一种利用荞麦防治甘蓝根肿病的栽培方法

摘要

本发明属于甘蓝栽培技术领域，具体涉及一种利用荞麦防治甘蓝根肿病的栽培方法。本发明要解决的技术问题是为防治甘蓝根肿病提供一种新选择。本发明的技术方案是利用荞麦防治甘蓝根肿病的栽培方法，包括如下步骤：将荞麦与甘蓝进行间作或轮作；间作时，种植畦中央首先条播荞麦，30～40d后在荞麦两侧定植甘蓝；轮作时，甘蓝前茬作物为荞麦，荞麦种植为常规栽培，荞麦收获后种植甘蓝。本发明中的间作和轮作植物为荞麦，该种植物对作物的根腐病、全蚀病等病害具有很好的防治效果，相较于传统化学农药防治具有安全和无农药残留，对环境无污染等特点。

说明书

技术领域

本发明属于甘蓝栽培技术领域，具体涉及防治甘蓝根肿病的栽培方法。

背景技术

结球甘蓝(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)简称甘蓝，为十字花科蔬菜。在我国各地均有栽培，是我国主要蔬菜作物之一，在我国蔬菜的全年供应中占有重要地位。甘蓝根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron.)侵染引起的一种世界性的土传病害，主要危害十字花科作物。近年来，我国甘蓝根肿病发病面积急剧增加，造成产量和品质大幅度降低，严重时甚至绝收。国内外对其防治方法进行了大量的研究，但至今仍未找到行之有效的根治根肿病的防治措施，探索防治根肿病的新方法和新技术具有重要的现实意义。

荞麦^[1]是蓼科(Polygonaceae)荞麦属(FagopyrumMill.)的双子叶禾谷类作物。在世界上分布较广，几乎遍及所有种植有粒用作物的国家。1994年张庆平^[2]试验研究表明连作小麦重病田复种荞麦，翌年小麦产量增加，小麦全蚀病害也明显降低。同一科属的金荞麦，也有相关报道。2005年王立波^[3]和2006年冯黎莎^[4]对金荞麦抗菌活性研究中，得出金荞麦对细菌和真菌均有一定的抑制作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为防治甘蓝根肿病提供一种新选择。

本发明的技术方案是首次发明并利用荞麦防治甘蓝根肿病的栽培方法，包括如下步骤：将荞麦与甘蓝进行间作或轮作；间作时，露地田间1.6～1.8m做畦，种植畦中央首先条播荞麦，30～40d后在荞麦两侧定植甘蓝；主要考虑到甘蓝育苗时间需30～40d，同时荞麦根系分泌物在田间有一定的积累，甘蓝行株距为75～90cm×45～60cm；轮作时，甘蓝前茬作物为荞麦，荞麦种植为常规栽培，荞麦收获后种植甘蓝，露地田间1..1～1.3m作畦，甘蓝行株距为50～65cm×45～60cm,畦宽和行株距主要根据甘蓝品种的不同确定。

其中，所述的荞麦为花荞品种或苦荞品种。

其中，间作时，大型甘蓝品种露地田间1.8m作畦，小型甘蓝品种露地田间1.6m作畦。

其中，间作时，荞麦播种35d后定植甘蓝。

其中，间作时，大型甘蓝品种甘蓝定植行株距为90cm×60cm，小型甘蓝品种定植行株距为75cm×45cm。

其中，轮作时，大型甘蓝品种种植露地田间1.3m作畦，小型甘蓝品种种植露地田间1.1m作畦。

其中，轮作时，大型甘蓝品种定植行株距为65cm×60cm，小型甘蓝品种定植行株距为50×45cm。

本发明的有益效果：

(1)本发明中的间作和轮作植物为荞麦，该种植物对作物的根腐病、全蚀病等病害具有很好的防治效果。但在甘蓝栽培中利用很少，特别是防治根肿病方面还处于空白，因此，本发明有助于完善对该种重要植物在蔬菜病害防治方面的认识。

(2)采用荞麦和甘蓝间作和轮作的栽培制度，可以提高土地利用率，减少光能的浪费，抑制杂草的生长，降低成本。有利于调动农户的种植积极性，也可帮助种植户增收。进一步发展了甘蓝抗病的栽培理论，有益于建立1套甘蓝防治根肿病的栽培模式。

