制备载脂蛋白A-I（Apo A-I）的方法

摘要

本发明涉及从含Apo？A-I的蛋白质级分(A)获得Apo？A-I的方法，包括悬浮含Apo？A-I的蛋白质级分(A)在缓冲溶液(B)中，从悬浮液中除去杂质，同时保持增溶的Apo？A-I蛋白质，随后从悬浮液中沉淀Apo？A-I和收集Apo？A-I沉淀物。通过这样的方法获得的Apo？A-I，由这种Apo？A-I获得的重构的HDL，和包括这样的Apo？A-I和/或重构的HDL等的药物组合物也被提供。

说明书

技术领域

本发明涉及从含有ApoA-I的蛋白质级分回收载脂蛋白A-I(Apo A-I)的方法。

背景技术

人载脂蛋白A-I是(HDL)的主要蛋白质组分，其是在血液中的重 要脂蛋白。它是由肝脏和小肠合成并负责的HDL在血中的生理功能；从 外周组织去除胆固醇，将其运载回肝脏或其它脂蛋白，这通过被称为“反 向胆固醇运输”(RCT)的机制。

根据流行病学和纵向研究，血清胆固醇水平的升高和冠状动脉心脏 疾病的发展之间的明显的相关性已被多次证实。

因此，高密度脂蛋白(HDL)中的ApoA-I被认为具有抗炎功能和 抑制冠心病的发生和发展。此外，ApoA-I已经显示出降低血液中低密 度脂蛋白(LDL)水平和已知结合到内毒素，从而在高密度脂蛋白的抗 内毒素作用中具有主要作用。

高密度脂蛋白和ApoA-I的“保护性”的作用作为其主要性质已在多 项研究中被证实，使得ApoA-I成为有希望的候选物(特别是作为重构 的HDL的一部分)，用于在动脉粥样硬化治疗，急性冠脉综合征的治 疗(ACS)，抗炎治疗，抗毒素治疗，肝靶向药物等中的应用。

人血浆在现今以大量被收集和被处理成各级分，其中一些含有载脂 蛋白A-I。所述级分可能由乙醇分级分离根据在美国最初开发和称为科 恩或科恩-Oncley方法的方法来制备[E.J.Cohn等人,J.Am.Chem. Soc.68,459-475,1946；J.L.Oncley等人,J.Am.Chem.Soc.71, 541-550,1949]。含有载脂蛋白的血浆组分也可通过这种方法的一个变 体，Kistler-Nitschmann方法来制备[H.Nitschmann等人,Helv.Chim. Acta37,866-873,1954；P.KistlerandH.Nitschmann,VoxSang7, 414-424,1962]。这两种方法都基于示差沉淀醇。

各种方法已在文献中被描述从乙醇沉淀级分回收载脂蛋白A-I：

例如，US5089602涉及通过再悬浮级分在pH范围为3至5或6至 9的含水缓冲溶液，从人血浆或血清级分制备载脂蛋白。通过加入短链 脂肪醇析出不良污染物。使用了含有高乙醇浓度的(68-96％乙醇)缓冲 液进行沉淀污染物。通过升高的温度，微碱性pH值，或者通过加入离 液剂或表面活性物质(其随后通过凝胶过滤除去)抑制脂蛋白的潜在聚 合。阴离子交换层析步骤被包括以结合污染物，而载脂蛋白通过。

Kim等人，ManufacturingandShelfStabilityofReconstituted High-densityLipoproteinforInfusionTherapy,Biotechnologyand BioprocessEngineering16,785-792(2011)公开了使用含有在6M的浓 度的脲的提取缓冲液。

上述两种方法的组合在WO98/07751被说明为用于从人血浆中回 收载脂蛋白A(ApoA-I)或载脂蛋白E(ApoE)。所述文献公开了一 种方法，其包括通过使用含有8M脲素的提取缓冲液中的至少一个预纯 化步骤，使用阴离子交换层析的进一步纯化步骤。在WO98/07751中， 由使用含有20％乙醇的提取缓冲液的实验导致ApoA-I的1％的回收 率。WO2009/025754教导从α-1抗胰蛋白酶分离ApoA-I的方法，包 括使用较低的乙醇浓度(8至14％)，以沉淀ApoA-I。

