一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法

摘要

一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法，本发明涉及一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法。本发明是要解决现有红松在进行体细胞胚胎发生时，胚性愈伤组织诱导率和转胚率低的问题，方法为：一、材料的灭菌；二、胚性愈伤诱导；三、愈伤组织的继代保持与增殖；四、原胚的诱导；五、体细胞胚的发育、成熟与植株再生，即完成。本发明通过培养基中各组分的合理配比与适宜的培养条件，使红松在进行体细胞胚胎发生时，胚性愈伤组织诱导率和转胚率都得到了提高，胚性愈伤组织诱导率可达到33.3％，本发明通过加入肌醇使胚性愈伤褐化程度降低，且更有助于球形胚的转化，转胚率是不加肌醇的6-8倍。本发明应用于林业领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法。

背景技术

红松(Pinuskoraiensis)是我国东北地区极其重要的优质用材树种,也是发展前景巨大 的坚果经济林树种。体细胞胚胎发生是快速繁殖和人工种子研制的基础，对遗传改良有重 要意义。进行红松体细胞胚胎发生和不定芽发生研究，既可以为其生物学研究提供有效组 培体系，又可以直接用于优良种质材料的无性扩繁。但现在进行红松体细胞发生时，胚性 愈伤组织诱导率和转胚率都较低，严重制约了红松的体细胞胚胎发生方面的研究。

发明内容

本发明是要解决现有红松在进行体细胞胚胎发生时，胚性愈伤组织诱导率和转胚率低 的问题，提供一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法。

本发明一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法按以下步骤进行：

一、材料的灭菌

将处于裂生多胚期的红松球果灭菌后，剥去种皮，再次灭菌，得到灭菌后的合子胚；

二、胚性愈伤诱导

将步骤一得到的灭菌后的合子胚接种于培养基中，在23～25℃的条件下，暗培养 58～65d，得到胚性愈伤组织，其中培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺 500mg/L+蔗糖35g/L+NAA2mg/L+6-BA1.5mg/L+酸水解酪蛋白0.8g/L；培养基pH＝5.8；

三、愈伤组织的继代保持与增殖

将步骤二得到的胚性愈伤组织进行继代培养，得到增殖后的愈伤组织；

四、原胚的诱导

将增殖后的愈伤组织接种到培养基中进行原胚的诱导，在23～25℃的条件下，暗培养 7～15d，得到带有球形胚的愈伤组织；其中培养基为DCR培养基+酸水解酪蛋白 500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2g/L+肌醇4g/L；pH＝5.8；

五、体细胞胚的发育与植株再生

将带有球形胚的愈伤组织接种到培养基中进行体胚发育，完成转胚过程，得到子叶胚； 同时对获得的子叶胚进行成熟诱导，得到成熟胚，然后进行萌发、植株再生与移栽成苗。

本发明通过培养基中各组分的合理配比与适宜的培养条件，使红松在进行体细胞胚胎 发生时，胚性愈伤组织诱导率和转胚率都得到了提高，胚性愈伤组织诱导率可达到33.3％， 本发明发现肌醇对球形胚的诱导以及后期体胚发育与成熟有重要作用，通过加入肌醇使胚 性愈伤褐化程度降低，且更有助于球形胚的转化，转胚率是不加肌醇的6-8倍。

附图说明

图1为实施例一中胚性愈伤组织的照片；

图2为实施例一中早期原胚的照片；

图3为实施例一中球形胚的照片；

图4和图5为实施例一中体细胞胚发育的照片。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法按以 下步骤进行：

一、材料的灭菌

将处于裂生多胚期的红松球果灭菌后，剥去种皮，再次灭菌，得到灭菌后的合子胚；

二、胚性愈伤诱导

将步骤一得到的灭菌后的合子胚接种于培养基中，在23～25℃的条件下，暗培养 58～65d，得到胚性愈伤组织，其中培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺 500mg/L+蔗糖35g/L+NAA2mg/L+6-BA1.5mg/L+酸水解酪蛋白0.8g/L；培养基pH＝5.8；

三、愈伤组织的继代保持与增殖

将步骤二得到的胚性愈伤组织进行继代培养，得到增殖后的愈伤组织；

四、原胚的诱导

将增殖后的愈伤组织接种到培养基中进行原胚的诱导，在23～25℃的条件下，暗培养 7～15d，得到带有球形胚的愈伤组织；其中培养基为DCR培养基+酸水解酪蛋白 500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2g/L+肌醇4g/L；pH＝5.8；

