突变型蓝绿藻及提升蓝绿藻的光合生长及生质生产的方法

摘要

本发明公开了突变型蓝绿藻及提升蓝绿藻的光合生长及生质生产的方法。具体地，本发明关于一种突变型蓝绿藻以及藉由使用该蓝绿藻提升蓝绿藻的光合生长及/或生质生产的方法。本发明的突变型蓝绿藻表现出提升的光合生长与生质生产，其因此可能在用于各种应用的生质生产上具有价值。

说明书

相关申请案

依据35U.S.C.§119，本申请案享有美国临时申请案的优先权(申请日：2014年8月7号；申请号：62/034,337)，其中所有内容皆引入本文以参酌。

技术领域

本发明关于一种突变型蓝绿藻以及藉由使用该蓝绿藻提升蓝绿藻的光合生长及/或生质生产的方法。

背景技术

光系统II(PhotosystemII，PSII)为一种在植物与蓝绿藻的类囊体膜内的大的膜蛋白复合物[1-4]。其利用光能量在腔侧上氧化水以及在该类囊体膜的基质侧上减少色素体醌(plastoquinone，PQ)[1-4]。然而，在光过量的情况下，光系统II(PSII)为光合装置的光诱导损伤的主要目标[5,6]。为了避免这个问题，光合生物体已发展出数种不同且复杂的光保护机制以确定其在光过量的情况下可以生存[5,6]。在高等的植物中，过量的光能量在PSII光捕捉天线(light-harvestingantenna，LHCII)中被消耗为热，而减少达到反应中心的激发能量的量且保护PSII免于光损害。这个过程(也称为非光化学荧光淬熄(nonphotochemicalfluorescencequenching，NPQ))涉及叶黄素循环的活化以及LHCII的构型改变，其透过在PSII的腔内ΔpH的形成来控制[5,6]。相较之下，蓝绿藻使用藻胆体作为天线以捕捉太阳光。许多蓝绿藻发展出一种独特的蓝绿光诱导的NPQ机制以应对高光逆境[8-10]。当暴露在高强度的白光或蓝光下，可溶性橙色类胡萝卜素蛋白(orangecarotenoidprotein，OCP)将会历经光转换成活化的红色形式。该红色形式的OCP可与藻胆体的别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)核心交互作用且诱发在该藻胆体上消耗过多激发能量为热的NPQ效应，从而保护PSII反应中心对抗光损伤(7-17)。在这个过程中，OCP作为光传感器、讯号传播子以及能量淬熄剂。当蓝光或白光的强度降低，在红色形式的OCP与该藻胆体的APC核心之间的连结在荧光恢复蛋白(fluorescencerecoveryprotein，FRP)的帮助下被释放。FRP与该红色形式的OCP的C端区域交互作用且加速其转换成橙色形式且自该藻胆体分离以停止该NPQ过程(14)。与在高等植物以及藻类中的光保护机制相反，到目前为止并无证据显示在蓝绿藻中的OCP调节的光保护机制中有PSII的回馈调节。

从来自细长嗜热性聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)这种蓝绿藻的PSII的分辨率x射线晶体结构模型显示一种新发现的PQ分子(QC)及其扩散渠道[3,18]。头部基团的QC分子位于一个由脂类的尾部、QB及一个Car分子包围的非常疏水的空腔中；QC分子的尾部座落在一疏水性通道中，由细胞色素(cytochrome，Cyt)b559α以及β次单位(分别由psbE以及psbF基因编码)的跨膜螺旋以及PsbJ所围绕，PsbJ朝向类囊体膜的内部空间开放[3,18]。提出由PQ(或PQH2)占领这个QC位置是为了从池中的QB位置上交换PQ/PQH2[3,18]或为了调节氧化还原电位与细胞色素b559的反应[3,18-20，不同的看法亦参阅参考文献21]。此外，该QC位置还被提议作为细胞色素b559的PQH2氧化酶活性的催化位置[22-29]。然而，在来自火神嗜热性聚球藻(T.vulcanus)的PSII的近期分辨率晶体结构模型中则未观察到占领该QC位置[2]。QC的功能仍然未定。

PCT专利申请案WO2012/092033描述了通过中断至少一种类胡萝卜素的生产及/或减少至少一种类胡萝卜素结合蛋白的表现来中断NPQ过程，以在光合微生物中增强生质生产，并推测还原NPQ可造成有较高光子的比例为产生生质的光化学与生化途径提供能量。然而，已有报告显示，蓝绿藻的光活性橙色类胡萝卜素蛋白除了具有能量淬熄功能外，在类囊体膜中的单线氧淬熄剂中具有新的功能(Sedoud等人，植物细胞期刊(2014年)26,1781-1791)。因此，通过于蓝绿藻内中断至少一种类胡萝卜素的生产及/或减少至少一种类胡萝卜素结合蛋白的表现来中断NPQ过程可能导致易感光抑制，这是光合能力中的光诱导的降低，归因于橙色类胡萝卜素蛋白的双光保护功能的中断(植物细胞期刊(2006年))。

发明内容

在本发明中，意外地发现，一些新颖构筑的突变型蓝绿藻细胞，其在细胞色素b559α或β次单位或PsbJ上具有点突变，在中度蓝光条件下显示状态转换(statetransition)的提升作用以及在强度蓝光条件下显示非光化学荧光淬熄(nonphotochemicalfluorescencequenching，NPQ)的减弱作用，而不影响橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)的表现。其进一步显现出，与野生型细胞在正常生长条件下比较，一些该突变型蓝绿藻表现出提升的光合生长与生质生产，其因此可能在用于各种应用的生质生产上具有价值，例如生质能源应用以及生物燃料、粮食、饲料以及其他有价值的商业产品的商业生产。

一般而言，本发明提供了在细胞色素b559α或β次单位或PsbJ上具有突变的突变型蓝绿藻细胞，特别是在PSII中该建议的Qc转移通道的开口附近，其相较于野生型细胞时，表现出提升的光合生长与生质生产。

具体而言，于一方面，本发明提供一种突变型蓝绿藻，其表现突变型细胞色素多胜肽，该突变型细胞色素多胜肽包含选自由下列所组成的群组的突变：

(a)在对应于具有SEQIDNO:1的细胞色素b559α多胜肽中的位置23以丙胺酸(alanine，A)予以胺基酸取代；

(b)在对应于具有SEQIDNO:2的细胞色素b559β多胜肽中的位置28以丙胺酸(A)或缬胺酸(valine，V)予以胺基酸取代，或在对应于具有SEQIDNO:2的细胞色素b559β多胜肽中的位置32以苯丙胺酸(phenylalanine，F)予以胺基酸取代；以及

(c)在对应于具有SEQIDNO:3的细胞色素PsbJ多胜肽中的位置16以苯丙胺酸(F)或精胺酸(arginine，R)予以胺基酸取代，或在对应于具有SEQIDNO:3的细胞色素PsbJ多胜肽中的位置20以苯丙胺酸(F)予以胺基酸取代。