其他方法，如超高速离心机和高效液相色谱(HPLC)也可用于回 收ApoA-I。然而，ApoA-I的制备是非常耗时和仅少量的ApoA-I可 以通过这些方法来制备。这些方法因此不适合于ApoA-I的工业生产。

因此，仍然需要一种用于从含ApoA-I的蛋白质级分提取和回收 ApoA-I的方法，其是适合于大规模生产，并且其允许以高产率获得 ApoA-I。

发明内容

本文提供的是从含ApoA-I的蛋白质级分(A)获得ApoA-I的方法， 包括：a)悬浮含ApoA-I的蛋白质级分于缓冲溶液，其含有15至30％ 的直链的或支链C₁至C₄醇(w/w)以形成悬浮液，其中所述悬浮的含 ApoA-I的蛋白质级分(A)具有6.4至10.0的范围的pH，(b)从所述 悬浮液中除去杂质，同时保持ApoA-I蛋白溶解(增溶)，(C)从悬浮 液沉淀ApoA-I，以及(d)收集所述的ApoA-I沉淀物。

在一些实施方案中，缓冲溶液包括20％(w/w)的直链或支链C₁至 C₄醇。在一些实施方案中，悬浮的含ApoA-I的蛋白质级分(A)具有 从8.1到8.5的范围的pH。在一些实施方案中，悬浮的含ApoA-I的蛋 白质级分(A)具有7.0至7.6的范围的pH。在一些实施例中，缓冲溶 液包含5mM至35mM的NaHCO₃。在一些实施方案中，直链或支链C₁至C₄醇是乙醇。

在一些实施方案中，ApoA-I蛋白质级分与缓冲溶液的体积比在步 骤(a)中是从1：1到1：5。

在一些实施方案中，在步骤(a)形成的所述悬浮液具有小于5 mS/cm的电导率。

在一些实施方案中，在步骤(b)中，通过加入直链或支链的C₁至 C₄醇至45至65％(w/w)的醇浓度导致沉淀，除去杂质。在一些实施方 案中，在步骤(b)加入的直链或支链的C₁至C₄醇具有约-5℃至15℃的 温度。在一些实施方案中，在步骤(b)沉淀的杂质从所述悬浮液中通过 过滤，离心，倾析，超滤和/或沉降而除去。

在一些实施方案中，在步骤(c)中，悬浮液的pH调节为4.6至5.6 的范围内。在一些实施方案中，在步骤(c)中，该悬浮液具有-2～20℃ 的温度以用于ApoA-I的沉淀。

在任何实施例中，该方法可以进一步包括步骤(e)，其中，例如通 过加入醇例如在为约40％至约96％(w/w)乙醇范围内的浓度的乙醇， 使得所收集的ApoA-I的沉淀物脱脂(去脂)。在具体实施方案中通过 加入乙醇至浓度为约40％，或者约50％使得所收集的ApoA-I的沉淀物 脱脂。乙醇可以是任何药物级乙醇。在本发明的具体实施方案中乙醇是 95％的药物级乙醇(含有5％甲醇的3A)。

根据一些实施例，该方法以至少0.50克/升血浆的产率生产纯化Apo A-I。

在本发明的另一个方面，提供了纯化ApoA-I，其包括：(a)小于 0.3毫克(mg)的IgA每克的ApoA-I。

还提供了通过如本文所述任何方法获得的ApoA-I，包括这样的 ApoA-I和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物和/或生产这种组 合物的方法。

还提供了从通过如本文所述任何方法获得的ApoA-I制备的重构的 HDL，包括这种重构的HDL和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物 和/或生产重构的HDL和/或包含其的药物组合物的方法。

附图的简要说明

图.1：缓冲液体积，缓冲液浓度，乙醇浓度，温度，pH和混合时间 对ApoA-I产率的影响。图1示出了当使用含有较低浓度乙醇的缓冲液 (缓冲溶液)(B)时从血浆获得的ApoA-I的产率达到最大。

