一种解淀粉芽孢杆菌及促植物生长制剂和应用

摘要

本发明公开一种解淀粉芽孢杆菌及促植物生长制剂和应用。所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)YN2010-KC，其保藏号为：CGMCC？No.5722。本发明促植物生长制剂通过该菌株发酵制备而得。本发明菌株及其制剂能显著地促进植物生长和促进农作物增产。其生产成本低，其制备工艺简单，施用方法简单易行，可直接浸种、拌种、灌根或浸泡植物。还可作为微生物肥料，属环境友好型生物制剂，能减少环境污染并能修复土壤。

说明书

技术领域

本发明属于微生物肥料技术领域，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌、含解淀粉 芽孢杆菌的菌剂及其制备方法、以及由解淀粉芽孢杆菌制备的菌剂在促进植物生 长和生根方面的的应用。

背景技术

长期以来，在农业生产中大量施用化学肥料，虽然化学肥料肥效较明显，但 由于化肥里面所含的无机养分容易被土壤中所含的石灰等成分所固定，导致土壤 板结，微生物消失，地力下降，使土壤积累众多的有害化学残留物，病虫害猖獗， 且大量化肥的施用还会对水源造成严重污染，致使农业生态环境和人类生存环境 均受到严重威胁。与此同时，过量化肥还会直接影响了农产品品质和产量，降低 了农产品的市场竞争力。

在化肥带来一些负面影响的同时，微生物肥料日益受到人们的关注，在现代 农业的可持续发展中占有越来越重要的作用与地位。微生物肥料是活体肥料，含 有大量有益微生物，施入土壤后，大量活的微生物在适宜条件下能够积极活动， 可激活因长期使用化学肥料造成的土壤板结及残留的氮磷钾元素，增加土壤有机 质含量，分泌生长激素刺激作物生长，促进根系发育，改善农作物的品质，提高 作物抗旱、抗病能力，为作物增产增收打下良好的基础。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是芽孢杆菌属中的一个种，是土 壤和植物微生态的优势群，也是一种有益微生物。具有较强的次级代谢产物的生 产能力，可分泌植物生长激素，如吲哚乙酸，促进植物生长；可分泌植酸酶和有 机酸，降解土壤中植酸及矿质磷；可以产生多种抑菌相关的代谢产物，如蛋白酶， 杆菌素、杆菌烯、风齐素，大环内酯等，对真菌和细菌都具有强烈的抑制作用， 具有实际应用的潜力。

发明内容

本发明目的是提供一种无毒、无污染、无残留和安全的微生物制剂促进植物 生长、生根、成活及提高农作物产量。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案如下：

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KC，其保藏 号为：CGMCCNo.5722。

2.一种促植物生长制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将技术方案1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) YN2010-KCCGMCCNo.5722活化后，按5～10％接种量，将活化的解淀粉芽孢 杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种到种子培养 基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36～48h，得到一级 种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH7.0～7.2；

(2)按10～12％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基， 在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa 条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的 以下成分组成：淀粉1.5～3％，麸皮粉1～2％，酵母膏0.05～0.3％，蛋白胨0.5～1％， 磷矿粉1～2％，MgSO₄·7H₂O0.01～0.05％，CaCl₂0.1～0.4％，(NH₄)₂SO₄0.01～0.04％， 余量为水，pH7.0～7.2；

(3)按10～12％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在 28～37℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条 件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数≧1×10⁸cfu/ml时，将发酵液用医用 塑料瓶包装，即为所述促植物生长制剂，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级 种子培养基相同。

3.一种促植物生长制剂，所述促植物生长制剂含有技术方案1所述的解淀 粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722。

4.一种促植物生长制剂，按技术方案2所述的制备方法制备得到。

5.技术方案3或4所述的促植物生长制剂在促进植物生长上的应用。

6.根据技术方案5所述的应用为在浸种、拌种、育苗、扦插或林木移栽的 应用。

7.根据技术方案5所述的应用为在提高农作物产量上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明菌株及其制剂能显著地促进植物生长和促进农作物增产。

在植物插条生根方面，其成活率在95％以上，比NAA生根粉提高30～40％， 树木移栽的成活率在93％以上，比NAA生根粉提高40～50％；在粮食作物拌种、 浸泡处理上显著增产和促生长，比清水对照平均增产10％，比FZB42悬浮剂平 均增产6.69％；在番茄、黄瓜、大蒜等蔬菜上应用，在番茄上，比清水对照增产 17.34％，比FZB42悬浮剂增产5.48％；在黄瓜上，比清水对照增产12.53％，比 FZB42悬浮剂增产5.24％；在大蒜上，其根数、植株鲜重、株高，比FZB42悬 浮剂，分别增加6.57％、6.07％、4.92％。本发明制剂既是一种微生物肥料，又是 一种植物生长调节剂。