特定而言，本发明的突变型蓝绿藻，与不具有任何该突变的野生型蓝绿藻在相同条件下相比时，显现出一或多种有益的特征，包括(1)抑制的非光化学荧光淬熄(NPQ)，(2)加速的非光化学荧光淬熄(NPQ)的黑暗恢复，(3)正常量的橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)，及/或(4)提升的光合生长率及/或生质生产。

于某些具体实施例中，该突变选自由S23Aα、S28Aβ、S28Vβ、V32Fβ、A16FJ、A16RJ以及A20FJ所组成之群组。

于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻包含编码SEQIDNO:4的突变型细胞色素b559α多胜肽的基因(psbE)。

于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻包含编码SEQIDNO:5、6或7的突变型细胞色素b559β多胜肽的基因(psbF)。

于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻包含编码SEQIDNO:8、9或10的突变型细胞色素PsbJ多胜肽的基因(PsbJ)。

于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻可自一属的种中被制造，包括但不限于丽丝藻属(Agmenellum)、项圈藻属(Anabaenopsis)、鱼腥藻属(Anabaena)、组囊藻属(Anacystis)、节螺藻属(Arthrospira)、束丝藻属(Aphanizomenon)、星厘藻属(Asterocapsa)、博氏藻属(Borzia)、眉藻属(Calothrix)、管孢藻属(Chamaesiphon)、拟绿胶蓝藻属(Chlorogloeopsis)、色球藻属(Chroococcus)、拟甲色球藻属(Chroococcidiopsis)、发毛针藻属(Crinalium)、色球藻目之一属(Cyanobacterium)、鳄藻属(Crocosphaera)、色球藻目之一属(Cyanobium)、宽球藻目之一属(Cyanocystis)、蓝螺藻属(Cyanospira)、蓝杆藻属(Cyanothece)、柱孢藻属(Cylindrospermopsis)、筒孢藻属(Cylindrospermum)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、包皮藻属(Dermocarpella)、飞氏藻属(Fischerella)、夫列藻属(Fremyella)、真枝藻目之一属(Geitleria)、无类囊体蓝藻属(Gloeobacter)、颤藻目之一属(Geitlerinema)、粘球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)、光环螺旋藻属(Halospirulina)、真枝藻属(Iyengariella)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、鞘丝藻属(Lyngbya)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、微鞘藻属(Microcoleus)、粘囊藻属(Myxosarcina)、微胞藻属(Microcystis)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、拟珠藻属(Nostochopsis)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、厚皮藻属(Pleurocapsa)、浮游蓝丝藻属(Planktothrix)、绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属(Prochloron)、原绿发藻属(Prochlorothrix)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、胶须藻属(Rivularia)、裂须藻属(Schizothrix)、螺旋藻属(Spirulina)、双岐藻属(Scytonema)、直毛藻属(Stanieria)、颤藻目之一属(Starria)、束藻属(Symploca)、真枝藻属(Stigonema)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、嗜热性聚球藻属(Thermosynechococcus)、束毛藻属(Trichodesmium)、单岐藻属(Tolypothrix)、常丝藻属(Tychonema)，以及异球藻属(Xenococcus)。

于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻为选自由集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)、节螺藻属(Arthrospira)、念珠藻属(Nostoc)、鱼腥藻属(Anabaena)、嗜热性聚球藻属(Thermosynechococcus)以及蓝杆藻属(Cyanothece)所组成的群组的属。

于另一方面，本发明提供一种生质或生物分子的生产方法，包含在光照条件下在适合的培养基中培养如本文所描述的突变型蓝绿藻，以及自该培养中收获生质或生物分子。

于某些具体实施例中，该生物分子选自由碳水化合物、脂肪酸、蛋白质、胺基酸、胜肽、色素、萜类、类胡萝卜素、维生素，或其他高价值生物分子所组成之群组。

本发明之一或多个具体实施例的细节阐述于下列说明中。本发明之其他特征或优点将会自以下数个具体实施例的详细描述中以及自所附之申请专利范围中变得明显。

附图说明

前面的摘要，以及以下本发明之详细描述，当结合所附之图式一起阅读时，将会更好理解。为了说明本发明之目的，显示于图式的具体实施例系为目前较佳者。然而，应当理解的是，本发明不限于所示之精确的安排及手段。

在图式中：

图1中显示藉由叶绿素a荧光测量得到反应饱和闪光的来自Q_A^-电子转移至Q_B与Q_B^-的动力学，对于(A)野生型(黑色线)、A16FJ(蓝色线)，以及V32Fβ突变细胞(绿色线)；(B)野生型(黑色线)、S23Aα(蓝色线)，以及S28Aβ细胞色素b₅₅₉突变细胞(红色线)。条件：20μg的叶绿素在2mL的BG-11培养基中。样品在黑暗下静置1分钟。正规化Fo与Fm的程度。

图2A-图2E中显示在红色光化的光线存在与缺乏下，时间依赖型的闪光诱导的(A)野生型、(B)A16FJ、(C)V32Fβ、(D)S23Aα以及(E)S28Aβ突变细胞的荧光产量。红色光化的光线的强度为约80-90μEm^-2s^-1。

图3A-图3J中显示在蓝色光化的光线存在与缺乏下，时间依赖型的闪光诱导的野生型(A,F)、A16FJ(B,G)、V32Fβ(C,H)、S23Aα(D,I)以及S28Aβ突变细胞(E,J)的荧光产量。蓝色光化的光线的强度为(A)至(E)～65μEm^-2s^-1以及(F)至(J)～400μEm^-2s^-1。其他条件与图2中的相同。

图4中显示为野生型与突变类囊体膜的OCP含量的西方墨点分析。

图5A-图5D中显示在强蓝光化的光线存在与缺乏下，DCMU、DBMIB以及红光对时间依赖型的闪光诱导的野生型细胞的荧光产量的影响。(A)添加10mMDCMU，(B)添加10mMDBMIB，(C)无添加，(D)加上红色光化的光线。蓝色光化的光线的强度为～250μEm^-2s^-1。(D)组中红色光化的光线的强度为～50-60μEm^-2s^-1。其他条件与图2A-图2E中的相同。

图6显示野生型与突变细胞在30℃在周围空气中以及来自荧光灯30μmolμEm^-2s^-1的环境下光合生长曲线。误差线表示二生物学重复的标准偏差。当误差线不能被看到时，误差为比符号的尺寸小。

图7中显示集胞藻属(Synechocystis)PCC6803、蓝杆藻属(Cyanothece)PCC7822、鱼腥藻属(Anabaena)ATCC29413，以及钝顶节藻属(Arthropiraplatensis)的(a)细胞色素b559α多胜肽，(b)细胞色素b559β多胜肽，以及(c)细胞色素PsbJ多胜肽的胺基酸序列的比对。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术与科学术语具有相同的含义，为本发明所属技术领域之技术人员通常理解。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，单数形式“一”、“一个”，以及“该”包括复数对象。因此，例如，提及“一个组件”包括多个这样的组件以及本领域技术人员已知的等同物。“一”