五、体细胞胚的发育与植株再生

将带有球形胚的愈伤组织接种到培养基中进行体胚发育，完成转胚过程，得到子叶胚； 同时对获得的子叶胚进行成熟诱导，得到成熟胚，然后进行萌发、植株再生与移栽成苗。

本实施方式中的红松球果采集于黑龙江省苇河林业局青山林木种子园。

本实施方式通过培养基中各组分的合理配比与适宜的培养条件，使红松在进行体细胞 胚胎发生时，胚性愈伤组织诱导率和转胚率都得到了提高，胚性愈伤组织诱导率可达到 33.3％，本实施方式发现肌醇对球形胚的诱导以及后期体胚成熟有重要作用，通过加入肌 醇使胚性愈伤褐化程度降低，且更有助于球形胚向成熟胚转化，转胚率是不加肌醇的6-8 倍。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中处于裂生多胚期 的红松球果灭菌的方法为：将红松球果洗净，然后削去种鳞，再用质量浓度为70％的酒精 处理3～5min，然后用无菌水冲洗2～4次，再用质量浓度10％次氯酸钠浸泡20～30min。其它与 具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中再次灭菌的 方法为：用质量浓度为3％的双氧水处理8min，无菌水冲洗2～4次。其它与具体实施方式一 或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中暗培养 60d。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中继代培 养的培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖30g/L+2,4-D 0.5g/L+6-BA0.1g/L+酸水解酪蛋白0.5g/L；pH＝5.8。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中继代培 养是在23～25℃的条件下，暗培养15d。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四中暗培养 12d。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤五中暗培养 70d。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤五中体胚成 熟诱导培养基为DCR培养基+琼脂7.1g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖60g/L+脱落酸 20mg/L+PEG400050g/L+IBA0.2mg/L+活性炭2g/L；pH＝5.8。其它与具体实施方式一至八 之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤五体胚成熟 诱导是在23～25℃的条件下，暗培养60～80d，每3～4周继代一次。其它与具体实施方式 一至九之一相同。

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1：本实施例提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法，按以下步骤进行：

一、材料的灭菌

将处于裂生多胚期的红松球果洗净，然后削去种鳞，再用质量浓度为70％的酒精处 理2min，然后用无菌水冲洗3次，再用质量浓度10％次氯酸钠浸泡25min，之后于超净 工作台下剥去种皮，然后用质量浓度为3％的双氧水处理8min，无菌水冲洗3次，得到灭 菌后的合子胚；

二、胚性愈伤诱导

将步骤一得到的灭菌后的合子胚接种于培养基中，在25℃的条件下，暗培养60d，得 到胚性愈伤组织，其中培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖 35g/L+NAA2mg/L+6-BA1.5mg/L+酸水解酪蛋白0.8g/L；培养基pH＝5.8；本步骤的胚性 愈伤组织的照片如图1所示，胚性愈伤组织诱导率可达到33.3％。

三、愈伤组织的继代保持与增殖

将步骤二得到的胚性愈伤组织进行继代培养，在25℃的条件下，暗培养15d，得到增 殖后的愈伤组织，其中继代培养的培养基为DCR培养基+琼脂6.5g/L+L-谷氨酰胺 500mg/L+蔗糖30g/L+2,4-D0.5g/L+6-BA0.1g/L+酸水解酪蛋白0.5g/L；pH＝5.8；

四、原胚的诱导

将增殖后的愈伤组织接种到培养基中进行原胚的诱导，在25℃的条件下，暗培养12d， 得到带有球形胚的愈伤组织；其中培养基为DCR培养基+酸水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨 酰胺500mg/+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2g/L+肌醇4g/L；pH＝5.8；本步骤过程中生 成早期原胚的照片如图2所示，球形胚的照片如图3所示。

五、体细胞胚的发育

将带有球形胚的愈伤组织接种到培养基中进行体胚发育，完成转胚过程；同时对获得 的子叶胚进行成熟诱导，在25℃的条件下，暗培养60～80d，每3～4周继代一次，得到成 熟胚，其中培养基为DCR培养基+琼脂7.1g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖60g/L+脱落酸 20mg/L+PEG400050g/L+IBA0.2mg/L+活性炭2g/L；pH＝5.8；本步骤胚发育的照片如图4 和图5所示。

六、体细胞胚的萌发与植株再生

将诱导的成熟体细胞胚水平置于萌发培养基DCR上进行萌发，附加20g/L蔗糖，L- 谷氨酰胺500mg/L，酸水解酪蛋白2g/L，先暗培养6d，再在光照度2000lx，16/8h光/暗 培养14d，对成熟体细胞胚进行萌发培养；然后采用WPM基本培养基，附加1.0mg/LIBA、 0.2mg/LNAA、20g/L蔗糖、0.1g/L肌醇和6.5/L琼脂，光照度20001x，16/8小时的光暗 培养1个月，进行体细胞胚植株再生，得到再生植株；

七、再生植株的移栽

待再生植株根伸长2cm以上后进行移栽，移栽前7d逐渐将封口膜揭开，使幼苗适 应外界的环境，移栽在采用体积比为1:3:1珍珠岩、营养土和蛭石为基质，进行移栽培养， 即完成。

本实施例中的红松球果采集于黑龙江省苇河林业局青山林木种子园。

本实施例通过加入肌醇使胚性愈伤褐化程度降低，且更有助于球形胚向成熟胚转化， 转化率是不加肌醇的6-8倍。

通过以上实施例可知，本发明通过培养基中各组分的合理配比与适宜的培养条件，使 红松在进行体细胞胚胎发生时，胚性愈伤组织诱导率和转胚率都得到了提高，胚性愈伤组 织诱导率可达到33.3％，本发明发现肌醇对球形胚的诱导以及后期体胚发育和成熟有重要 作用，通过加入肌醇使胚性愈伤褐化程度降低，且更有助于球形胚的转化，转化率是不加 肌醇的6-8倍。

以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应 涵盖在本发明的保护范围之内。