一株重组大肠杆菌及其在发酵生产2Fe2S铁氧还蛋白中的应用

摘要

本发明公开了一株重组大肠杆菌，所述菌命名为大肠杆菌(Escherichia？coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet-S33[2Fe2S]Fd，该菌株含有来源于根癌农杆菌(Agrobacterium？tumefaciens)S33的[2Fe2S]铁氧还蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；所述重组大肠杆菌是将[2Fe2S]铁氧还蛋白基因连接入pETDuet-1载体，制得重组质粒命名为pETDuet-[2Fe2S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coli？C41(DE3)中获得。本发明还公开了所述重组大肠杆菌在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用，实验证实：每升发酵培养物最终可以获得23mg纯化后的[2Fe2S]铁氧还蛋白，远大于之前报道的从野生菌中纯化出来的0.03mg的产量，预示本发明提供的重组大肠杆菌在工业化生产中具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组工程菌及其应用，尤其涉及一种用于发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌及其应用。

背景技术

铁氧还蛋白是一类含铁硫簇的酸性蛋白，其中的铁硫簇又主要分为[4Fe4S]、[2Fe2S]、[3Fe4S]等类型。铁氧还蛋白作为一种常见的电子载体，参与呼吸作用、光合作用、发酵等重要代谢过程。目前，商业上出售的只有来自菠菜的[2Fe2S]型铁氧还蛋白，然而因物种差异，该铁氧还蛋白在分析来自其他物种的酶的时候表现出不同的效率，且该蛋白价格非常昂贵，这在很大程度上限制了铁氧化还原蛋白的应用和科学家对铁氧还蛋白相关的酶和代谢过程的研究。

在已有的文献报道中，大部分铁氧还蛋白是从野生细菌等生物体中纯化获得的，也有通过异源表达来制备，但这些方法具有很多不足，比如消耗大量的时间，纯化步骤繁琐，表达量低，铁氧还蛋白的铁硫簇组装不完整而活力较低，最终产量和纯度较低等。基于此，研究和开发能够高效表达[2Fe2S]铁氧还蛋白的方法成为目前亟待解决的课题，经检索，有关能够高效表达[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌及其在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高效表达2Fe2S铁氧还蛋白的重组大肠杆菌及其应用。

本发明所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet-S33[2Fe2S]Fd，该菌株含有来源于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)S33的[2Fe2S]铁氧还蛋白基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述重组大肠杆菌是将[2Fe2S]铁氧还蛋白基因连接入pETDuet-1载体，制得重组质粒命名为pETDuet-[2Fe2S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coliC41(DE3)中获得。

本发明所述的重组大肠杆菌在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用。

其中，所述重组大肠杆菌发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白的方法是：

(1)将重组大肠杆菌菌株以体积比1～5％的接种量接种到含有抗生素和铁硫源的TB培养基中，在37±1℃和180±10rpm转速条件下培养2～3小时至OD_620nm为0.4～0.6，获得菌液；

其中，上述TB培养基的配方及组分终浓度是：Tryptone12g/L，Yeastextract24g/L，Glycerol4ml/L，KH₂PO₄2.3g/L，K₂HPO₄12.5g/L；

上述抗生素分别是终浓度为25μg/ml的氯霉素，终浓度为10μg/ml的四环素，终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素；

上述铁硫源配方及组分终浓度是：柠檬酸铁铵0.2-0.3g/L，L-半胱氨酸0.1-0.2g/L，柠檬酸铁0.18-0.3g/L，FeSO₄·7H₂O0.25-0.4g/L；

(2)向制得的菌液中加入终浓度为0.5mM的IPTG，在16～37℃和180±10rpm转速下诱导2.5～24小时，收集培养液离心，获得含[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌细胞；

(3)破碎细胞，分离纯化制备[2Fe2S]铁氧还蛋白。

上述的应用中，步骤(2)所述IPTG优选在35～37℃和180rpm转速下诱导10～24小时。

步骤(3)中破碎细胞的方法是：将离心后获得的含[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌细胞用含10％甘油的缓冲液A重悬后，采用超声波破碎仪器进行细胞破碎，12,000转/分钟离心30min，取上清液用0.22um孔径滤膜过滤，即获得含有组氨酸标签的[2Fe2S]铁氧还蛋白粗酶液。

