一种调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2的应用

摘要

本发明公开了一种调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2的应用。调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2在调控植物开花中的应用。将GmPUB2基因通过植物表达载体转入目的植物内获得晚开花植物。将GmPUB2基因通过基因沉默载体转入目的植物内获得早开花植物。将目标基因GmPUB2转入拟南芥。通过与野生型拟南芥相比，证明转基因植株的抽薹及开花时间明显晚于野生型，说明GmPUB2基因有推迟植物开花的作用。利用构建的GmPUB2基因沉默载体，对过表达目标基因GmPUB2的转基因拟南芥进行沉默，证明沉默后的植株开花时间明显早于对照植株。

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2的应用。

背景技术

开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要过程，开花时间是一个重要的农艺性状，它 决定着作物是否适应于特定地区的光温及生长栽培季节。植物开花是植物从营养生长到生殖生 长转折的关键点，具有很强的可塑性。在各种外界环境和内部因子的影响下，植物会选择在适 当的时间开花而转入生殖生长。通过调节开花期，使植物延迟或提前开花，可以控制植物的营 养生长或生殖生长，避免冷害或其它逆境对作物的伤害，同时可以有效地利用土地资源，进行 合理的轮作。在最适合的时期开花可以达到最大的效益，促进光合产物的积累、分配及有效利 用，对提高作物产量意义重大。

在长期的进化过程中，植物形成了一套完整的机制，用于调节自身的生长发育以适应或抵 御外界生物和非生物胁迫。在这些进程中，E3泛素连接酶是泛素‐26S蛋白酶系统中决定识别 特异性底物的关键因子，该系统是目前已知所有真核生物体内具有高度选择性的最为重要的蛋 白质降解途径，细胞内许多生命进程的蛋白质均可被泛素化途径修饰和降解，包括生物与非生 物逆境抗性、细胞周期、信号传导和转录等。近年来，E3泛素连接酶在植物对生物和非生物 胁迫响应调控中的功能得到越来越多的研究，其在植物生长发育的调控也逐渐被人们所认知， 但未见大豆E3泛素连接酶参与调控植物开花的报道。因此，研究大豆E3泛素连接酶基因在植 物开花调控网络中的作用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种控植物开花的大豆E3泛素连接酶基 因GmPUB2。

本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白。

本发明的又一目的是提供该基因的应用。

调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2在调控植物开花中的应用。

调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2在培育晚开花植物中的应用。具体是将 GmPUB2基因通过表达载体转入目标植物内。所述植物优选是模式植物拟南芥。所述GmPUB2 基因cDNA核甘酸序列如SEQIDNO.1所示。

调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2在培育早花植物中的应用。具体是将 GmPUB2基因通过沉默载体转入目标植物内。所述植物优选是模式植物拟南芥。

含有所述的调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2的表达载体在培育晚开花植 物中的应用。本发明提供了含有上述大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2的表达载体 pMDC83‐CaMV35S‐GmPUB2。将GmPUB2基因克隆到pMDC83，获得pMDC83‐CaMV35S‐GmPUB2。

GmPUB2基因的沉默载体在培育早开花植物中的应用。本发明提供了含有上述大豆E3泛 素连接酶基因GmPUB2的沉默载体TRV：GmPUB2。将GmPUB2基因构建到TRV介导的沉默载 体中，获得TRV：GmPUB2。

本发明的有益效果：

利用现有的植物基因工程技术，并通过根癌农杆菌介导的子叶节转化法将目标基因 GmPUB2转入拟南芥。通过与野生型拟南芥相比，证明转基因植株的抽薹及开花时间明显晚于 野生型，说明GmPUB2基因有推迟植物开花的作用。利用构建的GmPUB2基因沉默载体，对 过表达目标基因GmPUB2的转基因拟南芥进行沉默，证明沉默后的植株开花时间明显早于对 照植株。

附图说明

图1转GmPUB2基因拟南芥目标基因的检测

WT为野生型植株，L1、L2、L3和L4为转基因株系。

图2野生型植株和转基因株系中GmPUB2的表达量对比

WT为野生型植株，L1、L2、L3和L4为转基因株系，GmPUB2/ACT表示大豆基因GmPUB2的荧 光定量表达量与拟南芥内参基因Actin表达量的比值。

图3野生型拟南芥与转GmPUB2基因拟南芥的抽薹情况对比

图中上中下3层分别表示野生型拟南芥与GmPUB2转基因拟南芥在第26天、第27天和第28 天的抽薹情况。

图4野生型拟南芥与转GmPUB2基因拟南芥第25天的开花情况

WT为野生型植株，L3和L4为转基因株系，白圈标记的是第25天野生型植株和转基因株系已 开花的植株。

图5转基因拟南芥中的GmPUB2基因沉默后的开花时期

空白对照表示未作任何处理的转基因拟南芥，沉默空载对照表示转基因拟南芥用空白沉默载体 进行处理，沉默GmPUB2基因表型指转基因拟南芥用含有目标基因的沉默载体进行处理后的 表现情况。