(3)抗病原理主要是利用荞麦的根系分泌物，可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发，可以降低甘蓝根肿病的发生程度。相较于传统化学农药防治具有安全和无农药残留，对环境无污染等特点。

具体实施方式

实施例荞麦与甘蓝轮间作对苗期甘蓝根肿病的防治效果

(1)试验设计：室内和田间试验共设5个处理，单作甘蓝(G)；苦荞与甘蓝间作(K+G)；花荞与甘蓝间作(H+G)；苦荞与甘蓝轮作(K-G)；花荞与甘蓝轮作(H-G)，每个处理3次重复。

室内试验：设计单作每盆3株甘蓝(CK)，间作处理中每盆2株甘蓝，1株荞麦。荞麦生长15d之后，播种甘蓝。轮作处理中荞麦种植50d后种植甘蓝3株，每个处理20盆，人工气候室中培养(25℃/18℃)，各处理重复3次。甘蓝播种露一片真叶，两片真叶，三片真叶时，采用5点采样法，取甘蓝根际同层次土样，-79℃下保存土样用于PLFA种类和含量的分析。最后一次取土样时测定甘蓝的株高和鲜重，并采集各处理甘蓝叶片与根系用于保护性酶活性测定。

田间试验设计荞麦和甘蓝均采用点播，间作小区按1行荞麦1行甘蓝方式种植，间作小区内4个荞麦种植带，3个甘蓝种植带。2014年8月10日同时播种，2014年10月10日调查并采集甘蓝根际土，-79℃下保存土样用于根际土壤微生物区系PLFA的种类和含量的分析。

甘蓝根肿病单株分级标准：

0级：根系生长正常、无肿瘤；

1级：根系主根不发病或膨大不明显，其直径≤2倍茎基部或须根有小肿瘤；

2级：主根明显肿大，直径≤2-3倍茎基部；

3级：主根明显肿大，直径≤3-4倍茎基部；

4级：主根明显肿大，直径≤4倍以上茎基部或根部发黑腐烂，无须根。

发病率＝感染根肿病的单株数/该材料参与统计的总株数×100％。

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)。

(2)荞麦与甘蓝轮间作对甘蓝根际土壤微生物区系的影响

①磷脂脂肪酸(PLFA)的提取：用于测定微生物生物量的新鲜土样先除去可见动、植物残体，过2mm筛子，根据水分系数称取相当于8g干重的土壤，置于35ml离心管中，向离心管中加入5ml磷酸缓冲液，6ml三氯甲烷，12ml甲醇；285～320r，26℃，振荡2小时；先预热离心机2h，25℃，3500rpm，离心10分钟，取上清液倒入大试管A中；下层土壤样品重复步骤一(加入5ml磷酸缓冲液，6ml三氯甲烷，12ml甲醇)，手工上下摇动两分钟，285～320R，26℃，振荡30分钟，3500rpm，25℃，离心10分钟，上清液倒入大试管A中；加12mlCHCL3，12ml磷酸缓冲液于大试管A中，封上封口膜，摇动2分钟，静止过夜；用吸管将大试管A中下层溶液吸入新备好的大试管B中，贴好标签；30-32℃水浴，N2浓缩吹干；取500mlCHCL₃冲洗大试管B底部并转移到萃取小柱，此步骤重复2次；加3mlCHCL₃调解萃取小柱；向萃取小柱加入依次加入5mlCHCL₃，5ml丙酮；用1ml枪取甲醇清洗萃取小柱底部，弃小试管A；向萃取小柱内加5ml甲醇，小试管B收集淋洗液；用10ul的移液枪第一次加入4ul内标，第二次用移液枪加入淋洗液冲洗内标、小试管B壁部，摇动，再多次用移液枪冲洗试管使之混匀。32℃水浴，N₂浓缩吹干；加1ml1:1甲醇：甲苯1ml0.2MKOH溶液，摇匀；37℃水浴加热15分钟；加0.3ml1M醋酸溶液，2ml己烷，2ml超纯水；低速振荡10分钟(120-200R)，上层己烷溶液移入小试管C；下层加2ml己烷再振荡10分钟；上层己烷溶液移入小试管C；小试管C，N₂脱水干燥，不用水浴；加入200ul的正己烷冲洗小试管C底部及壁部，摇动，再多次用胶头玻璃滴管冲洗试管使之混匀，用胶头玻璃滴管转移到GC专用内衬管，2-3天内检测-20℃保存。超过3天检测，-80℃保存。

