/z964.2387实测值(M+3H)m/z964.2380。

二(cp33)-二(Ac6-脲)

将s-27(1.0mg，0.31μmol，1.0当量)溶于0.15mLDMF。向该溶液添加cp33-Ac-NHS(1.48mg，0.62μmol，2.0当量)在0.15mLDMF中的溶液。随后添加DIPEA，且将反应混合物在室温搅拌12小时。将反应用1mL水淬灭且直接注入至HPLC且纯化(Sunfire^TMPrepC18柱(10x150mm)，使用水中的20％MeCN至60％MeCN梯度，经30分钟，以5mL/min)，得到白色粉末(0.4mg，19％)。

生物评价

使用以下所示的缓冲液、溶液、蛋白质、抗体、试剂、设备、材料、软件等以进行生物评价。

缓冲液和溶液：

·超低(Ultra-low)IgGFBS

Invitrogen#16250-086

·RPMI-1640培养基

Invitrogen#11875-093

储存在4℃

·RPMI-1640无苯酚培养基

Invitrogen#11835-030

·RPMI生长培养基

RPMI培养基1640

来自xxx

·DMEM-高葡萄糖

XXXX

·无色ADCP培养基

RPMI培养基1640，液体

ATCC#11835-030，没有酚红，补充10％HI-FBS超低IgG

和1％青霉素-链霉素

·DPBS溶液

Invitrogen#14190-144

·EDTA分离溶液

210mLDPBS

392mgEDTA二钠盐(5.0mM)

84mgEGTA(1.0mM)

至pH7.4

0.22μM无菌滤器

·TBS-ATris-缓冲盐水，含有1.5％BSA

蛋白质、抗体和试剂

·Avi-标记的重组人PSMA蛋白质由JanKonvalinka博士和CerilBarinka博士友情提供

参照

·抗-二硝基苯基-KLH兔IgG部分

Invitrogen#A6430

购买的溶液储存在4℃

·链亲和素-Alexa467(Invitrogen)

·青霉素-链霉素，液体(10,000单位青霉素；10,000μg链霉素/mL)Invitrogen#15140-163

·重组人IFN-γ

细胞信号转导技术

#8901SC

·VybrantDiD细胞标记溶液

Invitrogen#V-22887

乙醇中1mM

FL-4荧光团

·VybrantDiO细胞标记溶液

Invitrogen#V-22886

DMF中1mM

FL-1荧光团

·台盼蓝染液0.4％

Invitrogen#15250

·AT10抗体ab23336批号#902047

·缀合的抗PSMA抗体藻红蛋白

来自Abcam#AB-77228

·藻红蛋白校准珠子

BangsLaboratoriesQuantum^TMR-PEMESF(#827)

设备、材料和软件

·96孔平底免疫板

MaxiSorp，非无菌，PS

Nunc#442404

·C6流式细胞分析仪Accuri

具有CFlowPlus软件

·AmnisImagestreamX流式细胞分析仪，具有IDEAS分析软件

·FlowJo软件

·陪替氏培养皿(PetriDishes)

BDFalcon#351029

100x15mm

·组织培养皿

BDFalcon#353003

100x20mm

·Synergy2多模式微板读数器

BioTek，使用Gen5软件

·T-烧瓶

BDFalcon#353136

处理的75cm²组织培养物

·链亲和素标记的6uM珠子

Polysciences6uMYGfluoresebrite珠子

-0.7ug/mL生物素负载批号#601514

-1.4ug/mL生物素负载批号#573565

6uM非荧光珠子

-2.0ug/mL生物素负载批号#621277

光泽精

TokyoChemicals

·Prismgraphpad软件

细胞培养

一般过程：

·细胞计数：将细胞悬液(10μL)在台盼蓝(0.4％，90μL)中稀释。将10μL该混合物装载至血细胞计数器。活细胞在10X放大下目测计数。

·EDTA分离：抽吸粘附细胞且用DPBS(5mL)洗涤。向烧瓶添加EDTA分离溶液(5mL)。对该烧瓶进行培养(15min)。通过轻轻清洗烧瓶底部之上的溶液将细胞完全分离。将细胞悬液成团(pellet)、抽吸、悬浮在培养基中，且按需要拆分至新的烧瓶中。

·在37℃在补充5％CO2的湿气氛下进行培养。

·通过以1100rpm离心5分钟而成团。

细胞系：

·所有细胞系在补充5％CO2的培养器(37℃)中生长。大约每4天更换培养基。细胞分裂为约4:1。约30次传代后细胞不再生长。

·U937细胞购自ATCC(#CRL-1593.2)，在陪替氏培养皿中作为悬浮物生长，使用补充10％HI-FBS和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基。