图6转GmPUB2基因拟南芥和转基因拟南芥GmPUB2沉默株系中GmPUB2的表达量检测

CK为转基因拟南芥植株，VIGS为转基因拟南芥沉默株系，GmPUB2/ACT表示大豆基因GmPUB2 的荧光定量表达量与拟南芥内参基因Actin表达量的比值。星号代表差异的显著性(*P<0.05； **P<0.01)

具体实施方式(结合附图具体说明)

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：GmPUB2基因的获得

1.RNA提取：

(1)样品处理：采集约100mg的大豆叶片组织在液氮中磨碎，加入1mL裂解液RZ，晃动混 匀。

(2)将匀浆样品在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

(3)4℃，12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。

(4)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。

(5)4℃，12000rpm离心10min，样品会分成三层：RNA主要在水相中，把水相转移到新管 中，进行下一步操作。

(6)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀后转入吸附柱CR3中，4℃，12000rpm离心30sec， 弃掉收集管中的废液。

(7)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液，将CR3 放入收集管中。

(8)向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30sec， 弃废液。

(9)重复操作步骤8

(10)将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min，去除残余液体。

(11)离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻，以充分晾干。

(12)将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加65μlRNase‐FreeddH₂O，室温放置2min， 4℃，12000rpm离心2min。收集溶解的RNA，保存于‐80℃备用。

2.cDNA的合成：

(1)取‐80℃保存的RNA(≤2μg)冰上溶解。配置下列反应体系：

(2)轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:

37℃15min(反转录反应)

85℃5sec(反转录酶的失活反应)

4℃2min

(3)‐20℃保存备用。

3.cDNA的克隆

(1)PCR扩增

根据大豆的全基因数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，利用Primer5.0 软件设计特异性引物：上游引物F1：5'‐GATACATAGAAACAATCGAAATTA‐3'(SEQIDNO.3)，下 游引物R1：5'‐CTGTTTCTACCAATATGACCT‐3'(SEQIDNO.4)。

以大豆cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

按照下列条件进行PCR反应：

(2)PCR克隆

利用克隆载体pMD19‐Tvertor具有T‐粘性末端、Taq酶扩增产物具有A‐粘性末端的特性， 可将大目标基因PCR扩增纯化产物和pMD19‐Tvertor连成环状质粒。其反应体系如下：

16℃反应过夜，转化至大肠杆菌感受态细胞中进行培养。

挑取单菌落进行扩大培养，经菌液PCR扩增鉴定阳性后，送深圳华大科技股份有限公司进 行测序。测序结果表明该基因是具U‐box结构域的E3泛素连接酶基因，命名为GmPUB2(Glycine maxplantU‐box2,GmPUB2)。通过NCBI数据库序列比对，GmPUB2基因登录号为 XM_003544928，全长为1885bp，SEQIDNO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

实施例2：植物表达载体的构建

1.attB‐GmPUB2产物的获得

根据Gateway体系，在扩增目标基因的特异引物5’端加接头attB1及attB2，然后以KOD 聚合酶进行DNA扩增，扩增得到带接头(attB)的目的基因全长片段。

attB1+GmPUB2F2：5'‐GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT‐3'(SEQIDNO.5)

attB2+GmPUB2R2：5'‐GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT‐3'(SEQIDNO.6)

以大豆cDNA为模板，用attB1+GmPUB2F2及attB2+GmPUB2R2作为上下游引物进行PCR 扩增，PCR条件为94℃2min，94℃30sec，68℃2min，35个循环，68℃5min。PCR产物送 至华大基因进行测序验证后，用1.0％琼脂糖凝胶分离分析，回收目的片段并纯化。

2.入门质粒pDONOR‐GmPUB2的构建

上述纯化片段的两段分别带有attB1及attB2序列，其序列在BPclonase酶的催化作用下 与pDONOR入门载体上的attP序列发生位点特异性重组，生成attL序列，把目的基因整合到 pDONOR入门载体中。BP反应体系如下：