“多核苷酸”或“核酸”等词指一种核苷酸单元所组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“DNA”)以及核糖核酸(“RNA”)，以及核酸类似物包括那些具有非天然存在的核苷酸。多核苷酸可以是合成的，例如，使用自动化DNA合成仪。“核酸”乙词通常是指大的多核苷酸。将会理解的是，当一核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这还包括一RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”代替“T”。“cDNA”乙词是指一种以任一单股或双股的形式与一mRNA互补或相同的DNA。

“互补”乙词指二个多核苷酸的拓扑学上的兼容性或是其相互作用表面的一起配对。因此，两个分子可被描述为互补的，且进一步该接触表面的特性是相互互补的。若第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合伴侣的核苷酸序列相同，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列为5'-TATAC-3’的多核苷酸与序列为5'-GTATA-3'的多核苷酸互补。

“编码”乙词指在一多核苷酸(例如，一基因、一cDNA或一mRNA)中的核苷酸的特定序列的固有的特性，以作为合成其它聚合物以及在具有一核苷酸(即，rRNA、tRNA以及mRNA)的定义序列或一胺基酸的的定义序列任一的生物程序中的大分子的模板，并由此产生的生物特性。因此，若一基因产生的mRNA的转录及转译在一细胞或其他生物系统中产生一蛋白，则该基因编码该蛋白。本领域技术人员理解，由于遗传密码的简并性的结果，许多不同的多核苷酸与核酸可编码相同的多胜肽。还应当理解，技术人员可使用常规技术，在不影响由那里所描述的多核苷酸所编码的多胜肽序列使核苷酸替换，以反映在该多胜肽在其内被表现的任何特定宿主生物体的密码子的使用。因此，除非另外指明，“编码胺基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式以及编码相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质与RNA的核苷酸序列可包括内含子。

“重组多核苷酸”乙词指多核苷酸或具有非天然接合在一起的序列的核酸。重组核酸可以载体的形式存在。“载体”可包含一给定的目标核苷酸序列以及一调节序列。载体可用于表现该特定核苷酸序列或维持该特定的核苷酸序列以复制它、操纵它或将它在不同位置(例如，在不同生物体之间)之间传输。载体可以被引入到用于上述目的的合适的宿主细胞中。

如本文所用，“可操作地连接”乙词指一多核苷酸以这样的方式被连接到一表现控制序列，而当一适当的分子(例如转录因子)被结合在该表现控制序列上时，则可表现该多核苷酸。

如本文所用，“表现控制序列”或“调节序列”乙词指在宿主细胞中调节该可操作地连接的核酸序列的表现的DNA序列。

载体的实例包括，但不限于，质体、黏质体、噬菌体、酵母人工染色体(YACs)或植物人工染色体(PAC)。通常，在载体中，给定的核苷酸序列被可操作地连接到调节序列，使得当载体被引入宿主细胞中时，该给定的核苷酸序列在该调节序列的控制下可以在宿主细胞内表现。该调节序列可以包括，例如且不限于，启动子序列(例如，细胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、猿猴病毒40(simianvirus40，SV40)早期启动子、T7启动子，以及醇氧化酶基因(alcoholoxidasegene，AOX1)启动子、一起始密码子、一复制起点、增强子、一操纵子序列、一分泌信号序列(例如，一配对因子信号)以及其他控制序列(例如，夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarnosequences)与终止序列)。优选地，载体可进一步含有一标记序列(例如，抗生素抗性标记序列)以用于随后的筛选程序。为了蛋白质生产的目的，在载体中，给定的目标核苷酸序列可以连接到另一个非上述调节序列的核苷酸序列上，以产生一融合的多胜肽，且有利于随后的纯化程序。所述之融合的多胜肽包括，但不限于，His-标签融合的多胜肽以及一GST融合的多胜肽。

如本文所用，“多胜肽”乙词指由胺基酸残基透过胜肽键连接所组成的聚合物，例如含有约300或更少、250或更少、200或更少、150或更少、100或更少、80或更少胺基酸残基。胺基酸可由本领域已知的三个字母或一个字母来表示。

为了确定二个胺基酸序列的同一性百分比，以优化比较目的将该序列进行比对(例如，可以在第一胺基酸序列中引入间隙以与第二胺基酸序列进行最佳比对)。在计算同一性百分比时，计算典型地精确配对。同源性百分比或二个序列之间的同一性的确定可以使用本领域中已知的数学算法，如BLAST和GappedBLAST程序、NBLAST和XBLAST程序，或ALIGN程序来完成。

如本文所用的“突变型”细胞可指具有不同于野生型蛋白质/多胜肽或基因的经修饰的(即突变)蛋白质/多胜肽或基因的细胞。突变型蛋白或多胜肽指一蛋白或多胜肽，其胺基酸序列是透过相较于一天然或野生型蛋白的胺基酸序列，取代、缺失或添加一个或多个胺基酸残基而改变。特定而言，一个点取代可以是在天然存在的蛋白序列中，一个在一位置上已经被改变为另一个胺基酸的单一的胺基酸。

如本文所用，细胞色素b559α多胜肽是指由细胞色素PsbE基因编码的PSII复合体的一个组成份。特定而言，在野生型蓝绿藻集胞藻(Synechocystissp.)中的细胞色素b559α多胜肽具有SEQIDNO:1的胺基酸序列；在位置23上的胺基酸残基为丝胺酸(S)。

如本文所用，细胞色素b559β多胜肽是指由细胞色素PsbF基因编码的PSII复合体的一个组成份。特定而言，在野生型蓝绿藻集胞藻(Synechocystissp.)中的细胞色素b559β多胜肽具有SEQIDNO:2的胺基酸序列；在位置28上的胺基酸残基为丝胺酸(S)且在位置32上的胺基酸残基为缬胺酸(V)。

如本文所用，细胞色素PsbJ多胜肽是指由细胞色素PsbJ基因编码的PSII复合体的一个组成份。特定而言，在野生型蓝绿藻集胞藻(Synechocystissp.)中的细胞色素PsbJ多胜肽具有SEQIDNO:3的胺基酸序列；在位置16与20上的胺基酸残基为丙胺酸(A)。

根据本发明，提供在细胞色素b559α或β次单位或PsbJ上带有一个突变的突变型蓝绿藻细胞，特别是在所提议的PSII内的Qc传输通道的开口附近，其与野生型细胞相较下，展现出提高的光合生长与生质生产。

具体而言，本发明之一种突变型蓝绿藻细胞，包含选自由下列所组成之群组的突变：

(a)在对应于具有SEQIDNO:1的细胞色素b559α多胜肽中的位置23以丙胺酸(alanine，A)予以胺基酸取代；

(b)在对应于具有SEQIDNO:2的细胞色素b559β多胜肽中的位置28以丙胺酸(A)或缬胺酸(valine，V)予以胺基酸取代，或在对应于具有SEQIDNO:2的细胞色素b559β多胜肽中的位置32以苯丙胺酸(phenylalanine，F)予以胺基酸取代；以及

(c)在对应于具有SEQIDNO:3的细胞色素PsbJ多胜肽中的位置16以苯丙胺酸(F)或精胺酸(arginine，R)予以胺基酸取代，或在对应于具有SEQIDNO:3的细胞色素PsbJ多胜肽中的位置20以苯丙胺酸(F)予以胺基酸取代。