②PLFA的检测：采用美国Agilent6850气相色谱仪(FID)检测器分析PLFA的成分。在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：HP-5柱(25.0m×200μm×0.33μm)，进样量1μl，分流比1:1载气H2尾吹气高纯N2，助燃气空气，流速0.8mL/min。汽化室温度250℃、检测器温度300℃，柱前压10.0psi(1psi＝6.895kpa)。二阶程序升高柱温：l70℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升温至310℃，维持1.5min。各成分脂肪酸通过MIDISherlock微生物鉴定系统(Version6.1，MIDI，Inc.，Newark，DE)，标准品购于美国MIDI公司的C9-C20的脂肪酸甲酯，定量分析以正十九烷酸甲酯(19:0)为内标。

按照Frostegard(1993)的方法，对PLFAs进行命名。代表细菌的标记性的磷脂脂肪酸有14:00、14:0iso、15:0anteiso、15:0iso、15:1isoG、16:00、16:0anteiso、16:0iso、16:12OH、16:1isoG、16:1w5c、16:1w9c、17:0anteiso、17:0cyclo、17:0iso、17:1w8c、18:00、18:1w7c11-methyl、19:0cyclow8c、20:1w9c、12:00、17:00、10:03OH、13:00；代表放线菌标记性的磷脂脂肪酸有17:010-methyl、18:010-methyl，TBSA；代表真菌标记性磷脂脂肪酸18:1w9c；代表原生生物标记性的磷脂脂肪酸有20:4w6，9，12，15c，18:3w6c(6，9，12)。

(3)荞麦根系分泌物对甘蓝根肿病的影响

①荞麦根系分泌物的少量收集：将花荞、苦荞种子在25℃条件下催芽2d，播种在盛有1/2Hoagland营养液的小烧杯的纱布上，每杯播15颗，营造密闭不透光的环境，在25℃人工气候室中培养7d后收集含根系分泌物的溶液，在苗子培养期间需向烧杯中加入营养液以保持其体积不变。将收集的含根系分泌物的溶液在超净工作台上用细菌过滤器(其滤膜的孔径为0.22um)过滤灭菌，过滤灭菌的滤液保存于4℃冰箱内，用于根肿菌休眠孢子的萌发试验。

②根肿菌休眠孢子悬浮液的制备：参考肖崇刚的方法有所改进，根据土重计算应称取的肿根量，用自来水下冲洗干净后，按大约1:3比例加无菌水用组织搅碎机搅成匀浆，用8层医用纱布过滤，滤液移入离心管，以500r/min离心5min，取上清液及上层的灰色沉淀，加无菌水悬浮，3100r/min离心15min，去上清液，沉淀溶于无菌水中，3100r/min离心10min，去上清液(此步骤可重复2-3次)，将沉淀溶于一定量的无菌水中，配制成浓度为2×10⁸个/ml的母液(利用纽鲍尔血球计数板计数)，保存于4℃冰箱内备用。

③休眠孢子萌发试验设计：将休眠孢子悬浮液加入到过滤灭菌的根系分泌物溶液中，将孢子浓度稀释至10⁸个/ml。将4.5ml含有根肿菌休眠孢子悬浮液的根系分泌物溶液加入到灭菌的试管中，无菌水作为对照。每个处理3次重复，在24℃的培养箱内进行黑暗培养，10d后镜检孢子萌发情况。

④休眠孢子萌发的判定：采用孙良菲等的1％地衣红染液染色判断取一定量的休眠孢子悬浮液均匀的涂抹在载玻片上，自然干燥或在酒精灯上微热干燥，滴入1％地衣红染液染色2-3min，然后用95％的酒精冲洗掉残留的地衣红染液，待其干燥后滴入一定量的15％的甘油(已灭菌)作为浮载剂并盖上盖玻片观察。显微镜下整个孢子都被地衣红染上色的为未萌发的休眠孢子，只有孢子的边缘被染上色，中间透明的孢子为萌发的休眠孢子。将待测根肿病菌的休眠孢子用地衣红染液染色后，显微镜下镜检孢子萌发数，记载孢子萌发情况并计算孢子萌发抑制率。计算荞麦根系分泌物对休眠孢子萌发的影响。