25℃反应2h后，向反应体系中加入1μl的K蛋白酶溶液，37℃孵育10min以终止反应。 所得产物用热激法转化入大肠杆菌感受态DH5α之中，涂板于带有50μg/mLKanamycin的LB 培养基上以筛选阳性克隆。用attB1+GmPUB2F2及attB2+GmPUB2R2作为上下游引物进行PCR 扩增检测挑选的单克隆中是否含有目的基因片段；然后将单克隆菌液送华大基因进行测序比 对，获得阳性重组克隆pDONOR‐GmPUB2。

3.重组质粒pMDC83‐GmPUB2构建

提取pDONOR‐GmPUB2质粒，使用LRclonase将GmPUB2交换到目的载体pMDC83中，构 建重组质粒pMDC83‐GmPUB2。LR反应体系如下：

25℃反应4h后，所得产物用热激法转化入大肠杆菌感受态DH5α之中，涂板于带有50 μg/mLKanamycin的LB培养基上以筛选阳性克隆。用GmPUB2的上游引物F1及GmPUB2的下 游引物R1作为引物进行PCR扩增检测挑选的单克隆中是否含有目的基因片段；且同时提取质 粒判断载体片段大小。挑选PCR产物片段大小和载体片段大小均正确的单克隆，从载体花椰菜 病毒启动子35S片段开始向3’方向测序两个反应，所得序列与GmPUB2基因序列进行比对验 证，构建成功重组质粒pMDC83‐GmPUB2。

实施例3：转化拟南芥及转基因功能验证

1.pMDC83‐GmPUB2载体转化农杆菌

提取pMDC83‐GmPUB2质粒，与农杆菌EHA105混匀，用冻融法转化。在含有50mg/L的 Rif和50mg/L的Kan的LB培养基上进行阳性克隆的筛选。之后用GmPUB2的上游引物F1及 GmPUB2的下游引物R1作为引物进行PCR扩增检测挑选的单克隆中是否含有目的基因片段。 经验证后的克隆菌体扩繁后‐80℃保存待用。

2.拟南芥的遗传转化

(1)种子消毒：将拟南芥野生型种子泡在含有1mL去离子水的1.5mL离心管中，放置于 4℃中2d后取出，在超净台中先用灭菌水洗两遍，吸走水。向离心管中加入75％酒精，放置 30sec后吸走酒精。用灭菌水洗两遍，再加10％的双氧水于离心管，静置10min。用灭菌水洗 两遍。加入1mL灭菌水。

(2)将消过毒的拟南芥种子播种于MS固体培养基上，光培箱中生长，条件为：16h光照 (24℃)/8h黑暗(22℃)，湿度70％，培养7‐10d。

(3)将营养土、蛭石灭菌后按1:3混合置于盆钵中，用Hoagland营养液进行浇灌。然后 将拟南芥苗移栽入盆钵之中，裹上保鲜膜保持湿度2d，放入光照培养箱中生长。

(4)4周后拟南芥开始开花，剪去开放的花，在侵染前的一天给拟南芥浇透水。

(5)挑取含有pMDC83‐GmPUB2载体的农杆菌单克隆于10mL含有50mg/L的Rif和50mg/L 的Kan的液体YEB培养基中，28℃，180rpm培养24h。

(6)取1mL上述菌液倒入200ml含有50mg/L的Rif和50mg/L的Kan液体YEB培养基中， 28℃，160rpm培养至OD₆₀₀＝2.0。5000rpm离心15min弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于含有5％ 蔗糖和0.05％的SilwetL‐77的渗透培养基中，使OD₆₀₀＝0.8。

(7)用枪头吸取上述侵染混合物于花蕾上使液滴挂在花蕾上，保湿暗培养10h。2d内生 长坏境保持高湿度。一周后恢复正常生长环境。

(8)按照上述方法根据花期重复侵染数次。收取T0代种子。

3.转基因拟南芥的筛选和纯合

将野生型拟南芥种子和转基因拟南芥种子经过消毒后播种于含有40mg/L潮霉素(Hyg) 的MS固体培养基上。在长日照光培箱中生长10d。野生型拟南芥的根生长受到抑制，叶片逐 渐发黄，植株死亡。而转基因拟南芥阳性植株具有潮霉素抗性，能够在具有潮霉素的MS培养 基上正常生长。选取正常生长的阳性植株，移栽至盆钵中放置于长日照光培箱中种植。至植株 结荚，收获种子T1代。将T1代种子在含有潮霉素的MS培养基上进行筛选，获得阳性植株， 然后单株种植，单株收获T2代，每个转基因系中收取的T2代单株种植单株收获获得T3代。 在含有潮霉素的MS培养基上播种每个T2代植株对应的T3代种子，若出现阳性植株和野生型 植株分离则说明对应T2单株为杂合的转基因植株；若出现全板都是阳性植株的，则获得T3 代纯合阳性植株。移栽T3代拟南芥于盆钵中。