特定而言，这样的突变选自由S23Aα、S28Aβ、S28Vβ、V32Fβ、A16FJ、A16RJ以及A20FJ所组成之群组。

于某些具体实施例中，本发明的突变型蓝绿藻细胞包含一编码SEQIDNO:4的突变型细胞色素b559α多胜肽的基因(psbE)，其中位置23上的胺基酸残基被改变为丙胺酸(A)，其是与野生型序列(SEQIDNO:1)比较而言，该野生型序列位置23上的胺基酸残基为丝胺酸(S)。

于某些具体实施例中，本发明的突变型蓝绿藻细胞包含一编码SEQIDNO:5或6的突变型细胞色素b559β多胜肽的基因(psbF)，其中位置28上的胺基酸残基被改变为丙胺酸(A)或缬胺酸(V)，其是与野生型序列(SEQIDNO:2)比较而言。

于某些具体实施例中，本发明的突变型蓝绿藻细胞包含一编码SEQIDNO:7的突变型细胞色素b559β多胜肽的基因(psbF)，其中位置32上的胺基酸残基被改变为苯丙胺酸(F)，其是与野生型序列(SEQIDNO:2)比较而言。

于某些具体实施例中，本发明的突变型蓝绿藻细胞包含一编码SEQIDNO:8或9的突变型细胞色素PsbJ多胜肽的基因(psbJ)，其中位置16上的胺基酸残基被改变为苯丙胺酸(F)或精胺酸(R)，其是与野生型序列(SEQIDNO:3)比较而言。

于某些具体实施例中，本发明的突变型蓝绿藻细胞包含一编码SEQIDNO:10的细胞色素PsbJ多胜肽的基因(psbJ)，其中位置20上的胺基酸残基被改变为苯丙胺酸(F)，其是与野生型序列(SEQIDNO:3)比较而言。

本发明的突变型蓝绿藻细胞可以本领域已知的常规诱导突变方法来制备[30,31]。特定而言，在特定胺基酸残基上的突变可以藉由寡核苷酸衍生的诱导突变来引入一适当的质体中，然后所得的突变质体藉由转型作用被引入宿主细胞中，且突变细胞以带有抗生素的固体培养基筛选，直到其突变基因完全被分离，其可以PCR来确认。

本发明的突变型蓝绿藻的示例可为一属中的种，包括但不限于丽丝藻属(Agmenellum)、项圈藻属(Anabaenopsis)、鱼腥藻属(Anabaena)、组囊藻属(Anacystis)、节螺藻属(Arthrospira)、束丝藻属(Aphanizomenon)、星厘藻属(Asterocapsa)、博氏藻属(Borzia)、眉藻属(Calothrix)、管孢藻属(Chamaesiphon)、拟绿胶蓝藻属(Chlorogloeopsis)、色球藻属(Chroococcus)、拟甲色球藻属(Chroococcidiopsis)、发毛针藻属(Crinalium)、色球藻目之一属(Cyanobacterium)、鳄藻属(Crocosphaera)、色球藻目之一属(Cyanobium)、宽球藻目之一属(Cyanocystis)、蓝螺藻属(Cyanospira)、蓝杆藻属(Cyanothece)、柱孢藻属(Cylindrospermopsis)、筒孢藻属(Cylindrospermum)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、包皮藻属(Dermocarpella)、飞氏藻属(Fischerella)、夫列藻属(Fremyella)、真枝藻目之一属(Geitleria)、无类囊体蓝藻属(Gloeobacter)、颤藻目之一属(Geitlerinema)、粘球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)、光环螺旋藻属(Halospirulina)、真枝藻属(Iyengariella)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、鞘丝藻属(Lyngbya)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、微鞘藻属(Microcoleus)、粘囊藻属(Myxosarcina)、微胞藻属(Microcystis)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、拟珠藻属(Nostochopsis)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、厚皮藻属(Pleurocapsa)、浮游蓝丝藻属(Planktothrix)、绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属(Prochloron)、原绿发藻属(Prochlorothrix)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、胶须藻属(Rivularia)、裂须藻属(Schizothrix)、螺旋藻属(Spirulina)、双岐藻属(Scytonema)、直毛藻属(Stanieria)、颤藻目之一属(Starria)、束藻属(Symploca)、真枝藻属(Stigonema)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、嗜热性聚球藻属(Thermosynechococcus)、束毛藻属(Trichodesmium)、单岐藻属(Tolypothrix)、常丝藻属(Tychonema)，以及异球藻属(Xenococcus)。

于某些具体实施例中，本发明的突变型蓝绿藻细胞可以自下列所组成的群组中的属的蓝绿藻种来制成：集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)、节螺藻属(Arthrospira)、念珠藻属(Nostoc)、鱼腥藻属(Anabaena)、嗜热性聚球藻属(Thermosynechococcus)以及蓝杆藻属(Cyanothece)。

根据本发明，本发明的突变型蓝绿藻，与不具有任何该突变的野生型蓝绿藻在相同条件下相比时，显现出一或多种有益的特征，包括(1)抑制的非光化学荧光淬熄(NPQ)，(2)加速的非光化学荧光淬熄(NPQ)之黑暗恢复，(3)正常量的橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)，及/或(4)提升的光合生长率及/或生质生产。本文所述之有益的特征可以藉由本领域已知的常规方法来测量或决定。

在某些具体实施例中，本发明的突变型蓝绿藻细胞(如，A16FJ以及V32Fβ)显现出较短的倍增时间，亦即在正常生长条件下，比野生型细胞具有较高的光合生长速率(约1.1倍)以及增加的生质积累(约30-40％)。

在另一方面，本发明亦提供一种生质或生物分子的生产方法，包含在光照条件下在适合的培养基中培养如本文所描述之突变型蓝绿藻细胞，以及自该培养中收获生质或一生物分子。

于某些具体实施例中，该生物分子选自由碳水化合物、脂肪酸、蛋白质、胺基酸、胜肽、色素、萜类、类胡萝卜素、维生素，或其他高价值生物分子所组成之群组。

于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻细胞是培养于正常条件下，例如温度范围自25至45℃，在白光或日光下，在一光反应器或池塘中。

本发明的方法在用于各种应用的生质生产上具有价值，例如生物能源应用与生物燃料的商业生产(如，脂质、酒精或氢气)、粮食、饲料以及其他有价值的商业产品。

本发明进一步藉由下列实施例所阐述，其系提供作为示范之目的而非用于限制。本领域之技艺者应当，根据本发明之揭露，理解在所揭露之特定的具体实施例中可以产生许多变化，且仍可得到相同或类似的结果而不背离本发明之精神与范围。