步骤(3)中分离纯化制备[2Fe2S]铁氧还蛋白的方法是：

镍柱纯化：将制得含有组氨酸标签的[2Fe2S]铁氧还蛋白粗酶液经过上样柱进入镍柱中，上样速度为2ml/min。上样结束，用缓冲液A冲洗镍柱，去除杂蛋白。再用缓冲液A和B按一定比例混合，进行梯度洗脱，收集目的蛋白。将纯度不够的蛋白用缓冲液C浓缩洗涤，进行DEAE柱纯化,用缓冲液C和D按一定比例混合，进行梯度洗脱，收集目的蛋白。

洗脱出来的蛋白用浓缩管进行浓缩，并用洗涤缓冲液洗涤蛋白，SDS-PAGE观察蛋白的大小及纯度，用考马斯亮蓝法测蛋白含量，用分光光度计对蛋白进行全波长扫描。

最后得到纯化好的蛋白在厌氧条件下低温储存。

活性测定：分别用氢化酶和NfnAB两种酶测定纯化出来的铁氧还蛋白的活性。

上述缓冲液A的配方是：磷酸钠20mM，NaCl0.5M，pH7.4。

上述缓冲液B的配方是：磷酸钠20mM，NaCl0.5M，咪唑500mM，pH7.4。

上述缓冲液C的配方是：磷酸钠50mM，pH7.0。

上述缓冲液D的配方是：磷酸钠50mM，1MNaCl，pH7.0。

上述步骤所有操作过程均在厌氧操作箱中进行，所有溶液均进行煮沸后脱气厌氧处理。

本发明成功构建了能够表达带有组氨酸标签的[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌，它的应用就是大家熟悉的大肠杆菌中异源表达的方法，不需要大量培养产铁氧还蛋白的野生菌，节省了大量的时间，节约了成本。

本发明的重组大肠杆菌种含有的pCodonPlus与pRKISC质粒和诱导时加入的铁硫源促进了蛋白上铁硫簇的合成，活力强表达量高，使[2Fe2S]铁氧还蛋白最终产量显著提升。实验证实：通过SDS-PAGE观察蛋白纯度较好，大小与预期的相符；每升培养物最终可以获得23mg纯化后的[2Fe2S]铁氧还蛋白，远大于报道中的野生菌中纯化的0.03mg/l；蛋白进行全波长扫描后在325，415和456nm处有特征吸收峰(见图1)，说明铁硫簇构建比较完整，获得的融合标签的铁氧还蛋白具有与野生蛋白相同的活性。活性检测中分别测得氢化酶的比活为12.5±1.8U/mg，NfnAB的比活为33.8±4.1U/mg。预示本发明提供的重组大肠杆菌在工业化生产中具有很好的应用前景。

附图说明

图1：为本发明所述重组大肠杆菌表达的带有组氨酸标签的[2Fe2S]铁氧还蛋白全波长扫描图。

其中：在325，415和456nm处显示有特征吸收峰。

图2：为本发明所述重组大肠杆菌表达的带有组氨酸标签的[2Fe2S]铁氧还蛋白SDS-PAGE电泳图。

其中，M表示蛋白marker，1表示目的蛋白在大肠杆菌中异源表达后的粗酶液，2表示镍柱纯化后的[2Fe2S]铁氧还蛋白，3表示DEAE柱纯化后的蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明内容作进一步阐述。

本发明中所用菌株、材料及来源说明：

含pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coliC41(DE3)细胞由Dr.YasuhiroTakahashi(大阪大学)构建和提供，其中pCodonPlus和E.coliC41(DE3)分别来自Stratagene公司和Lucigen公司。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)S33由山东大学王书宁筛选，保存于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCM206131。