2、本发明菌株及其制剂作为植物生长调节剂、微生物肥料，在生产中避 免了“三废”污染，属环境友好型生物制剂，能减少环境污染并能修复土壤， 其制备工艺简单，成本低。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensYN2010-KC于 2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称： CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5722，并于2012年1月12日检测为存活。 该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明，各实施例无特殊说明为常规方法。以下实施例 所述的FZB42悬浮剂为市售，是一种含解淀粉芽孢杆菌的微生物肥料产品。.

实施例1本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KC 的获得、鉴定和保藏

1、本发明解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的获得

1.1材料

采自云南农业大学后山农场玉米根际周围的土壤。

1.2培养基制备

将LB固体培养基和PSA培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)融化，分别倒 入灭菌培养皿，冷却，制成LB和PSA平板。

1.3分离培养

采用稀释平皿分离法和平板划线分离，将分离纯化所得的一菌株命名为 YN2010-KC。

2、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的鉴定

2.1、形态学鉴定

取菌株YN2010-KC在LB培养基上培养，37℃培养36小时，进行形态观 察鉴定，菌体为杆状、端圆，周生鞭毛、具运动性，产生椭圆形芽孢；在LB和 PSA平板上菌落圆形、淡茶褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面干燥有褶皱。 与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001年)中描述的 芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株YN2010-KC属于芽孢杆菌(Bacillus spp.)。

2.2、生理生化鉴定

菌株革兰氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、柠檬酸盐利用、V-P 反应、接触酶反应、硝酸盐还原、明胶液化等均呈阳性。

3、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的保藏

经上述鉴定表明所分离获得的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其代号为YN2010-KC，所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensYN2010-KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5722，并于 2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，邮编:100101。

实施例2本发明促植物生长制剂的制备，包括以下步骤：

(1)一级种子液制备

将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCCNo.5722接种在液体LB培养基上，35℃培养24h，得活化的解淀粉芽 孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722，按10％接种 量，将活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCC No.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床 培养36h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH7.0～7.2；

(2)按10％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在 35℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa条件下 培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成 分组成：淀粉2％，麸皮粉1％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.5％，磷矿粉1％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，CaCl₂0.25％，(NH₄)₂SO₄0.03％，余量为水，pH7.0～7.2，所述二级种子 培养基于121℃灭菌30min，待降温至30℃，接入一级种子液。

(3)按10％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35℃， 转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养 48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数为1×10⁸cfu/ml时，将发酵液用医用 塑料瓶包装，即为所述促植物生长制剂，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级 种子培养基相同。

本发明促植物生长制剂按实施例2所述的促植物生长制剂的制备方法制备 得到。

实施例3本发明促植物生长制剂在促进植物生长上的应用

本发明促植物生长制剂以下简称：本产品。

一、总体操作

1、浸种

①浸泡：用本产品500～1000倍稀释液浸泡作物种子10～40分钟，捞出 种子，阴干后使用。

2、拌种

播种前，用本产品500～1000倍稀释液拌种，随后晾干，本产品稀释液用量 为种子量的1/50。

3、育苗

①播种后：马上使用本产品500～1000倍稀释液浇灌，以后每隔7-10天， 施用1次，共用3-4次；

②种植后：移栽后的小苗，立即使用本产品500～1000倍稀释液浇灌，以 后每隔7-10天，施用1次，共用3-4次。

4、扦插

①苗木扦插：木本花卉(如山茶、杜鹃花、玫瑰、紫薇、醉鱼草等)和经 济林木(如红豆杉、罗汉松、杉木、勃氏甜龙竹等)的枝条剪成带1-2个叶芽的 小段，在本产品200倍稀释液中浸泡5-10分钟或500倍稀释液中浸泡20-30分 钟后，扦插于苗床上，随后浇灌本产品500倍稀释液，以后每隔7-10天，施用1 次，共用3次。

②林木移栽：大型经济林木(如杉木、秃杉、桤木等)带土移栽时，用本 产品500-1000倍稀释液灌根，在覆土前，用该菌液少许浇湿树基部的土，覆土 后，再用同一浓度的菌液浇透，5-7天再浇一次，共用3次。