实施例

在我们的研究中，我们构筑了数个集胞藻(Synechocystis)PCC6803的细胞色素b₅₅₉和PsbJ突变细胞，其在所提议的PSII内的Q_C传输通道的开口附近带有突变。数个突变细胞表现出对OCP调节的非光化学荧光淬熄有严重的抑制效果以及显着加速荧光产量的黑暗恢复。我们的数据表明，在细胞色素b559与PsbJ上的突变可改变APC核心复合物与OCP的相互作用，并导致上述效果。此外，DCMU与DBMIB处理对在野生型细胞中的OCP调节的光保护作用没有显着的影响。我们的研究结果表明，OCP调节的光保护作用并不直接由色素体醌池(plastoquinonepool)的氧化还原状态调节。此外，相较于在正常生长条件下的野生型细胞，数个突变细胞显示出提高的光合生长和生质生产。我们的研究结果表明，在蓝绿藻中OCP调节的光保护作用的调节具有提高的生质生产的潜力，生质生产具有实际应用以提高在蓝绿藻中的生质和生物燃料的生产。

1.材料与方法

1.1集胞藻(Synechocystissp.PCC6803)细胞的生长与制备

野生型与突变集胞藻细胞在BG-11培养基中光自营生长。培养物在30℃、带有约30μmol光子m^-2s^-1强度的生长光条件下繁殖。培养物连续通入无菌加湿空气。收获在指数增长(OD₇₃₀0.7-1.2)期的培养液，并用于生化与功能分析。

1.2细胞色素b₅₅₉与PsbJ突变的构筑

细胞色素b559与PsbJ的胺基酸残基的点突变系根据参考文献的寡核苷酸衍生的诱导突变来引入质体PAC559EM^R[30，31]。该突变是由突变质体转型至该集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803细胞的宿主菌株(ΔpsbEFLJ)所构筑而成。突变体在含有抗生素Em(0.1μg/mL)的固体培养基中被筛选，直到突变基因完全被分离。以PCR验证在这些突变细胞中的突变基因是否完全分离。

1.3光合作用氧气释放的测量

氧气释放的稳定状态速率以适合水套细胞培养箱(water-jacketedcell)的Clark-型氧电极(YSI型号5331氧气探针)测量。浓缩的细胞被稀释到置于25℃搅拌的水套细胞培养箱中的生长培养基中。2mM的铁氰化钾与2mM2,6-二氯对苯醌(DCBQ)在加入细胞前立即被加入，以作为BG11培养基的人工电子受体。藉由二个光纤照明(Dolan-JennermodelMI150)由水套细胞培养箱的二测提供饱和照明。

1.4在295K下测量叶绿素a荧光

以一双脉冲幅度调制(pulse-amplitude-modulation，PAM)荧光仪(瓦尔茨，德国)在295K下测量叶绿素a荧光。根据参考文献，以叶绿素为基础的细胞的相对PSII含量由可变叶绿素a荧光的总产量(F_max-F₀)估算而得，该产量系在DCMU和羟胺的存在下测得[31-33]。图说中描述了时间依赖性闪光诱导瞬态的PSII荧光产量的测量实验条件，以及响应一给予野生型及突变细胞的饱和闪光的从Q_A^-到Q_B的电子转移的动力学。

1.5MP与M膜的制备

MP与M类囊体膜根据文献而分离[10]。

1.6凝胶电泳分析与西方墨点分析

MP与M部分相当于2μg的叶绿素以SDS-PAGE在12％聚丙烯酰胺/2M尿素凝胶上于Tris/MES系统(Kashino等人，2001年)中分离。对于OCP蛋白的检测，使用对OCP专一的兔抗血清作为一级抗体(由AdjeleWilson提供)，而与过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体则用来作为二级抗体(Sigma公司)。使用WesternLightningPlus-ECL(PerkinElmer公司)来显现条带。

1.7生质的决定

培养物在30℃以及来自白色荧光灯30μmolμEm^-2s^-1的光量下光自营生长。于126小时后收获100ml液体培养物并以离心浓缩到5ml。该5ml样品在铝盘上于105℃下进行烘箱干燥24小时，冷却至室温，并测量干重。

1.8野生型及突变型细胞中生质组成的FT-IR测定

将野生型及突变型细胞的30ml培养物予以浓缩并重新悬浮至约50微升。取4微升的悬浮液涂布于ConcentratIR^TM多重反射ATR附件的硅ATR采样板(Harrick,USA)，然后在室温下风干。使用红外线光谱仪(BrukerVertex70,German)纪录脂质、蛋白质及醣类分别于2800–3000cm-1,1500–1700cm-1及1000–1200cm-1的特征波锋。野生型及突变型细胞的生质组成依据文献(Pistoriousetal.,2009)记载予以分析。

结果

2.1突变细胞的生长与光合特性

在所提议的Q_C传输通道的开口附近的细胞色素b₅₅₉与PsbJ的数个位置直接突变被构筑于实验模型蓝绿藻集胞藻(Synechocystis)PCC6803中。光饱和氧气释放出活性以及本研究中所讨论的该突变株的预估PSII含量都列于表1中。所有这些突变的细胞与野生型细胞一样光自营生长。此外，最大氧气释放速率与这些突变细胞的预估PSII含量皆类似于野生型细胞(表1)。

表1野生型与突变细胞的一般特性

2.2在295K下测量叶绿素a荧光

图1显示在缺乏DCMU下，响应给予野生型、A16FJ、V32Fβ、S23Aα与S28Aβ突变细胞的饱和单线周转闪光的Q_A^-的诱导与衰变。在缺乏DCMU下荧光衰变主要是因为由Q_A^-到Q_B与Q_B^-的电子转移[34]。我们的结果表明，在这些突变细胞中由Q_A^-到Q_B与Q_B^-的电子转移速率的动力学非常相似于野生型细胞的；除了在S23Aα细胞的荧光衰变动力学中存在非常缓慢相的些微增加之外，其可能是因为在Q_A^-与PSII电子供体之间电荷重组。表1中列出的其它突变细胞皆显示由Q_A^-到Q_B与Q_B^-的正常电子转移与野生型细胞一样(数据未显示)。此外，在DCMU的存在下，响应给予野生型及突变细胞的饱和闪光的QA^-与PSII电子供体之间的电荷重组的动力学，与由叶绿素a荧光所测量的非常相似(数据未显示)。这些结果表明，在这些突变细胞的PSII内Mn团簇与Q_A通常完好。

2.3在红色光化光的存在与缺乏下PSII荧光的产量

图2所示为在红色光化光存在与缺少的情况下，野生型与突变细胞的时间依赖型闪光诱导瞬变的PSII荧光产量。相较于暗适应的野生型细胞，在暗适应的突变细胞中F_o值略微较高且最大PSII荧光产量(F_v/F_m，黑暗)正常。此外，相较于野生型细胞，在红色光化光存在下，这些突变细胞显示不同的时间依赖型闪光诱导瞬变的PSII荧光产量(见图2)。在野生型细胞中的稳定态荧光产率(F_S)通常显示出初始增加，然后在光化光线照射期间逐渐降低到一个稳定的含量。相较之下，在光化光线照射期间，在这些突变细胞中的F_S含量相对平坦。这结果可以归因于相较于野生型细胞，在光化光线照射期间，突变细胞的伴随状态转变的荧光产量中的微妙变化([35,36]以及其中的参考文献)。此外，在红色光化光照明(80-90μEm^-2s^-1)后，最大PSII荧光产量的振幅(Fm’)与那些黑暗中的突变细胞的Fm可相比。我们的研究结果表明，这些突变细胞在我们的实验条件下对于光抑制没有显现出任何显着的效果。