图.2：乙醇浓度，pH对ApoA-I产率的影响。图2表明，当使用含 有在15和30％的范围内的浓度的乙醇的缓冲液(缓冲溶液)(B)时 从血浆获得的ApoA-I的产率被最大化。

图.3：等值线图表示乙醇浓度和pH对ApoA-I产率的影响。图3 进一步示出了使用浓度为20～50％范围内的乙醇时pH对ApoA-I产率 的影响。当ApoA-I悬浮在含有15至30％的范围内浓度的乙醇的缓冲 液(缓冲溶液)(B)中，并且悬浮液的pH在6.4到10.0范围内的时 产率达到最大。

图.4：拟合线图，显示乙醇浓度对ApoA-I产率的影响。图4示出 了当使用含有在15和30％的范围内的浓度的乙醇的缓冲液(缓冲溶液) (B)时从血浆获得的ApoA-I的产率被最大化。

图.5：通过在实施例6中所述的方法纯化的ApoA-I沉淀物(步骤 d)中蛋白水解活性(A)和非活化部分凝血酶时间(NaPTT)凝固时 间(B)。图5示出了，在级分IV物质再增溶期间，最小化冷却时间降 低了在纯化ApoA-I制剂中的蛋白水解活性和凝血因子的激活。

详细说明

本文所述的是从含ApoA-I的蛋白质级分(A)获得ApoA-I的方 法，包括以下步骤：(a)悬浮含ApoA-I的蛋白质级分(A)在含有 15～30％的直链或支链的C₁至C₄醇(w/w)的缓冲液(缓冲溶液)(B) 中，其中，所述悬浮的含ApoA-I的蛋白质级分(A)具有6.4至10.0 的范围内的pH，和(b)从所述悬浮液中除去杂质，同时保持ApoA-I 蛋白质溶解(增溶)。在具体的实施方案中，步骤(b)之后是(c)从 所述悬浮液沉淀ApoA-I，和，任选地，(d)收集ApoA-I沉淀物。

在本文所描述的方法的上下文中，术语“悬浮包含ApoA-I的蛋白 质级分”是指溶解(增溶)所述含Apo-I的蛋白质级分，从而使至少主 要部分的蛋白质级分进入溶液中。

令人惊奇的是，已经发现，如果含ApoA-I的蛋白质级分(A)溶 解于一定体积的含有15～30％的直链或支链的C₁至C₄醇(w/w)的缓 冲液(缓冲溶液)(B)，其中悬浮的含有ApoA-I的蛋白质级分(A) 具有范围为6.4至10.0的pH，包括6.4至7.5或8.1至8.5，那么可以在 给定的缓冲液体积中比用先前已知的方法悬浮更多ApoA-I蛋白，即使 没有加入离液序列高的物质，如脲。因此，与以前已知的方法相比，从 起始级分(A)中获得的ApoA-I的量可显著增加。

这些发现是特别值得注意的，因为，根据现有技术，浓度为15～30％ 的范围内(w/w)的乙醇不足以溶解ApoA-I蛋白，从而导致非常低的 产率。

与这些期望相反，在一些实施方案中，根据本文描述的方法的pH 和乙醇浓度的独特的组合实现了具有至少为0.50克/升的血浆(g/L血 浆)的ApoA-I产率的纯化ApoA-I。在一些实施方案中，通过本文所 述(在步骤b)中的方法获得至少0.60克/升血浆的ApoA-I。相反，当 乙醇的量超过30％重量/重量，则ApoA-I回收率较低。例如，在45％ w/w的ApoA-I回收率为约0.12克/升血浆，这表明在此描述的方法能 够增加ApoA-I回收率至少300％。

本文描述的方法提供比在现有技术中建议的更简单和更经济的增溶 ApoA-I的方式。另外，由于使用较低浓度的的直链或支链的C₁至C₄醇减少爆炸危险，在用于沉淀步骤的制造单元(部门)构建方面提供了 较低成本的优点。

此外，在实施方案中，其中悬浮的含ApoA-I的蛋白质级分(A)的 pH范围是从6.4至9.0，该pH水平被认为防止蛋白质的脱酰胺化，从而 导致降低的所得的生物制药药物将是免疫原性的风险。在一些实施方案 中，悬浮的含ApoA-I的蛋白质级分(A)具有6.4至9.0的范围内的pH， 包括从7.2至8.8，或从8.0到8.6，或从8.1到8.5，或从8.2到8.4，或 从6.4至7.4的范围内的pH。

