一种快速诊断活动性结核病的gamma delta T细胞表面活化分子及试剂盒

摘要

本发明公开了一种快速诊断活动性结核病的gamma？delta？T细胞表面活化分子及试剂盒。本发明首次将特异性T细胞表面分子应用于诊断活动性结核病中，包括髓系细胞诱发受体1和/或Vδ2T细胞受体。利用上述两种细胞表面分子及其相应的试剂盒可以实现对活动性结核病的快速检测，其检测方法以及检测试剂盒具有灵敏度高、特异好、操作简单和简便快捷等优点，同时价格低廉，适于推广应用。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种快速诊断活动性结核病的gammadeltaT细胞表面活化分子及试剂盒。

背景技术

结核病诊断的金标准是细菌学检查，包括痰涂片抗酸染色和结核杆菌分离培养。然而在结核病患者中，结核杆菌检出率仅为30%，意味着大部分病人为菌阴结核，难以从病原学上获得确诊。目前菌阴结核的实验室诊断很大程度上依赖于免疫学检测方法。传统的结核病免疫学检测方法包括结核菌素试验（TST）和血清结核抗体检测。TST使用结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）作为抗原，检测机体是否感染过结核分枝杆菌。虽然TST操作简便、应用广泛，但是PPD抗原是卡介苗（BCG）和其他分枝杆菌共有的抗原，无法区分自然感染与卡介苗接种。而在我国，儿童时期普遍接种卡介苗，导致TST试验容易出现假阳性结果，因此该试验的临床意义有限。结核抗体检测是应用结核杆菌蛋白抗原检测患者血清中特异性抗体的存在。由于结核分枝杆菌表面抗原数目繁多，且表达的主要抗原不固定，造成患者血清抗体产生具有明显的个体差异性。因此，任何一种单一的结核杆菌抗原都无法检测到结核病患者体内所有抗体。单独使用该方法具有阳性率低、漏诊率高的缺陷，不能满足临床需要。因此，迫切需要研究结核病新型免疫学诊断技术及产品，以期提高结核病，尤其是菌阴结核病确诊率。

发明内容

本发明的目的在于提供髓系细胞诱发受体1和/或Vδ2T细胞受体作为快速诊断活动性结核病试剂的应用。

本发明的另一目的在于提供一种用于快速诊断活动性结核病的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

髓系细胞诱发受体1（Triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells,TREM-1）和/或Vδ2T细胞受体（Vδ2TCR）作为快速诊断活动性结核病试剂的应用。

一种用于快速诊断活动性结核病的试剂盒，包括髓系细胞诱发受体1的特异性抗体和Vδ2T细胞受体的特异性抗体。

优选的，试剂盒还包括同型对照抗体，所述同型对照抗体为与髓系细胞诱发受体1的抗体相同类型、相同荧光标记的IgG。

优选的，髓系细胞诱发受体1的特异性抗体和Vδ2T细胞受体的特异性抗体的浓度为0.01～1mg/ml。

优选的，髓系细胞诱发受体1的特异性抗体和Vδ2T细胞受体的特异性抗体的浓度为0.5mg/ml。

优选的，试剂盒反应缓冲液为质量百分比浓度为1%的牛血清白蛋白溶液。

本发明的有益效果是：

本发明首次将特异性T细胞表面分子应用于诊断活动性结核病中，包括髓系细胞诱发受体1（Triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells,TREM-1）和/或Vδ2T细胞受体（Vδ2TCR）。利用上述两种细胞表面分子及其相应的试剂盒可以实现对活动性结核病的快速检测，其检测方法以及检测试剂盒具有灵敏度高、特异好、操作简单和简便快捷等优点，同时价格低廉，适于推广应用。

本发明具有较高的特异性，本发明的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内诊断活动性结核病；灵敏度高；特异性好。

附图说明

图1为本发明T细胞表面分子试剂盒对健康人和活动性结核病人外周血PBMC的检测免疫荧光结果；

图2为本发明对健康人和活动性结核病人外周血PBMC检测结果统计散点图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不局限于此。