2.4蓝光诱导突变细胞上的NPQ的效果

在这些突变细胞中最显着的表现型是图3中蓝光诱导的NPQ的抑制效果。当野生型细胞以中间强度(约60μEm^-2s^-1)的蓝色光化光照射时，起初其荧光产量略有增加(可能是因为状态转换效果)，然后因为蓝光NPQ效果而逐渐下降(见图3A)。相较之下，当A16FJ、V32Fβ、S23Aα以及S28Aβ突变细胞以中间强度(约60μEm^-2s^-1)的蓝色光化光照射时，其荧光产量比野生型细胞(因为状态转换效果)显现出明显的增加至较高的含量，但并未显现出任何蓝光诱导NPQ的显着效果(见图3B、图3C、图3D、图3E)。当野生型细胞以400μEm^-2s^-1蓝色光化光照射时，在其荧光产量中强烈的淬熄被诱导，且在蓝色光化光照射期间，稳定态荧光(F_S)的含量下降到低于F_o水平(图3F)。一旦关闭蓝色光化光，F_m’与F_o’慢慢恢复到黑暗中的初始含量。相较之下，这些突变细胞在相同的实验条件下只显现出荧光产量的些微减少(图3G、图3H、图3I、图3J)。另外，当蓝色光化光被关闭时，在这些突变细胞中的NPQ恢复几乎在6分钟内完成，而在野生型细胞中的NPQ恢复则显着较慢。我们的研究结果表明，在这些突变细胞中，蓝光诱导的NPQ的效果受到严重抑制，且NPQ的黑暗恢复则显着地加速。A16RJ、A20FJ与S28Vβ突变细胞也表现出对蓝光诱导的NPQ严重的抑制效果，如同上述提到的这些突变细胞(数据未显示)。相较之下，其他突变细胞(A16SJ、A16LJ与G19FJ)在表1中显示出如同野生型细胞的正常蓝光诱导的NPQ效果。

2.5西方墨点分析

为了确定这些突变细胞是否具有如野生型细胞的OCP正常含量，在图4中对野生型与突变类囊体膜的OCP含量进行西方墨点分析。我们的研究结果表明，A16FJ、V32Fβ与S28Vβ突变株的类囊体膜仍然具有如野生型细胞的OCP正常含量。因此，我们的结果得出这样的结论，在这些突变细胞中的OCP诱导的NPQ的抑制效果不是因为缺乏OCP而造成的。

2.6在集胞藻6803中DCMU与DBMIB在OCP调节的NPQ上的效果

图5所示为在DCMU的存在下(图A)、DBMIB的存在下(图B)、未添加(图C)带有蓝色光化光，以及未添加蓝色及红色光化光(图D)下，在集胞藻6803的野生型细胞内OCP调节的NPQ。在光化光照射的期间，DCMU的存在会诱导在集胞藻6803细胞中的PQ池的氧化。相较之下，在光照期间，DBMIB的存在会使集胞藻6803细胞的PQ池更为还原(见图5B)。另外，蓝色加红色光化光(见图5D)的照明也会使集胞藻6803细胞的PQ池比蓝色光化光的单独照明时更加还原(见图5C)。我们的研究结果在图5表明，DCMU与DBMIB处理以及蓝色加红色光化光照明，对野生型细胞中的OCP调节的光保护没有显着的改变。我们的研究结果表明，PQ池的氧化还原状态的改变并未显着地改变在集胞藻6803细胞中的OCP调节的光保护。

2.7突变细胞的光合生长速率与生质分析

图6显示野生型与突变细胞的光合生长曲线。我们的研究结果表明，相较于野生型细胞，A16FJ与V32Fβ突变细胞显示出显着较高的光合生长速率。在野生型、A16FJ与V32Fβ突变细胞中光合生长速率的倍增时间分别为17.2±0.2、15.7±0.1、15.7±0.2(见表2)。此外，在A16FJ与V32Fβ突变细胞的5天培养物中的生质浓度(分别为0.280±0.020以及0.303±0.017)比野生型细胞(0.213±0.011mg/ml)显着较高(见表2)。因此，我们的结果表明，相较于野生型细胞，在A16FJ与V32Fβ突变细胞中光合生长速率与生质生产显着增加。

表2在野生型与突变细胞中的光合生长速率与生质生产

培养物在30℃在周围空气中以及来自白色荧光灯30μmolμEm^-2s^-1的环境下生长。在指数生长期测量细胞的光合生长速率。在约生长126小时后，测量培养物的生质浓度。误差线表示三个独立实验的标准误差。此外，我们的FT-IR分析显示相较于野生型细胞在正常生长条件下，脂质、蛋白质及糖类含量于A16FJ与V32Fβ突变细胞含量较高。

3.讨论

3.1细胞色素b559与PsbJ上的突变改变在蓝绿藻中蓝光诱导的NPQ

我们的研究结果表明，在数个细胞色素b₅₅₉与PsbJ突变细胞中，蓝光诱导的NPQ被显着地抑制。先前的研究已经证明，在体外的OCP的活化的红色形式与藻胆体相互作用，并诱导蓝绿藻中的NPQ。OCP的相互作用部位被提出为碱性圆柱的中央别藻蓝蛋白(APC)盘之一[16，17]。此外，我们的西方墨点分析结果进一步表明，在A16FJ、V32Fβ以及S28Vα突变类囊体膜中OCP的量，与野生型类囊体膜相似。因此，在这些突变细胞中OCP诱导的NPQ的抑制，并不是因为OCP的缺乏所造成。此外，DCMU、DBMIB与蓝色加红色光化光处理并不会显着改变在集胞藻6803中OCP诱导的NPQ。我们的研究结果与先前的研究结果一致，这表明在蓝绿藻中OCP诱导的NPQ不受跨类囊体的pH值或PQ池的氧化还原状态的改变所影响，但却依赖光的辐射与质量[10]。

此外，一些突变细胞，例如A16FJ、V32Fβ、G19FJ、A20FJ，在表1中显示正常光合水氧化作用，以及自Q_A至Q_B与Q_B^-的电子转移的动力学。因为这些残基被构筑在提议的Q_C传输通道的开口附近，所以将这些残基以庞大的苯丙胺酸替换，预期会阻碍或阻断通过通道的PQ分子的扩散。然而，我们并没有在这些突变细胞中看到这些作用。因此，我们的研究结果不符合那些提议的Q_C-位置，或者Q_C传输通道可能在从蓝绿藻中的池的Q_B位置上的PQ的交换中，扮演重要的角色[3]。

3.2细胞色素b559与PsbJ涉及蓝光诱导的NPQ机制的意义

细胞色素b₅₅₉的细胞质侧位于PSII内与藻胆体的APC核心复合物的预测接触位点[38]。另外，我们先前的研究表明，在细胞色素b₅₅₉的细胞质侧上的R7Lα与R17Lβ突变对OCP诱导的NPQ及其黑暗恢复具有显着的抑制效果[32]。因此，我们建议，细胞色素b₅₅₉与PsbJ上的突变可能影响在蓝绿藻中OCP诱导的NPQ，大概是通过改变在APC核心复合物与该OCP之间的相互作用。我们的研究结果还表明，细胞色素b₅₅₉与PsbJ的细胞质侧可能有助于或稳定在PSII中APC核心复合物与OCP的停靠点。该建议也与近期通过使用原生的电喷雾质谱和蛋白质交联的组合来研究OCP的结构结合位点的研究结果一致[39]。