本文所述的方法是快速，稳健的，特异性和安全的，并在加工过程 中提供感兴趣的产品的改进的产率和纯度。因此，本文所描述的方法特 别适合于在ApoA-I的大规模纯化使用。适于大规模纯化在本公开的上 下文中是指从几十千克的起始材料诸如人血浆级分起始的纯化，例如从 50千克或更多，如500千克含ApoA-I蛋白的起始级分起始的纯化。

如本文所用，“血浆”是指液体血液成分，包括血浆衍生物，以及含 血浆的组合物。

与常规使用的方法相比，本方法从而便于产品产率和所涉及的经济 之间的改进和可接受的平衡。

本发明的方法现在将以特定实施例示出。但是应该从下面的说明理 解，本发明包括以下所示的不同的步骤，成分和参数的不同实施方案的 所有排列和组合。

包括ApoA-I的任何起始材料可以用于本文所描述的方法，如含有 大量的ApoA-I的任何起始材料，如含有大量ApoA-I的蛋白的任何未 纯化的混合物。

术语“ApoA-I”指的ApoA-I蛋白及其级分。通常情况下，载脂蛋白 (apolipoprotein)A-I是血浆来源的或重组载脂蛋白(apolipoprotein) A-I，如ApoA-I，前(pro-)Apo-A1或变体，如ApoA-I米兰(Milano) 或所谓的抗氧化形式，如4WF。在一些实施方案中，载脂蛋白A-I是血 浆来源的ApoA-I。还设想的是载脂蛋白A-I的生物活性片段。片段可 以是天然存在的，化学合成的或重组的。

根据具体的实施方案，起始材料是含ApoA-I的蛋白质级分(A)， 例如选自人血浆的级分如血浆级分IV-I或IV(有时也被称为沉淀物IV 或类似物)，例如，根据科恩(Cohn)分级分离法或Kistler和 Nitschmann方法或其他类似的方法由人血浆的冷乙醇分级分离获得的 级分。其他实例可包括含有ApoA-I的硫酸铵沉淀物。当使用血浆体级 分IV为起始材料，在此描述的方法提供了充分利用血浆资源的优点。 在具体的实施方案中，起始材料是级分IV或Cohn级分IV₁或Cohn级 分IV₄或类似的级分。在进一步具体的实施方案中，起始材料是从级分 IV沉淀物衍生而得。其他的含ApoA-I的蛋白的级分(A)可以包括那 些其中α-1-抗胰蛋白酶(AAT)被预先除去的级分，预先除去α-1-抗胰 蛋白酶是为了单独制造成AAT治疗产品，如Zemaira^TM。这样的含Apo A-I的蛋白质级分的实例在WO2009/025754中描述。可以通过以下从 ApoA-I用分离AAT：i)处理包括ApoA-I和AAT的起始人血浆级分， 以由含有AAT的级分分离含有ApoA-I的级分，包括：a)任选地处理 用来作为起始材料的起始人血浆级分，使得ApoA-I和AAT两者被溶解 (增溶)；b)通过加入乙醇至8-14％v/v的浓度和调节pH至约5至约 6，沉淀溶解(增溶)的ApoA-I，使得ApoA-I沉淀，并使得AAT保 留在溶液中；和c)从含有AAT的溶液分离沉淀的ApoA-I。此沉淀的 ApoA-I，在本发明的具体实施方案中，是含ApoA-I的蛋白质级分 (A)。包括AAT和ApoA-I的起始人血浆级分可以选自一种或多种级 分IV-I或IV(有时也被称为沉淀物IV或类似物)，根据科恩分级分离 法或Kistler和Nitschmann法或其他类似的方法由人血浆的冷乙醇分级 分离得到一种或多种级分IV-I或IV。在一些情况下，这些级分可被称 为科恩级分IV，来自Kistler-Nitschmann上清液A和A+1的沉淀物(例 如沉淀物A+Ⅳ)。其他实例可包括含有AAT和ApoA-I的硫酸铵沉淀 物。在一些实施方案中，含ApoA-I的蛋白质级分包括细碎的二氧化 硅，如Aerosil^TM。