实施例1用于快速诊断活动性结核病的T细胞表面分子试剂盒的建立

用于快速诊断活动性结核病的T细胞表面分子的试剂盒包括以下成分：（1）TREM-1的特异性荧光抗体（红色）；（2）Vδ2TCR的特异性荧光抗体（绿色）；（3）同型对照的荧光抗体；（4）反应缓冲液。

其中，反应缓冲液为1%牛血清白蛋白（BSA）的1×PBS；

TREM-1和Vδ2TCR特异性抗体浓度均是0.5mg/ml；

同型对照抗体为与TREM-1的抗体相同类型、相同荧光标记的IgG；

（阴性）同型对照为加入Vδ2TCR抗体和同型对照抗体。

具体包括如下步骤：

（1）采用淋巴细胞分离液分离PBMC，取1×10⁵～1×10⁷个细胞，加入反应缓冲液1ml，1500转/分钟离心5分钟；

（2）特异性抗体染色反应：100μl反应体系含有：PBMC为1x10⁵～1x10⁷个细胞，反应缓冲液100μl，TREM-1抗体或同型对照抗体5μl，Vδ2TCR抗体2μl，将上述反应管于冰上（0～4℃）避光孵育30分钟。加入反应缓冲液1ml，1500转/分钟离心5分钟，重复3次；

（3）缓冲液500ul重悬细胞，流式分析仪或荧光显微镜检测；

（4）结果判定：以同型对照抗体作为阴性，判断非特异性染色，如果没有明显染色效果（红色），即说明非特异染色可以忽略，下面计数阳性细胞。计算TREM-1和Vδ2TCR双阳性细胞占Vδ2TCR单阳性细胞的百分比，结果大于20%为活动性结核病患者。

免疫荧光结果见图1。图1为T细胞表面分子试剂盒对健康人和活动性结核病人外周血PBMC的检测结果，其中荧光显微图中，绿色荧光：Vδ2TCR，红色荧光：TREM-1，黄色荧光：双阳性。也就是说TREM-1和Vδ2TCR双阳性的黄色荧光细胞数与Vδ2TCR阳性的绿色荧光细胞数的百分比如果大于20%为活动性结核病患者，如果小于或者等于20%的为健康人。

实施例2临床小样本验证试剂盒的检出率

收集受试对象外周血，包括健康人42例和活动性结核病人76例。分离外周血单个核细胞（PBMC）。采用本发明试剂盒检测。

用于快速诊断活动性结核病的T细胞表面分子的试剂盒包括以下成分：（1）TREM-1的特异性荧光抗体；（2）Vδ2TCR的特异性荧光抗体；（3）同型对照的荧光抗体；（4）反应缓冲液。

其中，反应缓冲液为1%牛血清白蛋白（BSA）的1×PBS；

TREM-1和Vδ2TCR特异性抗体浓度均是0.5mg/ml；

同型对照抗体为与TREM-1的抗体相同类型、相同荧光标记的IgG；

（阴性）同型对照为加入Vδ2TCR抗体和同型对照抗体。

具体包括如下步骤：

（1）采用淋巴细胞分离液分离PBMC，取1×10⁵～1×10⁷个细胞，加入反应缓冲液1ml，1500转/分钟离心5分钟；

（2）特异性抗体染色反应：100μl反应体系含有：PBMC为1x10⁵～1x10⁷个细胞，反应缓冲液100μl，TREM-1抗体5μl或同型对照抗体5μl，Vδ2TCR抗体2μl，将上述反应管于冰上（0～4℃）避光孵育30分钟。加入反应缓冲液1ml，1500转/分钟离心5分钟，重复3次；

（3）缓冲液500ul重悬细胞，流式分析仪或荧光显微镜检测；

（4）结果判定：以同型对照抗体作为阴性，判断非特异性染色，如果没有明显染色效果，即说明非特异染色可以忽略，下面计数阳性细胞。计算TREM-1和Vδ2TCR双阳性细胞占Vδ2TCR单阳性细胞的百分比，结果大于20%为活动性结核病患者。统计结果图见图2。

图2为本发明对健康人和活动性结核病人外周血PBMC检测结果。统计散点图中白圆点代表健康人；黑圆点代表活动性结核病人。其中76例活动性结核病人的结果大于20%，而42例健康人的结果小于20%，准确率达到100%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。