3.3这些突变细胞对生物能源生产的应用

在我们的正常生长条件下，相较于野生型细胞，A16FJ与V32Fβ突变细胞显示出显着较高的光合生长速率(约1.1倍)以及增加的生质积累(约30-40％)。因为这些突变细胞表现出对OCP诱导的NPQ机制的严重抑制，因此上述效果可以归因于自其藻胆体浪费能量耗散的降低，从而相较于野生型细胞，提高其光合效率。这些突变细胞改进的光合作用和生长特性可有实际的应用，以提高在蓝绿藻中生质和生物燃料的生产[40-42]。我们的FT-IR分析显示脂质、蛋白质及糖类含量于A16FJ与V32Fβ突变细胞含量较高，相较于野生型细胞在正常生长条件下。

4.结论

我们的研究结果表明，数个在细胞色素b₅₉₉与PsbJ上点突变的集胞藻PCC6803突变细胞显现出在中度蓝光条件下状态转换的提升作用以及在强度蓝光条件下蓝光诱发的非光化学荧光淬熄(nonphotochemicalfluorescencequenching，NPQ)的减弱作用。我们的结果显示PSII的细胞色素b₅₅₉与PsbJ上调节蓝绿藻的状态转换及蓝光诱发的非光化学荧光淬熄。此外，在正常生长条件下，相较于野生型细胞，这些突变细胞中有一些表现出增加的光合生长速率与生质生产。这些突变细胞可具有用于增加生质与生物能源生产的产率的实际应用。

序列信息

野生型细胞色素b559α多胜肽(SEQIDNO:1)

SGTTGERPFSDIVTSIRYWVIHSITIPMLFIAGWLFVSTGLAYDAFGTPRPDEYFTQTRQELPILQERYDINQEIQEFNQ

野生型细胞色素b559β多胜肽(SEQIDNO:2)

ATQNPNQPVTYPIFTVRWLAVHTLAVPSVFFVGAIAAMQFIQR

野生型细胞色素PsbJ多胜肽(SEQIDNO:3)

MFAEGRIPLWVVGVVAGIGAIGVLGLFFYGAYAGLGSSM

突变型细胞色素b559α多胜肽(SEQIDNO:4)

SGTTGERPFSDIVTSIRYWVIHAITIPMLFIAGWLFVSTGLAYDAFGTPRPDEYFTQTRQELPILQERYDINQEIQEFNQ

突变型细胞色素b559β多胜肽(SEQIDNO:5)

ATQNPNQPVTYPIFTVRWLAVHTLAVPAVFFVGAIAAMQFIQR

突变型细胞色素b559β多胜肽(SEQIDNO:6)

ATQNPNQPVTYPIFTVRWLAVHTLAVPVVFFVGAIAAMQFIQR

突变型细胞色素b559β多胜肽(SEQIDNO:7)

ATQNPNQPVTYPIFTVRWLAVHTLAVPSVFFFGAIAAMQFIQR

突变型细胞色素PsbJ多胜肽(SEQIDNO:8)

MFAEGRIPLWVVGVVFGIGAIGVLGLFFYGAYAGLGSSM

突变型细胞色素PsbJ多胜肽(SEQIDNO:9)

MFAEGRIPLWVVGVVRGIGAIGVLGLFFYGAYAGLGSSM

突变型细胞色素PsbJ多胜肽(SEQIDNO:10)

MFAEGRIPLWVVGVVAGIGFIGVLGLFFYGAYAGLGSSM

参考文献

1.D.J.Vinyard,G.M.Ananyev,G.C.Dismukes,PhotosystemII:thereactioncenterofoxygenicphotosynthesis,Annu.Rev.Biochem.82(2013)577-606.

2.J.Barber,PhotosystemII:thewater-splittingenzymeofphotosynthesis,ColdSpringHarbSympQuantBiol.77(2012)295-307.

3.Y.Umena,K.Kawakami,J.-R.Shen,N.Kamiya,Crystalstructureofoxygen-evolvingphotosystemIIataresolutionofNature473(2011)55-60.

4.A.Guskov,J.Kern,A.Gabdulkhakov,M.Broser,A.Zouni,W.Saenger,CyanobacterialphotosystemIIatresolutionandtheroleofquinones,lipids,channelsandchloride,NatureStruct.Biol.&Mol.Biol.16(2009)334-342.

5.E,PhotoinhibitionofPhotosystemII,IntRevCellMolBiol.300(2013)243-303.

6.K.K.Niyogi,T.B.Truong,Evolutionofflexiblenon-photochemicalquenchingmechanismsthatregulatelightharvestinginoxygenicphotosynthesis,Curr.Opin.PlantBiol.3(2013)307-14.

7.P.Horton,Optimizationoflightharvestingandphotoprotection:molecularmechanismsandphysiologicalconsequences,PhilosTransRSocLondBBiolSci.367(2012)3455-3465.

8.D.Kirilovsky,C.A.Kerfeld,TheorangecarotenoidproteininphotoprotectionofphotosystemIIincyanobacteria,Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.1817(2012)158-166.

9.D.Kirilovsky,C.A.Kerfeld,TheorangeCarotenoidprotein:ablue-greenlightphotoactiveprotein,Photochem.Photobiol.Sci.12(2013)1135-1143.

10.A.Wilson,G.Ajlani,J.-M.Verbavatz,I.Vass,C.A.Kerfeld,D.Kirilovsky,Asolublecarotenoidproteininvolvedinphycobilisome-relatedenergydissipationincyanobacteria,PlantCell18(2006)992-1007.

11.C.Boulay,L.Abasova,C.Six,I.Vass,D.Kirilovsky,Occurrenceandfunctionoftheorangecarotenoidproteininphotoprotectivemechanismsinvariouscyanobacteria,Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.1777(2008)1344-1354.

12.A.Wilson,D.Kirilovsky,InvitroreconstitutionofthecyanobacterialphotoprotectivemechanismmediatedbytheorangecarotenoidproteininSynechocystisPCC6803,PlantCell23(2011)2631-2643.

13.C.Boulaya,A.Wilsona,S.D’Haenec,D.Kirilovsky,IdentificationofaproteinrequiredforrecoveryoffullantennacapacityinOCP-relatedphotoprotectivemechanismincyanobacteria,PNAS107(2010)11620-11625.

14.D.Jallet,M.Gwizdala,D.Kirilovsky,ApcD,ApcFandApcEarenotrequiredfortheOrangeCarotenoidProteinrelatedphycobilisomefluorescencequenchinginthecyanobacteriumSynechocystisPCC6803,Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.1817(2012)1418-1427.

