一种检测水产品中6种含硫类致嗅物质的方法

摘要

本发明提供一种检测水产品中6种含硫类致嗅物质的方法，本发明的检测方法操作简便快速，灵敏度高，水产品基质下其检出限可达2ppb以下，其回收率及重复性能满足日常检测的要求，采用基质分散法净化样品，有效地减少了基体成分的干扰，而且，本方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率，高质量精确度及可行的线性范围，利用气相色谱质谱定性定量的功能，对水产品中含硫类致嗅物质进行检测，大大地减少了假阳性等误判事件，极大地提高了检测机构对水产品风险的监测能力，经检测后的水产品更为卫生安全。

说明书

技术领域

本发明属于水产品检测技术领域，具体涉及一种检测水产品中6种含硫类 致嗅物质的方法。

背景技术

含硫类致嗅物质多为挥发性含硫化合物(volatilesulfurcompounds，VSC)， 主要包括硫化氢(hydrogendisulfide,H2S)、甲硫醇(methanethiol，MT)、羰基 硫(carbonylsulfide，COS)、甲硫醚(dimethylsulfide，DMS)、二硫化碳(carbon disulfide，CS2)、二甲二硫(dimethyldisulfide,DMDS)、二甲三硫(dimethyl Trisulfide，DMTS)和二甲四硫(dimethyltetrasulfide，DMTeS)，其嗅阈值(odor thresholdconcentration，OTC)一般都很低，即使以很低的浓度存在于环境及水 生动物体内也会产生嗅味问题。当含硫类致嗅物质通过食物链被水产动物摄食 而进入体内，并蓄积达到一定限量后，会导致水产品产生明显的异味，引起消 费者明显的不适应。另外，大部分含硫类致嗅物质有较强的毒性，即使很低的 浓度，也能造成对人呼吸系统的损害，在高浓度条件下暴露危害最大,可以导 致昏迷。此外，硫化氢可与人体内细胞色素、氧化酶及该类物质的二硫键作用， 影响细胞氧化过程,造成细胞组织缺氧,危及人类的生命。因此，提供一种有效 检测水产品中6种含硫类致嗅物质的方法就非常重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种操作简便 快速、能有效地减少了基体成分的干扰、高灵敏度、高分辨率，利用气相色谱- 质谱定性定量的功能，对水产品中挥发性含硫类致嗅物质进行检测。

本发明检测水产品中6种含硫类致嗅物质的方法，其步骤如下：

1)对标准品的配置：

准确称量6种含硫类致嗅物质的标准品用正己烷溶解来配置标准品溶液， 优选标准品溶液的浓度为10ng/ml-1000ng/ml；

2)待检测样品前处理：

取待检测的水产品样品粉碎后，加入正己烷进行超声提取30min，提取结束 后低温条件下离心分出有机相；

作为优选，超声提取时保持温度在30℃以下；

3)测定：

标准品通过顶空进入质谱，进行一级准确质量数的采集，扫描采集参数；其 中顶空条件为平衡温度110℃，平衡时间15min；进样针温度120℃，传输线温 度130℃；顶空瓶压力172kPa，加压时间3min，进样时间0.05min，干吹2min， 分流进样，分流比5:1；

色谱条件如下：

色谱柱为60m×0.4mm×0.32μm的DB-1柱；升温程序：起始温度40℃，保 持3min，以10℃/min升温至110℃，再以15℃/min升温至200℃，再以40℃/min 升温至240℃；进样口温度：250℃；载气为氦气He(纯度>99.999％)；隔垫吹 扫流量：3ml/min；进样模式：不分流进样；进样量1.0μl；

质谱条件：

离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；接口温度：240℃；电离方式为 电子轰击(EI)离子源；电子能量为70eV；电子倍增器电压为1671V；SIM采 集模式，扫描质量范围：40～350m/z；阈值：150；采样频率：2；溶剂延迟：4 min。

4)选取不同种类的水产品粉碎后，加入正己烷进行超声提取30min，提取结 束后低温条件下离心分出有机相；然后对有机相按照步骤3)进行测定，确定是 否含有含硫类致嗅物质。

所述的6种含硫类致嗅物质，是硫化氢(hydrogendisulfide,H2S)、甲硫醇 (methanethiol，MT)、甲硫醚(dimethylsulfide，DMS)、二硫化碳(carbon disulfide，CS2)、二甲二硫(dimethyldisulfide,DMDS)、二甲三硫(dimethyl Trisulfide，DMTS)。

通过上述优化建立水产品中含硫类致嗅物质快速、高效、灵敏的检测方法。 现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的检测方法操作简便快速，灵敏度 高，水产品基质下其检出限可达2ppb以下，其回收率及重复性能满足日常检测 的要求，采用基质分散法净化样品，有效地减少了基体成分的干扰，而且，本 方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率，高质量精确度及可行的线性范围，利 用气相色谱质谱定性定量的功能，对水产品中含硫类致嗅物质进行检测，大大 地减少了假阳性等误判事件，极大地提高了检测机构对水产品风险的监测能力， 经检测后的水产品更为卫生安全。

