一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法

摘要

本发明公开了一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，该方法包括以下步骤：将iPS细胞消化后吹吸分散成单个细胞悬液，分种在培养孔中，每孔加入ROCK抑制剂；分种后的第一天，吸弃上清液，加入神经诱导完全培养基，培养直至获得P1代的神经干细胞；将P1代的神经干细胞接种到神经元诱导培养基中培养，培养基中要添加雷帕霉素以促进自噬的发生；2天后，将培养基更换为添加低浓度的雷帕霉素以促进自噬的神经元细胞分化培养基，培养至12-15天可诱导分化为神经元细胞。本发明方法可加快神经元的诱导分化形成，并且改善了脊髓小脑共济失调三型iPS的神经元生长状态。

说明书

技术领域

本发明涉及一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，该方法 通过增强自噬提高诱导分化效率。

背景技术

神经元是一种不可再生的细胞，因此在人类一些损伤神经元的疾病中，会 产生一些不可逆的后果。随着人类寿命的延长，阿尔茨海默病、脑血管意外等 神经元受累的疾病增加，而人的诱导多能干细胞可诱导分化为有功能的神经元， 该技术为治疗这一类疾病提供了可能性。但是从诱导多能干细胞或者胚胎干细 胞诱导分化为神经元需要繁杂的过程，如涉及悬浮培养或者外源细胞共培养的 方法。这些方法均有操作繁琐及耗时长等缺点。而Drury-Stewart等使用一些小 分子，很好地解决了悬浮及外源细胞共培养等问题。Life公司也有相关的试剂盒 产品解决了这一问题。但是从诱导多能干细胞或者胚胎干细胞诱导为神经元需 要数周，耗时长的问题仍未得到很好的解决。因此亟需一种简便快捷的方法进 行神经分化。

自噬(autophagy)是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊 泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实 现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。

脊髓小脑性共济失调(SpinocerebellarAtaxia，SCA)是一组遗传异质性很 大的神经系统变性疾病。ATXN3基因编码ATAXIN-3蛋白，该基因CAG拷贝数 动态突变时，其编码的蛋白羧基端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,PolyQ)链异常 扩展以及蛋白质的异常聚集，引起细胞功能障碍，从而引起神经毒性而致病。 除了传统的泛素蛋白酶降解系统，自噬是真核细胞中一种高度保守的、通过溶 酶体机制途径发挥作用的降解通路，与神经退行性疾病等疾病密切相关。研究 表明诱导自噬能够降解聚集突变的ATAXIN-3蛋白，从而防止SCA3/MJD以及 其他神经退行性疾病的发生。SCA3诱导多能干细胞是很好的研究SCA3发病的 工具。但是自噬在SCA3诱导多能干细胞诱导分化为神经元中起到的作用尚需 明确。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种促进人诱导多能 干细胞向神经元诱导分化的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，包括以下步骤：

(1)融合度70-80％的人诱导多能干细胞(iPS细胞)，加入预热的细胞消 化液后37℃孵育5分钟，接着用移液管吹吸若干次，使细胞分散成单个细胞 悬液，然后将细胞分种在培养孔中；每孔加入ROCK抑制剂后放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

(2)分种后的第一天，吸弃培养孔的上清液以除去未贴壁的细胞，加入预 热的神经诱导完全培养基，置于培养箱中继续培养；此后隔天换液，分 种后第七天可获得P0代的神经干细胞(NSCs)，继续培养3-4天获得P1代的神 经干细胞；

(3)将聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿置于37℃、5％CO₂的培养箱中 培养1h，接着在培养皿中添加神经元诱导培养基，再将步骤(2)传代后的P1 代的神经干细胞接种到培养皿中，接种密度为2.5×10⁴–5×10⁴个细胞/cm²；神经 元诱导培养基中要添加雷帕霉素以促进自噬的发生；培养2天后，将培养基更换 为神经元细胞分化培养基，每3–4天更换一次培养基，培养至12-15天可诱导分 化为神经元细胞；

步骤(1)所述的人诱导多能干细胞是在无滋养层条件下培养得到的无分化 或者仅含少量分化的克隆；所述的无滋养层条件，如使用Essential8^TM培养基以 Vitronectin或作为基质；

本发明所述的人诱导多能干细胞是以人体的皮肤细胞为材料，利用 episomalreprogrammingassay(Invitrogen,USA)重编程试剂盒诱导而成；