15.I.N.Stadnichuk,M.F.Yanyushin,E.G.Maksimov,E.P.Lukashev,S.K.Zharmukhamedov,I.V.Elanskaya,V.Z.Paschenko,Siteofnon-photochemicalquenchingofthephycobilisomebyorangecarotenoidproteininthecyanobacteriumSynechocystissp.PCC6803,Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.1817(2012)1436-1445.

16.TianL,vanStokkumIH,KoehorstRB,JongeriusA,KirilovskyD,vanAmerongenH.,Site,rate,andmechanismofphotoprotectivequenchingincyanobacteria,JAmChemSoc.133(2011)18304-18311.

17.LeverenzRL,JalletD,LiMD,MathiesRA,KirilovskyD,KerfeldCA.StructuralandFunctionalModularityoftheOrangeCarotenoidProtein:DistinctRolesfortheN-andC-TerminalDomainsinCyanobacterialPhotoprotection,PlantCell26(2014)426-437.

18.JalletD,ThurotteA,LeverenzRL,PerreauF,KerfeldCA,KirilovskyD.SpecificityofthecyanobacterialOrangeCarotenoidProtein:InfluencesofOCPandphycobilisomestructures,PlantPhysiol.(2013).

19.F.Müh,C.J.Hellmich,A.Zouni,Light-inducedquinonereductioninphotosystemII,Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.1817(2012)44-65.

20.O.Kaminskaya,V.A.Shuvalov,G.Renger,EvidenceforanovelquinonebindingsiteinthephotosystemIIcomplexthatregulatetheredoxpotentialofcytochromeb₅₅₉,Biochemistry46(2007)1091-1105.

21.O.Kaminskaya,V.A.Shuvalov,G.Renger,Tworeactionpathwaysfortransformationofhighpotentialcytochromeb₅₅₉ofPSIIintotheintermediatepotentialform,Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.1767(2007)550-558.

22.O.Kaminskaya,V.A.Shuvalov,Biphasicreductionofcytochromeb559byplastoquinolinphotosystemIImembranefragments,Evidencefortwotypesofcytochromeb559/plastoquinoneredoxequilibria,Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.1827(2013)471-483.

23.P.Pospisil,Enzymaticfunctionofcytochromeb₅₅₉inphotosystemII,J.Photochem.Photobiol.,B.104(2011)341-347.

24.K.E.Shinopoulos,G.W.Brudvig,Cytochromeb₅₅₉andcyclicelectrontransferwithinphotosystemII,Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.1817(2011)66-75.

25.J.Kruk,K.Strzalka,Darkreoxidationoftheplastoquinone-poolismediatedbythelow-potentialformofcytochromeb-559inspinachthylakoids,Photosynth.Res.62(1999)273-279.

26.J.Kruk,K.Strzalka,Redoxchangesofcytochromeb₅₅₉inthepresenceofplastoquinone,J.Biol.Chem.276(2001)86-91.

27.N.Bondarava,L.DePascalis,S.Al-Babili,C.Goussias,J.R.Golecki,P.Beyer,R.Bock,A.Krieger-Liszkay,Evidencethatcytochromeb₅₅₉mediatestheoxidizationofreducedplastoquinoneinthedark,J.Biol.Chem.278(2003)13554-13560.

28.N.Bondarava,C.M.Gross,M.Mubarakshina,J.R.Golecki,G.N.Johnson,A.Krieger-Liszkay,Putativefunctionofcytochromeb₅₅₉asaplastoquinoloxidase,Physiol.Plant.138(2010)463-473.

29.C.A.Buser.B.A.Diner.G.W.Brudvig,photooxidationofcytochromeb₅₅₉inoxygen-evolvingphotosystemII,Biochemistry31(1992)11449-11459.

30.J.Barber,J.DeLasRivas,Afunctionalmodelfortheroleofcytochromeb₅₅₉intheprotectionagainstdonorandacceptorsidephotoinhibition,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(1993)10942-10946.

31.C.-H.Hung,J.-Y.Huang,Y.-F.Chiu,H.-A.Chu,Site-directedmutagenesisonthehemeaxial-ligandsofcytochromeb559inphotosystemIIbyusingcyanobacteriaSynechocystisPCC6803,Biochim.Biophys.Acta1767(2007)686-693.

32.C.H.Hung,H.J.Hwang,Y.-F.Chiu,Y.H.Chen,S.C.Ke,R.L.Burnap,H.-A.Chu,SpectroscopicandfunctionalcharacterizationsofSynechocystsis6803mutantonandnearthehemeaxial-ligandofcytochromeB559inphotosystemII.J.Biol.Chem.285(2010)5653-5663.

33.Y.F.Chiu,Y.H.Chen,M.Roncel,P.L.Dilbeck,J.Y.Huang,S.C.Ke,J.M.Ortega,R.L.Burnap,H.-A.Chu,SpectroscopicandfunctionalcharacterizationofcyanobacteriumSynechocystisPCC6803mutantsonthecytoplasmic-sideofcytochromeb559inphotosystemII.Biochim.Biophys.Acta1827(2013)507-519.

34.Y.F.Chiu,W.C.Lin,C.M.Wu,Y.H.Chen,C.H.Hung,S.C.Ke,H.-A.Chu,Identificationandcharacterizationofacytochromeb₅₅₉Synechocystsis6803mutantspontaneouslygeneratedfromDCMU-inhibitedphotoheterotrophicalgrowthconditions.Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.1787(2009)1179-1188.

35.R.deWijn,H.J.vanGorkom,KineticsofelectrontransferfromQ(A)toQ(B)inphotosystemII,Biochemistry40(2001)11912-119222.

36.D.Bruce,S.Brimble,D.A.Bryant,Statetransitionsinaphycobilisome-lessmutantofthecyanobacteriumSynechococcussp.PCC7002,Biochim.Biophys.Acta,Bioenerg.974(1989)66–73.

37.K.Kondo,C.W.Mullineaux,M.Ikeuchi,DistinctrolesofCpcG1-phycobilisomeandCpcG2-phycobilisomeinstatetransitionsinacyanobacteriumSynechocystissp.PCC6803,Photosynth.Res.99(2009)217–225.

38.J.Barber,E.P.Morris,P.C.A.daFonseca,InteractionofallophycocyanincorecomplexwithphotosystemII,Photochem.Photobiol.Sci.2(2003)536-541.

39.H.Zhang,H.Liu,D.M.Niedzwiedzki,M.Prado,J.Jiang,M.L.Gross,andR.E.Blankenship,Molecularmechanismofphotoactivationandstructurallocationofthecyanobacterialorangecarotenoidprotein,Biochemistry53(2014)13-19.

40.I.M.Machado,S.Atsumi,Cyanobacterialbiofuelproduction,J.Biotechnol.162(2012)50-56.

41.P.G.Stephenson,C.M.Moore,M.J.Terry,M.V.Zubkov,T.S.Bibby,Improvingphotosynthesisforalgalbiofuels:towardagreenrevolution,Trend.Biotech.29(2011)615-623.

42.PistoriusAMA,DeGripWJ,Egorova-ZacheTA(2009)MonitoringofbiomasscompositionfrommicrobiologicalsourcesbymeansofFT-IRspectroscopy,Biotechno.Bioeng.103:123-129