附图说明

图1：6种含硫类致嗅物质标准品的气相色谱-质谱总离子流图(浓度为 200ng/ml)；

图2：H₂S选择性离子色谱图A和扫描质谱图B(9.671min)；

图3：MT选择性离子色谱图A和扫描质谱图B(10.775min)；

图4：DMS选择性离子色谱图A和扫描质谱图B(12.405min)；

图5：CS₂选择性离子色谱图A和扫描质谱图B(14.137min)；

图6：DMDS选择性离子色谱图A和扫描质谱图B(14.389min)；

图7：DMTS选择性离子色谱图A和扫描质谱图B(14.658min)。

图8：6种含硫类致嗅物质标准品水产品机制下的气相色谱-质谱总离子流图 (浓度为2ng/ml)

具体实施方式

申请人在长期的研究中对各个步骤和理化参数进行了优化，从而使本发明 的方法可以在一次反应中精确的检测6种含硫类致嗅物质(硫化氢、甲硫醇、 甲硫醚、二硫化碳、二甲二硫、二甲三硫)，从而促成了本发明。

下面首先对本发明方法的所使用的仪器、试剂和方法进行如下的解释：

1.主要仪器

气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)，AgilentGC7890A/MS5975C，美国Agilent 公司，配备顶空进样器、增强型化学工作站；高速组织捣碎机，DS-1，上海标 本模型厂；高速冷冻离心机，SERJSE09L31，USA；数控超声波清洗器， KQ5200DE，昆山市超声波仪器有限公司；数显型漩涡混合器，美国Talboys。

2.试剂

正己烷：色谱纯；标准品：含硫类致嗅物质(纯度98.0％)；硫化氢(hydrogen disulfide,H2S)、甲硫醇(methanethiol，MT)、甲硫醚(dimethylsulfide，DMS)、 二硫化碳(carbondisulfide，CS2)、二甲二硫(dimethyldisulfide,DMDS)、二 甲三硫(dimethylTrisulfide，DMTS)由上海安谱公司提供。

3.顶空条件

平衡温度110℃，平衡时间15min；进样针温度120℃，传输线温度130℃； 顶空瓶压力172kPa，加压时间3min，进样时间0.05min，干吹2min，分流进样， 分流比5:1。

4.色谱条件

色谱柱：DB-1，60m×0.4mm×0.32μm；升温程序：起始温度40℃，保持 3min，以10℃/min升温至110℃，再以15℃/min升温至200℃，再以40℃/min 升温至240℃；进样口温度：250℃；载气：He(纯度>99.999％)；隔垫吹扫流 量：3ml/min；进样模式：不分流进样；进样量1.0μl。

5.质谱条件

离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；接口温度：240℃；电离方式： 电子轰击(EI)离子源；电子能量：70eV；电子倍增器电压：1671V；SIM采集 模式，扫描质量范围：40～350m/z；阈值：150；采样频率：2；溶剂延迟：4min。

上述条件下，6种含硫类致嗅物质的保留时间和定性定量离子如表1所示。

表16种含硫类致嗅物质的保留时间和定性定量离子表

﹡下划线标注的为定量离子

实施例1：

1)标准溶液制备

分别准确称取6种含硫类致嗅物质标准品0.1g(精确到0.0001g)，用正己 烷定容至50ml，得到含硫类致嗅物质标准储备液，浓度为2.0mg/ml。准确移取 上述标准储备液，以正己烷逐级稀释配制含硫类致嗅物质：10ng/ml、50ng/ml、 100ng/ml、200ng/ml、1μg/ml系列混合标准工作溶液。

2)样品制备

称取粉碎的水产品样品5.0g，置于50ml具塞离心管中，加入5ml正己烷， 于混合器上涡旋混匀1min，超声提取30min(保持温度在30℃以下)，低温条件 下离心10min，分出有机相，再提取2次，每次5ml正己烷，合并有机溶剂相放 入顶空瓶。

3)测定

首先通过优化的顶空条件，色谱条件及质谱条件，用气相色谱质谱联用技 术对标准品进行检测，建立一个准确的检测方法。

顶空条件为平衡温度110℃，平衡时间15min；进样针温度120℃，传输线 温度130℃；顶空瓶压力172kPa，加压时间3min，进样时间0.05min，干吹2min， 分流进样，分流比5:1；

实验考察了不同极性的气相色谱柱：非极性柱DB-5MS(30m×0.250 mm×0.25μm)、强极性柱DB-WAX(30m×0.250mm×0.25μm)、DB-1(60 m×0.4mm×0.32μm)对6种待测含硫类致嗅物质分离的影响。结果表明：选用 非极性柱和极性柱时，含硫类致嗅物质的色谱峰与溶剂峰分不开，其它待测物 质色谱峰分离度也欠好；而选用强极性柱DB-1时，获得的色谱峰峰形对称、定 量准确、重现性好、分离效果好。因此，本试验选用DB-1作为色谱柱。