·IIA1.6细胞由VandeWinkelJ.G.J.博士和LeusenJ.H.W博士友情提供，在组织培养物处理的培养皿中作为弱粘附的细胞生长，使用补充10％HI-FBS和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基。

·RM1.PGLS由MemorialSloanKetering癌症中心的MichaelSadelain博士友情提供，在组织培养物处理的培养皿中作为粘附的细胞生长，使用补充10％HI-FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM-高葡萄糖。

PSMA结合常数的珠子结合测试

各SyAm衍生物与PSMA的结合在PSMA-涂覆的珠子上评估。6μm链亲和素标记的珠子(Polysciences)与400μg/ml重组avi-标记的-PSMA蛋白质一起培养30分钟。珠子用PBS洗涤两次，用1mg/ml生物素阻断30分钟，然后用TBS-A洗涤两次。10⁵珠子用一系列1μM-100pM的SyAm稀释液培养。将链亲和素-Alexa467(Invitrogen)添加至终浓度为3.3μM。样品在冰上培养30分钟，用DPBS洗涤两次，且通过AccuriC6流式细胞仪评估。为结合至RM1.PGLS细胞，遵循相同条件，将RM1.PGLS细胞代替珠子。

分子PSMA结合的EC₅₀(nM)FcyRI结合的EC₅₀(nM)SyAM-P140.7248.7SyAM-P226SyAM-P323.257.7

表达IIA1.6FcyRI的细胞结合测试

肽稀释物在DMSO中制备，通常用1mM储备液起始，再进行10倍稀释。用FcγRIA/γ-链稳定转染的细胞IIa1.6和用作同基因阴性对照非转染的IIa1.6细胞，生长至约1.5-2x10⁶细胞/mL密度，旋转沉降且在RPMI1640培养基中重构，该培养基没有酚红，补充10％FBS和Pen/Strep混合物以达到细胞密度1x10⁶细胞/mL。100μL细胞等分试样进一步转染至埃彭道夫管且在冰上静置冷却5-10分钟。然后将1μL溶于DMSO的肽添加至细胞，使DMSO终浓度为1％。用肽在冰上培养1小时后，将5μL链亲和素-Alexafluor488(2mg/mL)添加至细胞且在冰上培养30-60分钟。培养后，将细胞用1mL冷RPMI1640培养基清洗两次，该培养基没有酚红，且补充10％FBS和Pen/Strep，最后在1mLTBS缓冲液(150mMNaCl和25mMTris，pH7.4)中清洗一次。将细胞再悬浮在残余TBS缓冲液(通常～100μL)中且通过流式细胞术分析，在FL1通道中检测。

PSMA测量

RM1.PGLS细胞用无酶的分离溶液通过上下轻轻吸液而分离。在具有5％BSA的PBS中将细胞再悬浮至浓度为1x10⁶。该细胞溶液以100μL等分试样转染至埃彭道夫管，且向合适的管添加2μL藻红蛋白标记的抗-CD32a抗体。埃彭道夫管在冰上培养30分钟。样品在1.1RPM在4℃离心5分钟且用PBS5％BSA溶液清洗2x。细胞在AccuriC6流式细胞分析仪中运行直到达到20k活细胞计数。按照制造商的说明在取样后立即进行BangsLaboratories的R-藻红蛋白珠子定量。将FL-2通道的几何平均荧光录入制造商提供的校准工作表，且计算PSMA水平。

效应细胞预处理(priming)

实验三天之前，将U937细胞(约60％融合)的板传递至新的陪替氏培养皿(总体积10mL染色的RPMI生长培养基)。添加IFN-γ(20μL，DPBS中100μg/mL)，且将细胞保持在培养箱中(37℃，24h)。24小时后将细胞成团且再悬浮于10mLIFN-γ(20μL，DPBS中的100ug/mL)且保持在培养箱中(37℃，24h)。

对于ROS产生，将细胞再悬浮于RPMI生长培养基(10mL)，且等分至两个陪替氏培养皿中。向各培养皿添加另外染色的RPMI生长培养基(5mL)和IFN-γ(20μL，DPBS中的100μg/mL)，且保持在培养箱中(37℃，24h)。

对于吞噬作用：将细胞转染至Falcon管，且添加DiD(19μL，终浓度＝1.9μM)。将细胞保持在培养箱中(37℃，30min)，成团，抽吸，再悬浮于RPMI生长培养基(10mL)，等分至两个陪替氏培养皿。向各培养皿添加另外染色的RPMI生长培养基(5mL)和IFN-γ(20μL，100μg/mLinDPBS)，且保持在培养箱中(37℃，24h)。