含ApoA-I的蛋白质级分(A)悬浮在含有15～30％的直链的或支 链C₁至C₄醇(w/w)的缓冲液(缓冲溶液)(B)中和悬浮的含ApoA-I 的蛋白质级分(A)具有6.4到10.0范围内的pH。在一些实施例中在含 ApoA-I的蛋白质级分(A)已悬浮在缓冲液(缓冲溶液)(B)中后， 悬浮的含ApoA-I的蛋白质级分(A)的pH被调整为6.4～10.0的范围。

在一些实施方案中，用于增溶所述的ApoA-I蛋白质级分(A)的缓 冲溶液(B)包含16至28％，或17至26％，或18至24％或19％至22％ 的直链的或支链的C₁至C₄醇(w/w)。

在一些实施方案中，用于增溶所述的ApoA-I蛋白质级分(A)的缓 冲溶液(B)包括20％的直链或支链C₁至C₄醇(w/w)。与现有技术的 方法相比，这种低乙醇浓度不仅从经济观点来看是有利的，而且也允许 增溶增加的量的ApoA-I蛋白质级分(A)，增加来自给定量的起始材料 的纯化ApoA-I的总产率。

在一些实施方案中，缓冲溶液(B)具有范围为6.4至10.0的pH， 包括从6.4至9.0，或从7.2至8.8或8.0至8.6或6.4至7.4的范围的pH。 在更具体的实施方案中，缓冲溶液(B)的pH是在从8.1到8.5的范围 内，如8.3。这些pH范围被认为最小化ApoA-I蛋白质的脱氨基和变 性。

在其他更具体的实施方案中，缓冲溶液(B)的pH值是在7.0至7.4 的范围内，如7.3。该pH范围被认为是最小化ApoA-I蛋白质的脱氨基 和变性。

缓冲溶液(B)可采用任何合适的盐来制备。一种用于制备缓冲液 (缓冲溶液)(B)的合适的盐是NaHCO₃。NaHCO₃是价格低廉且大 量市售的，并且因此非常适合于工业规模的应用。在一些实施方案中， 缓冲溶液(B)包含5mM至35mMNaHCO₃，如15mM或25mM的 NaHCO₃。这些缓冲条件已被证明是在用于增溶ApoA-I蛋白质级分(A) 中特别有效。此外，NaHCO₃是特别有利的，由于其低毒性和易用性。 然而，也可以使用其他合适的缓冲剂。缓冲剂的选择应考虑到，特定药 剂(试剂)需要是生物相容的和具有在含水/醇溶液中良好的溶解度特性。

由于价格，毒性和工业实用性的原因，直链或支链C₁至C₄醇通常 是乙醇。乙醇具有容易处理和也适于工业应用的进一步的优点。然而， 除了乙醇，其他醇类，如甲醇，正丙醇或异丙醇，正丁醇，仲丁醇，异 丁醇或叔丁醇适合用于目前所描述的方法中。

当使用乙醇时，乙醇通常是任何药物级乙醇。在本发明的具体实施 方案中，乙醇是一种96％的药物级乙醇(如94％乙醇和2％的甲基乙基 酮(MEK))。在本发明的具体实施方案中乙醇是一种95％的药物级 乙醇(含有5％甲醇的3A)。

为了尽量减少凝血因子和蛋白酶的活化，含ApoA-I的蛋白质级分 (A)(例如级分IV)在缓冲液(缓冲溶液)(B)中的悬浮液的温度 在缓冲液(缓冲溶液)(B)接触含ApoA-I的蛋白质级分(A)的约 90分钟的范围内被冷却至1.0±0.5℃。在具体实施方案中，将悬浮液在 缓冲液B接触的含ApoA-I的蛋白质级分(A)(例如，级分IV)的约 60分钟内冷却至1.0±0.5℃。