质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。QIAampDNAMini试剂盒、MinElutePCR纯化试剂盒购自Qiagen公司。Wizard基因组DNA纯化试剂盒购自Promega公司。pETDuet-1载体购自Novagen公司。高保真FastPfuDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。pEASY-Blunt克隆载体购自北京全式金生物技术有限公司。E.coliMach1-T1细胞购自Invitrogen公司。内切酶、T4DNA连接酶购自Thermo公司。采用的镍柱为HisTrapHPColumn，购自GEHealthcare公司。

实施例1：高效表达AgrobacteriumtumefaciensS33中的[2Fe2S]型铁氧还蛋白的重组大肠杆菌的构建

取AgrobacteriumtumefaciensS33细胞，按照细菌基因组DNA提取试剂盒推荐方法，从AgrobacteriumtumefaciensS33细胞中提取基因组DNA。

根据已知的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)S33基因组中[2Fe2S]型铁氧还蛋白基因序列如SEQIDNO.1所示，设计引物如下：

F引物：5'CGCGGATCCGATGACAAAACTGACAATCGTTGC3'

R引物：5'CCCAAGCTTTCAGCCCTGGCGCTCAGGAAC3'

以提取的AgrobacteriumtumefaciensS33基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得[2Fe2S]型铁氧还蛋白基因。PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：

95℃5min

95℃30s，55℃30s，72℃30s30个循环

72℃10min

4℃保温

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳初步确认正确后，用DNA纯化回收试剂盒纯化。将纯化的PCR产物与pETDuet-1载体分别用BamHI和HindIII在37℃酶切20分钟，酶切体系如下：

用DNA纯化回收试剂盒回收后进行连接，连接反应体系如下：

25℃反应20分钟，所得连接产物在冰上加入到E.coliC41(DE3)感受态细胞中，冰浴30分钟，37℃热击5分钟，冰浴5分钟，加入500μlLB液体培养基，37℃震荡培养1小时，在含氯霉素、四环素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养12小时，挑取单菌落，BamHI和HindⅢ双酶切验证和测序筛选阳性克隆。

最终得到了成功构建的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet-S33[2Fe2S]Fd。

实施例2:重组大肠杆菌高效表达[2Fe2S]铁氧还蛋白的应用

(1)将实施例1构建的重组大肠杆菌菌株以体积比1％的接种量接种到含有抗生素和铁硫源的TB培养基中，在37℃和180rpm转速条件下培养2～3小时至OD_620nm为0.6，获得菌液；

其中，上述TB培养基的配方及组分终浓度是：Tryptone12g/L，Yeastextract24g/L，Glycerol4ml/L，KH₂PO₄2.3g/L，K₂HPO₄12.5g/L；

上述抗生素分别是终浓度为25μg/ml的氯霉素，终浓度为10μg/ml的四环素，终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素；

上述铁硫源配方及组分终浓度是：柠檬酸铁铵0.2-0.3g/L，L-半胱氨酸0.1-0.2g/L，柠檬酸铁0.18-0.3g/L，FeSO₄·7H₂O0.25-0.4g/L；

(2)向制得的菌液中加入终浓度为0.5mM的IPTG，在37℃和180rpm转速下诱导24小时，收集培养液6,000转/分钟离心10min，获得含[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌细胞；

或再用50mM磷酸钠(pH7.4)进行洗涤，再用相同的条件离心，重复2次，收集沉淀的细胞放﹣20℃冻存；

(3)破碎细胞，分离纯化制备[2Fe2S]铁氧还蛋白。

实施例3：[2Fe2S]铁氧还蛋白的分离纯化及活性测定。

蛋白的纯化在厌氧操作箱中进行，用到的所有溶液均进行煮沸后脱气厌氧处理。

配制纯化所需的缓冲液：缓冲液A：磷酸钠20mM，NaCl0.5M，pH7.4；缓冲液B：磷酸钠20mM，NaCl0.5M，咪唑250mM，pH7.4；缓冲液C的配方是：磷酸钠50mM，pH7.0；缓冲液D的配方是：磷酸钠50mM，1MNaCl，pH7.0；缓冲液W的配方是：磷酸钠50mM，pH7.4。