ROS产生测试

预处理的U937在无色的ADCP培养基中以3x10⁵U937细胞的浓度悬浮且在96孔板以90μL的体积与10⁵PSMA包被的珠子和不同浓度的分子混合。向各孔添加10μl2.5mM光泽精(TokyoChemicals)溶液以使总体积为100μl。将板在200rcf离心2分钟(PLATESPINNER)。然后将化学发光以两分钟间隔通过板读数器(BiotekSynergy2)测量60至90分钟。

分子诱导的珠子的吞噬作用的测试

·将6uMPolysciences的链亲和素fluoresbriteYG微球与4x浓度的avi-标记的PSMA在室温在DPBS中一起培养30分钟(avi-标记的PSMA的浓度取决于微球的生物素负载能力)。珠子用DPBS洗涤2x且以1.6x10⁶珠子/mL再悬浮于无色的ADCP培养基。

·吞噬作用：在埃彭道夫管中在存在或不存在分子的情况下以不同浓度将25μL珠子溶液添加至25μLADCP培养基。向其添加50μL4x10⁶/mL预处理的U937细胞，轻轻混合且然后以1.1RPM离心2分钟。打开盖子且置于培养箱中(37℃，1hr)，此时将埃彭道夫管封闭且置于冰上。将样品涡旋且在AccuriC6流式细胞分析仪上运行，总共50k计数。

·数据分析：对于各实验计数50,000事件。对向前和侧面散点图优化门控以去除碎片颗粒和细胞聚集物。在FL-2对FL-4图上计数以下群体：

群体

群体近似FL-2信号近似FL-4信号效应细胞10³-10⁴10⁵-10^6.5靶珠子10⁶-10⁷10^2.5-10⁴双阳性细胞10⁶-10⁷10⁵-10^6.5

细胞的吞噬作用测试

·靶细胞传代：实验三天之前，将靶细胞RM1.PGLS细胞的板传递至新的烧瓶。

·效应细胞预处理：实验三天之前，将U937细胞(约60％融合)的板传递至新的陪替氏培养皿(10mL染色的ADCP培养基总体积)。添加IFN-γ(20μL，100μg/mLinDPBS)，且将细胞保持在培养箱中(37℃，24h)。将细胞转染至Falcon管，且添加DiD(19μL，终浓度＝1.9μM)。将细胞保持在培养箱中(37℃，30min)，成团，抽吸，再悬浮于染色的ADCP培养基(10mL)，且等分至两个陪替氏培养皿。向各培养皿添加另外染色的ADCP培养基(5mL)和IFN-γ(20μL，DPBS中的100μg/mL)，且将细胞保持在培养箱中(37℃，24h)。

·靶细胞制备：向靶细胞(60–80％融合RM1.PGLS细胞10mL总培养基体积)的板添加DiO(20μL，终浓度＝2μM)。将细胞保持在培养箱中(37℃，30min)，抽吸，且用染色的ADCP培养基(3x10mL)洗涤。添加染色的ADCP培养基(10mL)。将细胞保持在培养箱中(37℃，2h)，分离且以0.5x10⁶细胞/mL的浓度再悬浮于无色的ADCP培养基。

·效应细胞制备：将两个培养皿的预处理的U937细胞都转移至Falcon管，成团，抽吸，再悬浮于无色的ADCP培养基(10mL)，计数，且用无色的ADCP培养基稀释，得到2x10⁶细胞/mL的终浓度。

·吞噬作用：所有条件一式三份进行。对于各实验，向无菌2mL埃彭道夫管添加无色的ADCP培养基(25μL)，其包含不同浓度的SyAM-Px或ARM-P8/Anti-DNP抗体、靶细胞(25μL＝12,500细胞)和效应细胞(50μL＝100,000细胞)，得到效应物对靶标的比例为8:1。将管手动轻摇。将细胞成团(2分钟，1100rpm)。打开管，保持在培养箱中(37℃，1h)，通过用涡旋器短暂搅动而再悬浮，且通过流式细胞术分析。

群近似FL-1信号近似FL-4信号效应细胞10³-10⁴10⁵-10^6.5靶细胞10⁶-10⁷10^2.5-10⁴双阳性细胞10⁶-10⁷10⁵-10^6.5

AmnisImagestream成像

如上进行吞噬作用测试。1小时后，在冰上将细胞固定在3％甲醛中达30分钟。细胞在DPBS中清洗一次，然后在冰上用抗-CD14-APC和抗-CD11b-APC抗体(Biolegend)染色30分钟。细胞在DPBS中清洗一次，然后通过70μm细胞过滤网。在AmnisImagestreamX流式细胞仪上收集30,000事件/样品。然后对吞噬杯形成或靶点的完全吞食进行双阳性事件手动评分。数据在AmnisIDEAS软件上分析。

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