③打泥浆：用本产品100-500倍稀释液打成泥浆，可用于植物插条生根，也 可于裸根树苗移栽使用，移栽前将树苗根部放入所述的泥浆中，沾满所述的泥浆 后，直接移栽。

二、具体实例

(1)作为植物生长调节剂

以下本产品200倍稀释液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数为5.0×10⁵cfu/ml。

本产品500倍稀释液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数为2.0×10⁵cfu/ml。

本产品100稀释液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数为1.0×10⁶cfu/ml。

本产品1000倍液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数为1.0×10⁵cfu/mL；

①植物插条生根时，植物插条为如下经济林木、花卉枝条： 云南红豆杉(Taxusyunnanensis)、曼地亚红豆杉(Taxusmedia)、南方红豆杉(Taxus chinensis)、紫薇(Lagerstroemiaindica)、山茶(Camelliajapomica)、罗汉松 (Podocarpusmacrophyllus)、杉木(Cunninghamialanceolata)、勃氏甜龙竹 (Dendrocalamusbrandisii)、杜鹃花(Rhododendronspp.)、玫瑰(Rosarugose)、醉鱼 草(Buddlejalindleyana)，枝条剪成带1～2个叶芽的小段，在本产品200倍稀释 液中浸泡5-10分钟后，扦插于苗床上，随后浇灌本产品500倍稀释液，以后每 隔7天，浇灌1次，共浇灌3次；扦插成活率均在95％以上，比NAA生根粉提 高30～40％，所述NAA生根粉为浓度为500毫克/升的萘乙酸溶液。

②林木移栽：用以下大型经济林木带土移栽时，用本产品500倍稀释液灌 根，在覆土前，用本产品少许浇湿树基部的土，覆土后，再用同一浓度的本产品 浇透，6天再浇一次，共用3次。

③打泥浆：用本产品100稀释液(1.0×10⁶cfu/ml)打成泥浆，用于植物插条生 根，也可于裸根树苗移栽使用，移栽前将树苗根部放入所述的泥浆中，沾满所述 的泥浆后，直接移栽。

打泥浆移栽时，杉木(Cunninghamialanceolata)、秃杉(Floustaiwania)、桤木 (Longpedunclealder)、蕙兰(CymbidiumPumilum)的成活率均在93％以上，比上述 NAA生根粉提高40～50％。

灌根移栽时，华南松(Pinuskwangtungensis)的成活率达85％，比空白对照提 高40％以上。

④玉米(品种为会单4号)拌种：，试验地点在云南省玉溪市峨山县大龙潭 乡司城村。试验地土壤为红壤土，肥力中等。

试验共设3个处理：

处理1：本产品1000倍液拌种(浓度为1.0×10⁵cfu/mL)。

处理2：FZB42悬浮剂1000倍液(浓度为1.0×10⁵cfu/mL)。

处理3：清水拌种(CK)。

播种前拌种、晾干，清水或上述处理的菌液稀释液用量为种子量的1/50。平 整土地，打塘施肥和播种。各小区面积66.7m²，4次重复，完全随机区组排列。 采用宽窄行播种，大行距80cm，小行距40cm，株距25cm。

玉米试验结果(见表1)：

表1本产品对玉米生长性状和产量的影响

玉米产量：本产品(处理1)比对照(处理3)平均增产10.01％，比FZB42 悬浮剂(处理2)平均增产6.69％。

生长性状：本产品(处理1)比对照(处理3)的出苗率平均提高3.38％， 株高平均增加10.27％，穗位高平均提高28.07％，穗粗平均增加7.59％，穗长平 均增加7.08％。本产品(处理1)比FZB42悬浮剂(处理2)的出苗率平均提高 1.03％，株高平均增加1.45％，穗位高平均提高3.67％，穗粗平均增加4.61％，穗 长平均增加0.28％。

表明：本产品在促进玉米生长及玉米产量上显著高于FZB42悬浮剂处理和 对照。

(2)作为肥料

1)在蔬菜上应用

A、本产品在番茄、黄瓜上灌根应用

本产品在番茄、黄瓜上的田间促生长效果

对照为FZB42悬浮剂，在番茄(品种为绿亨108金樽)、黄瓜(品种为冬冠) 上进行促生长对比试验。

番茄和黄瓜试验在云南省昆明市呈贡蔬菜基地的日光温室中进行。温室为钢 架塑料大棚(长X宽＝63mx9m,567m²)，试验地土壤为棕壤，肥力上等。共设3 个处理：

处理1：本产品500倍液(浓度为2.0×10⁵cfu/mL)。

处理2：FZB42悬浮剂500倍液(浓度为2.0×10⁵cfu/mL)。

处理3：等量清水对照(CK)。

每个处理3次重复，随机排列。小区面积为8.4m(1.2mx7m)。起垄覆膜栽 培，株距33cm，小行距40cm，大行距80cm。

表2本产品对番茄、黄瓜生长性状和产量的影响

番茄试验结果表明：本产品和FZB42处理的番茄株高、茎粗、单果质量和 产量都显著或极显著高于对照，本产品500倍液小区产量比对照增产率达 17.34％，本产品500倍液比FZB42悬浮剂500倍液增产5.48％。