4.转基因拟南芥的分子生物学检测

(1)转基因拟南芥的PCR检测

移栽野生型拟南芥和转基因T3代拟南芥于盆钵中，待拟南芥植株生长4周时，提取转基 因T3代拟南芥叶片的DNA和RNA，将RNA反转为cDNA，用用GmPUB2的上游引物F1及GmPUB2 的下游引物R1对DNA和cDNA进行扩增检测，检测确定转基因阳性株系(图1)。

(2)转基因拟南芥的qRT‐PCR检测

选择不同株系的转基因拟南芥T3植株，全株提取总RNA，反转为cDNA作为模板，使用 GmPUB2特异的引物进行荧光定量鉴定(图2)。

qGmPUB2–F3：5'‐GTGTGACTTGTGAAAGGTTTGTGGA‐3'(SEQIDNO.7)

qGmPUB2–R3：5'‐ACTCAACTCAGACACCCTCAAAAGC‐3'(SEQIDNO.8)

5.转基因拟南芥抽薹开花时间的调查

将野生型拟南芥和转GmPUB2基因拟南芥的种子4℃处理和灭菌消毒后，播种于MS培养 基上，光培箱中生长，条件为：16h光照(24℃)/8h黑暗(22℃)，培养7d后，移苗于含有 营养土、蛭石1:3混合的盆钵中，用Hoagland营养液进行浇灌。长光照下统计每天的抽薹率 和开花率。结果显示转基因拟南芥出现了晚抽薹的现象(图3)，大多数转基因拟南芥株系比 野生型拟南芥普遍晚抽薹，也导致了开花被推迟的现象(图4)。

实施例4：转GmPUB2基因拟南芥的沉默及功能验证

1.沉默载体的构建

大豆叶片总RNA的提取方法参照TIANGENRNAsimpleTotalRNA试剂盒的操作指南进行， cDNA的合成按照TaKaRaRNAPCR^TMKIT(AMV)Ver.3.0操作指南进行。按照引物扩增GmPUB2的 目的片段。

Si‐GmPUB2‐F4：5'‐CCGGAATTCGGGTTGTTGATTGAGAAGAA‐3'(SEQIDNO.9)

Si‐GmPUB2‐R4：5'‐CGCGGATCCCGCATCAACCAAACCCAATT‐3'(SEQIDNO.10)

反应体系为：

反应条件为95℃5min；95℃30sec，53℃30sec，72℃1min，36个循环；72℃5min。 琼脂糖凝胶电泳检测、回收、TA克隆。通过菌落PCR验证阳性克隆，并将阳性克隆送至华大 基因进行测序。测序正确的质粒用EcoRI和BamHI双酶切，并用T4连接酶与酶切后的pTRV:RNA2 载体4℃连接16h，将连接产物转化至大肠杆菌，挑取阳性克隆，提取质粒。并转入农杆菌 GV3101，‐80℃保存备用。将由pTRV：RNA1和pTRV：RNA2构成的病毒命名为TRV，由pTRV： RNA1和pTRV：RNA2：GmPUB2构成的病毒命名为TRV：GmPUB2。

2.叶片注射及表型观察

将含有TRV1和TRV2及含有目标基因的TRV：GmPUB2重组质粒的农杆菌菌株，分别接 入含有5mlLB及相应抗生素的LB培养基中，于28℃、200r/min培养过夜。吸取一定体积的 上述菌液分别加入到含有50mlYEB的三角瓶中，并向YEB溶液中加入5μl乙酰丁香酮，50μl 抗生素，500μlMES(1mmol/L)，28℃、200r/min培养过夜，至OD₆₀₀约为0.4‐2.0之间，收 集菌体。将菌体重悬于MMA溶液中，调整农杆菌悬浮液的浓度为OD₆₀₀＝2.0。将含有TRV1和 TRV2的农杆菌悬浮液等体积混合，在室温下放置1h即可用于叶片注射。此后每隔3d观察不 同处理拟南芥的表型，结果表明沉默后的拟南芥比对照提早抽薹和开花(图5)。

3.QRT‐PCR检测GmPUB2的表达

提取TRV：GmPUB2沉默后的拟南芥的根、茎、叶、花的RNA，合成cDNA，以At‐Actin 为内参，相应家系未沉默的拟南芥根、茎、叶、花的cDNA为对照，按照如下引物检测GmPUB2 的表达量。结果表明TRV介导的VIGS体系在拟南芥根、茎、叶、花中均可成功地沉默目的基 因(图6)，进一步验证了表型结果的可靠性。