步骤(1)所述的细胞消化液优选细胞消化液；

步骤(1)中的分种密度，优选每个培养孔接种2.5×10⁵–3.0×10⁵个细胞；

所述的ROCK抑制剂优选ROCK抑制剂Y27632；

步骤(3)所述的神经元诱导培养基的组成与配比如下：

1×的KnockOut^TMDMEM/F-12培养基97mL；

2mM的GlutaMAX^TM-I添加剂1mL；

20ng/mL的bFGF20μL；

20ng/mL的EGF20μL；

2％的Neural添加剂2mL；

再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为100nmol/L。

步骤(3)所述的神经元细胞分化培养基的组成与配比如下：

1×的培养基97mL；

2％的无血清添加剂2mL；

2mM的GlutaMAX^TM-I添加剂1mL；

再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为10nmol/L。

自噬存在于ips的诱导分化过程中，体细胞具有较多细胞器，而iPS细胞器 较少，因此由体细胞诱导为iPS的过程中需要自噬参与。自噬是一个吞噬自身细 胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解 其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。 而iPS分化为神经干细胞及神经元也具有不同的细胞器及细胞结构，自噬在促进 细胞器的转换起作用，因此可加快iPS分化为神经干细胞及神经元。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明方法可加快神经元的诱导分化形成。在正常的iPS细胞向神经元 分化过程中，添加了雷帕霉素促进自噬后可以使细胞在14天左右即出现神经元 的形态。

2、本发明方法改善了脊髓小脑共济失调三型iPS的神经元生长状态。脊髓 小脑共济失调三型(SCA3)iPS分化为神经元后随着培养时间的延长，状态会 逐渐变差，加入雷帕霉素后，神经元的状态比没加雷帕霉素的神经元状态好。

附图说明

图1是分化培养到第14天时培养基中神经元细胞突起的形态图；其中，A- 对比例(×4)；B-对比例(×10)；C-实施例(×4)；D-实施例(×10)。

图2是SCA3病人的诱导多能干细胞在分化培养过程中神经元细胞突起的 形态图；其中，A-未添加雷帕霉素的(×4)；B-添加雷帕霉素的(×4)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例

一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，包括以下步骤：

(1)无滋养层条件下培养得到的人诱导多能干细胞(iPS)，当融合度为 70-80％时，加入预热的细胞消化液后37℃孵育5分钟，接 着用移液管吹吸若干次，使细胞分散成单个细胞悬液，然后将细胞分种在培养孔 中；分种密度是每个培养孔接种2.5×10⁵–3.0×10⁵个细胞；分种时，可以在培养 孔中加入10μMROCK抑制剂Y27632，以防止细胞死亡；

(2)分种后的第一天，吸弃培养孔的上清液以除去未贴壁的细胞，加入预 热的神经诱导完全培养基，置于培养箱中继续培养；此后隔天换液，分 种后第七天可获得P0代的神经干细胞(NSCs)，继续培养3-4天获得P1代的神 经干细胞；

(3)将聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿置于37℃、5％CO₂的培养箱中 培养1h，接着在培养皿中添加神经元诱导培养基，再将步骤(2)传代后的P1 代的神经干细胞接种到培养皿中，接种密度为2.5×10⁴–5×10⁴个细胞/cm²；神经 元诱导培养基中要添加雷帕霉素以促进自噬的发生；培养2天后，将培养基更换 为神经元细胞分化培养基，每3–4天更换一次培养基，培养至12-15天可诱导分 化为神经元细胞；

步骤(3)所述的神经元诱导培养基的组成与配比如下：

1×的KnockOut^TMDMEM/F-12培养基97mL；

2mM的GlutaMAX^TM-I添加剂1mL；

20ng/mL的bFGF20μL；

20ng/mL的EGF20μL；

2％的Neural添加剂2mL；

再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为100nmol/L。

步骤(3)所述的神经元细胞分化培养基的组成与配比如下：

1×的培养基97mL；

2％的无血清添加剂2mL；

2mM的GlutaMAX^TM-I添加剂1mL；

再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为10nmol/L。

对比例

一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，在神经元诱导培养基 和神经元细胞分化培养基中均不添加雷帕霉素，其他步骤和操作同实施例。

在实验结束时，采用普通倒置显微镜观察培养基是否出现神经元细胞突起。 结果如图1所示，分化培养到第14天时培养基中神经元细胞突起的形态，添加 了雷帕霉素的细胞更快出现神经元形态。可见添加了雷帕霉素可加快神经元的 分化。

同时采用SCA3病人皮肤来源的人诱导多能干细胞(iPS)进行实验，采用 实施例和对比例的方法，在实验结束时，采用普通倒置显微镜观察培养基是否出 现神经元细胞突起。结果如图2所示，SCA3病人的诱导多能干细胞在分化培养 过程中，神经元细胞状态较好。可见，加入雷帕霉素后改善了脊髓小脑共济失调 三型iPS的神经元生长状态。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。