黄瓜试验结果表明：本产品和FZB42处理的黄瓜株高、茎粗、单果质量和产 量都显著或极显著高于对照。与对照相比，本产品500倍液小区产量增产率为 12.53％，比FZB42悬浮剂500倍液增产5.24％。

B、本产品浸种大蒜的促生长效果

试验在云南农业大学教学试验农场温室进行。设3个处理，处理1：本产品 1000倍液(1.0×10⁵cfu/mL)，处理2：FZB421000倍液(1.0×10⁵cfu/mL)，处理 3：清水空白对照(CK)。每个处理3次重复，随机排列，每重复50粒。浸种 8h后，立即播种于事先规划好的小区中，播种后各小区按同等水量浇水一次， 以浇透为准。其他管理按常规方法进行。27d后，测量其根长、植株鲜重、株高、 根数

在温室试验中，用3个处理浸种大蒜后，对其各生物学指标的影响结果见 表3。

表3本产品对浸种大蒜生长的影响

注：不同的小写字母表示在α＝0.05水平上差异显著，不同的大写字母表示在α＝0.01水 平上差异极显著。

从表1中可知：

与对照相比，不同处理对大蒜前期生长发育有不同程度的影响，效果最好 的为本产品1000倍液。与对照相比，就株高而言，本产品1000倍液、FZB421000 倍液处理分别增加27.26％，21.30％，均达到了差异极显著水平；不同处理对大 蒜的根数、鲜重有不同程度的影响，总体表现为，根数越多，对应的植株鲜重就 越高(表1)。原因是，须根数增加，有利于营养物质的吸收，为植物的生长发育 提供有利的条件。就根数而言，本产品1000倍液、FZB421000倍液处理分别增 加11.94％(差异显著)，5.03％；就植株鲜重而言，产品1000倍液、FZB421000 倍液处理分别增加60.0％，50.85％，均达到了差异极显著水平。

与FZB421000倍液(处理2)相比，就根数而言，本产品1000倍液比FZB42 1000倍液增加6.57％；就植株鲜重而言，本产品1000倍液比FZB421000倍液 增加6.07％；就株高而言，本产品1000倍液比FZB421000倍液增加4.92％。

(3)本发明产品在小麦上的促生长效果

试验设在云南农业大学校内，试验共设3个处理，处理1：本产品1000倍 液(浓度为1.0×10⁵cfu/mL)，处理2：FZB42悬浮剂1000倍液(浓度为 1.0×10⁵cfu/mL)，处理3：空白对照(CK)为清水处理。取上述不同处理各10mL 分别放入已标记好的培养皿中，再将表面消过毒的小麦品种川麦107分别放入培 养皿中进行拌种10min后，晾干，将种子放入装有土的培养皿中，每个培养皿 20粒种子，各处理3次重复，共3个处理。以后根据土壤干湿状况浇清水，以 保持土壤湿润，室内培养，5d后调查小麦植株生长状况。分别测量植株鲜重、 株高、根长，记录实验结果。

表4本产品拌种小麦的生长情况

注：不同的小写字母表示在α＝0.05水平上差异显著，不同的大写字母表示在α＝0.01水 平上差异极显著。

就拌种而言，不同处理对小麦发育前期各生物学指标有着不同程度的影响 (表4)，与清水对照相比，就植株鲜重而言，本产品1000倍液、FZB421000 倍液处理分别增加37.5％，12.5％，均达到了差异显著水平。就株高而言，本产 品1000倍液、FZB421000倍液处理分别增加34.14％，13.69％，均达到了差异 显著水平。就根长而言，本产品1000倍液、FZB421000倍液处理分别增加20.71％ (差异显著)，2.24％。

与FZB421000倍液(处理2)相比，就植株鲜重而言，本产品1000倍液比 FZB421000倍液增加22.22％；就株高而言，本产品1000倍液比FZB421000倍 液增加17.99％；就根长而言，本产品1000倍液比FZB421000倍液增加18.06％。