粗酶液的获取：将实施例2制得的冻存细胞用含10％甘油的缓冲液A重悬，采用超声波破碎仪器进行细胞破碎，胞破碎程序是：工作时间6秒，间歇时间6秒，功率39％，总破碎时间为50分钟。破碎完成后12,000转/分钟离心30min，取上清液用0.22um孔径滤膜过滤，置于冰上作为粗酶液待纯化。

镍柱的处理：将镍柱装在FPLC上，以缓冲液A、缓冲液B、缓冲液A的顺序冲洗柱子，每次冲洗5分钟，冲洗速度为5ml/min。

蛋白的纯化：粗酶液经过上样柱进入镍柱中，上样速度为2ml/min。上样结束，用缓冲液A冲洗镍柱，去除杂蛋白，这时的洗脱速度为4ml/min。然后用缓冲液A和B按设定比例混合，进行梯度洗脱，各个梯度中咪唑含量分别为50mM、87.5mM、112.5mM、137.5mM、250mM。最终在112.5mM咪唑下洗脱出棕色的目的蛋白。若目的蛋白纯度不够，需要进一步纯化。

DEAE纯化：镍柱纯化后用缓冲液C洗涤蛋白浓缩脱盐，经过上样环进入DEAE柱中，上样速度为1ml/min。上样结束，用缓冲液C冲洗镍柱，去除杂蛋白，这时的洗脱速度为4ml/min。然后用缓冲液C和D按设定比例混合，进行梯度洗脱，各个梯度中NaCl含量分别为200mM、350mM、550mM、1M。最终目的蛋白在350mMNaCl浓度下洗脱出来。

蛋白的处理：用大小为3KDa的浓缩管将蛋白浓缩，并用缓冲液W洗涤蛋白，SDS-PAGE观察蛋白的大小及纯度，用考马斯亮蓝法测蛋白含量，用分光光度计对蛋白进行全波长扫描。

铁氧还原蛋白的产量测定：

通过考马斯亮蓝法测定纯化的铁氧还蛋白含量，得到铁氧还蛋白的产量为2～23mg/l培养物，其中最优诱导条件下产量为最高，达到23mg/l培养物。

铁氧还蛋白的活性测定：

氢化酶法测活性：以纯化获得的铁氧还蛋白为底物，采用分光光度法测定AgrobacteriumtumefaciensS33氢化酶催化氢气还原铁氧还蛋白的活性，测量波长为457nm，1cm石英比色皿，充满氢气，反应体系如下：

Tris-HCl缓冲液pH7.5500ul

[2Fe2S]型铁氧还蛋白20ul(终浓度：0.036mM)

氢化酶酶液10ul

以氢化酶酶液起始反应，可以发现体系吸光值逐渐降低，最后趋于平缓，通过吸光值下降的速度再根据朗伯比尔定律计算氢化酶的比活，计算公式如下：

上述是每分钟吸光度变化值，

V_总是总反应体系的体积，单位ml；

V_酶是加入氢化酶酶液的体积，单位ml；

N是氢化酶酶液的浓度，单位mg/ml；

L是比色皿的光程，单位cm；

ε是[2Fe2S]型铁氧还蛋白在457nm的摩尔消光系数，为9.3mM^-1·cm^-1。

NfnAB法测活性

以纯化获得的铁氧还蛋白为底物，采用分光光度法测定来自C.kluyveriNfnAB酶液催化NADPH在存在NAD⁺情况下还原铁氧还蛋白的活力，测量波长为457nm，1cm石英比色皿，充满氮气，反应体系如下：

以NfnAB酶液起始反应，可以发现体系吸光值逐渐降低，最后趋于平缓，通过吸光值下降的速度再根据朗伯比尔定律计算氢化酶的比活，计算公式如下：

上述是每分钟吸光度变化值，

V_总是总反应体系的体积，单位ml；

V_酶是加入NfnAB酶液的体积，单位ml；

N是NfnAB酶液的浓度，单位mg/ml；

L是比色皿的光程，单位cm；

ε是[2Fe2S]型铁氧还蛋白在457nm的摩尔消光系数，为9.3mM^-1·cm^-1。

通过以上方法分别测得氢化酶的比活为12.5±1.8U/mg，NfnAB的比活为33.8±4.1U/mg。