柱温升温速率的优化

由于硫化氢、甲流醇出峰时间比较接近，同时为了排除溶剂峰对分离的影 响，因此需要优化柱温的升温速率，以获得最佳分离效果。选择柱温起始温度 为40℃，分别比较了升温速率为15℃/min、10℃/min、5℃/min时分离效果，实 验结果显示：当升温速率为15℃/min时，溶剂峰与硫化氢的色谱峰分离不明显； 当升温速率为10℃/min时，能够有效分离，而继续降低升温速率为5℃/min时， 色谱峰的分离效果没有明显改善，因此选择升温速率为10℃/min。当柱温升高 到110℃时，硫化氢的色谱峰已出峰，因此为了提高分析速度，将升温速率提高 为15℃/min。当柱温升高到200℃时，待测物质均已出峰，因此将柱温升温速率 提高到40℃/min。因此，最终选择柱温为：起始温度40℃，保持3min，以10℃ /min升温至110℃，之后以15℃/min升温至200℃，再以40℃/min升温至240℃。

最终确定色谱条件为色谱柱：DB-1，60m×0.4mm×0.32μm；升温程序：起 始温度40℃，保持3min，以10℃/min升温至110℃，再以15℃/min升温至200℃， 再以40℃/min升温至240℃；进样口温度：250℃；载气：He(纯度>99.999％)； 隔垫吹扫流量：3ml/min；进样模式：不分流进样；进样量1.0μl；

质谱条件为离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；接口温度：240℃； 电离方式：电子轰击(EI)离子源；电子能量：70eV；电子倍增器电压：1671V； SIM采集模式，扫描质量范围：40～350m/z；阈值：150；采样频率：2；溶剂 延迟：4min。

4)确证：分子特征提取：对原始数据进行处理并结合数据库进行匹配， 采用质谱进行分析，然后自动生成确证结果，对阳性制备样品保留时间结合离 子源进一步确证。

按照上述优化条件，对6种含硫类致嗅物质混合标样分析，得到标准品的保 留时间和特征离子如表1所示，气相色谱-质谱总离子流图如图1所示(浓度为 200ng/ml)。

采用上述的方法对配制好的含硫类致嗅物质系列混合标准工作溶液进行 GC/MS测定分析。每个质量浓度的样品测定3次，利用定量离子峰面积绘制标 准曲线，以目标物的峰面积(Y)对其质量浓度(X，ng/ml)进行线性回归，得 到各含硫类致嗅物质的线性方程、相关系数和线性范围如表2，6种含硫类致嗅 物质的选择性离子色谱图和扫描质谱图见图2、图3、图4、图5、图6和图7。

表2：6种挥发性含硫类致嗅物质线性方程、相关系数、线性范围及检测限

实施例2：对水产品的检测

1)标准溶液制备

分别准确称取6种含硫类致嗅物质标准品0.1g(精确到0.0001g)，用正己 烷定容至50ml，得到含硫类致嗅物质标准储备液，浓度为2.0mg/ml。准确移取 上述标准储备液，以正己烷逐级稀释配制含硫类致嗅物质：10ng/ml、50ng/ml、 100ng/ml、200ng/ml、1μg/ml系列混合标准工作溶液。

2)样品前处理

分别选用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯对样品进行前处理，实验结果表明：正 己烷提取效果最好，因此，选择正己烷提取样品中的含硫类致嗅物质。

选取不同种类的水产品粉碎后，加入正己烷进行超声提取30min，提取结束 后低温条件下离心分出有机相；

作为优选，超声提取时保持温度在30℃以下。加入一定浓度的标准品进行 检测分析比较。

3)测定

通过优化的顶空条件，色谱条件及质谱条件，用气相色谱质谱联用技术对 标准品进行检测，建立一个准确的检测方法。对建立的方法对可疑样品，用正 己烷超声萃取，气相色谱分离，外标法定量测定，并检测分析水产品中的加标 回收率。

4)确证

对原始数据进行处理并结合数据库进行匹配，采用质谱进行分析，然后自 动生成确证结果，对阳性制备样品保留时间结合离子源进一步确证。

由表2可知，本方法重现性好，线性范围广，相关系数达0.995以上，其灵 敏度高，检测限低，达到ppb级。

取鱼样品进行加标回收试验，加混合标样200ng/ml，各进行6次样品测定， 同时做空白样试验，检测其本底成分，结果见表3。

表3：回收率及精密度(n＝6)

﹡N.D代表检测的浓度低于定量限

由表3可知，本试验采用的样品处理方法，能够达到国家标准规定的要求。

综上，本发明的气相色谱质谱联用技术检测水产品中6种含硫类致嗅物质的 方法操作简便快速，灵敏度高，其回收率及重复性能满足日常检测的要求。采 用正己烷超声萃取样品，有效地减少了基体成分的干扰。而且，该方法具有高 通量、高灵敏度、高分辨率、高质量精确度及可行的线性范围，可利用质谱定 性的功能，对含硫类致嗅物质进行检测，大大地减少了假阳性等误判事件，极 大地提高了检测机构对水产品风险的监测能力。结果表明，6种含硫类致嗅物质 在10～1000ng/mL范围内线性关系良好，r均大于0.991，相对标准偏差(n＝6)均 小于10％。该方法简单、灵敏度高、分析时间短，适用于水产品中6种挥发性含 硫类致嗅物质的实际检测分析。