休眠孢子萌发率＝孢子萌发数/调查孢子总数×100％；

休眠孢子萌发抑制率＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100％。

⑤荞麦根系分泌物的大量收集：采用自制荞麦水培系统，由塑料盆、泡沫板、通气泵构成。用蒸馏水制成剂量为1/2Hoagland营养液，每盆盛5L营养液。在泡沫板上小孔中定植荞麦幼苗，尽量不伤根，每盆定植生长20d的荞麦植株，营造密闭不透光的环境，在25℃人工气候室中通气培养。每7d更换一次营养液，每次更换的营养液保存于4℃下备用，共培养50d，用于浇灌甘蓝。

⑥接种方法：用菌土法(2×10⁸g/干土)接种根肿菌，在播种前5d，播种时，播种后每隔5d，用所获得的荞麦根系分泌物浇灌，设置营养液处理对照(CK)，50d左右调查植株的发病率和病情指数，。

⑦土壤中的休眠孢子含量的测定：取10g含休眠孢子的土样溶于20ml0.05％Tween80(polyoxyethylenesorbitanmonooleate)溶液中，置于摇床上摇2-3h。混合液依次通过100、120、200、50目的筛网，滤去有机物质和砂粒，收集滤液，滤液3100r/min下离心15min，弃上清液，沉淀重溶于50ml灭菌水中，3100r/min离心10min，此步操作可重复2-3次。弃上清液，在沉淀中加5ml50％蔗糖溶液，混匀后，3100r/min离心10min，用移液枪把上清液小心移入一干净的离心管，加25ml灭菌水，3100r/min离心10min，弃上清液，沉淀重溶于25ml灭菌水，3100r/min离心10min，此步操作可重复2次，最后沉淀溶于5ml灭菌水备用。取一滴休眠抱子提取液与载玻片上，盖上盖玻片，于400倍显微镜下镜检，并在血球计数板上计数，按照下面的公式计算每毫升带菌溶液中的孢子含量。

(4)实验结果

从表1可以看出：花荞处理的甘蓝根肿病的发病率为80.0％，苦荞处理的甘蓝根肿病的发病率为87.5％，与单作100％的发病率相比分别降低了20.0％、12.5％。苦荞和花荞间作后病情指数分别比对照降低了14.38％、13.13％。田间结果表明：甘蓝单作根肿病发病率为88.5％，间作处理甘蓝中，苦荞处理的甘蓝根肿病的发病率为58.0％，花荞处理的甘蓝根肿病发病率为67.5％。相对于甘蓝单作对照，苦荞处理的甘蓝根肿病病情指数降低了23.63％，花荞处理的降低了13.13％。

通过甘蓝和荞麦轮作有效防治了根肿病的发生。室内防效试验发现：与甘蓝单作相比，苦荞与甘蓝轮作的发病率、病情指数分别降低了77.5％、77.87％；花荞与甘蓝轮作的发病率、病情指数各降低了80％、84.10％。田间防效结果：甘蓝单作根肿病发病率为88.5％。苦荞与甘蓝轮作，甘蓝根肿病的发病率为20.0％。花荞与甘蓝轮作同前，与甘蓝单作相比，发病率降低了68.5％。苦荞处理的甘蓝根肿病的病情指数为11.25，与对照相比降低了39.38％。花荞处理的甘蓝根肿病的病情指数为15.63，与对照相比降低了35.00％。

表1不同处理对甘蓝根肿病的影响

通过浇灌荞麦的根系分泌物发现对甘蓝根肿病的发生具有良好的防治效果。未浇灌荞麦根系分泌物的甘蓝根肿病发病率极显著高于浇灌花荞根系分泌物，其又极显著高于浇灌苦荞根系分泌物的发病率。

参考文献：

[1]汪灿，阮仁武，袁晓辉，等.荞麦茎秆解剖结构和木质素代谢及其与抗倒性的关系[J].作物学报，2014，10期(10):1846-1856.

[2]张庆平，刘中兴.荞麦根系分泌物对小麦全蚀病菌的抑制及根际微生物种群数量观察[J].内蒙古农业科技，1994，(01):8-9.

[3]王立波，邵萌，高慧媛，等.金荞麦抗菌活性研究[J].中国微生态学杂志，2005，(05):330-331.

[4]冯黎莎，付先龙，陈放，等.金荞麦提取物对植物病原菌的抑菌活性初探[J].四川大学学报：自然科学版，2006，(03):688-691.