在一些实施方案中，ApoA-I级分(A)悬浮在缓冲液(缓冲溶液) (B)中后，如果需要的话，悬浮液的pH被调节为在6.4至10.0范围 内，例如从7.0至7.4范围内，如7.3或诸如是在从8.1到8.5的范围内， 如8.3。

为了方便ApoA-I在缓冲液(缓冲溶液)(B)中的悬浮，缓冲液 (缓冲溶液)(B)当它接触所述含ApoA-I的蛋白质级分(A)时可 具有约10℃至26℃的温度，包括约10℃至16℃，例如约13℃。

在一些实施方案中，蛋白质级分(A)与缓冲液(缓冲溶液)(B) 的体积比是从1：1到1：5，例如1：2。使用ApoA-I级分(A)与缓 冲液(缓冲溶液)(B)的低的体积比是在工业规模生产中尤其有利于 降低材料和储存缓冲液的成本。

在一些实施方案中，悬浮液的电导率小于5mS/cm，如在从0.5至 1.0mS/cm的范围内。

如上所述，含有ApoA-I的蛋白质级分(A)在缓冲液(缓冲溶液) (B)的增溶后，杂质如存在于ApoA-I蛋白质级分(A)中的其它不 期望的蛋白质或其它成分从悬浮液中被去除，而载脂蛋白ApoA-I的蛋 白质保持在溶液中(步骤(b))。在一些实施方案中，通过添加直链 或支链的C₁至C₄醇至45至65％(w/w)，如50％(w/w)或60％(w/w) 的醇浓度而沉淀杂质。这种范围被认为是有效增溶许多蛋白质级分，除 了ApoA-I。因此，该纯化步骤提供了从其它不希望的级分分离ApoA-I 的高度特异性和有效的方法。

为了方便杂质的沉淀，加入到悬浮液的直链或支链的C₁至C₄醇可 具有约-5℃至30℃的温度，如约5℃。

在一些实施方案中，直链或支链C₁至C₄醇是乙醇。在具体的实施 方案中的乙醇浓度的范围是从55％至65％(w/w)。

pH保持在6.4～10范围内。在一些实施方案中pH的范围是从6.4 至9.0，包括7.2至8.8，或从8.0到8.6，或从8.1到8.5，或从8.2到8.4， 或从6.4至7.4。

在一些实施方案中，将沉淀的杂质从悬浮液中通过任何已知的方法 除去，所述方法如过滤，离心，倾析，超滤和/或沉降。在一些实施方案 中，杂质通过过滤除去。按照这些实施例中，过滤器可以被选择以专门 保留沉淀的杂质，但是不保留期望的产物，例如，不保留期望的ApoA-I 蛋白。在这样的方法中有用的过滤器包括聚丙烯滤板和CH9纤维素滤 板。

在一些实施方案中，已除去杂质后，从悬浮液中沉淀ApoA-I(步 骤(c))。此ApoA-I沉淀可通过调节悬浮液的pH至4.6至5.6范围， 如5.4的pH而进行。在此pH范围内，ApoA-I的沉淀被认为是高选择 性的，使得其它不期望的蛋白质可以保留在溶液中。

在一些实施方案中，悬浮液的温度被调整(如果需要的话)为从-2 至20℃的范围，以沉淀ApoA-I。

在一些实施方案中，收集ApoA-I沉淀物(步骤(d))。按照这 些实施例，沉淀ApoA-I后，有利于液体通过过滤器的助滤剂可以加入 到悬浮液。助滤剂是无机矿物粉末或有机纤维材料，其与过滤硬件结合 使用，以提高过滤性能。通常采用的助滤剂包括硅藻土，珍珠岩和纤维 素。合适的助滤剂是本领域已知的，并且包括Celite^TM574助滤剂。

在一些实施方案中，ApoA-I沉淀物通过任何合适的方法收集，合 适的方法诸如上述的针对杂质过滤指出的。在一些实施方案中，ApoA-I 沉淀物通过过滤收集。按照这些实施例，过滤器可以被选择，使得所期 望的ApoA-I蛋白被保留，而其他更小的成分通过过滤器孔。

在具体的实施方案中，该方法还包括使用洗涤溶液以除去来自沉淀 的ApoA-I的杂质。洗涤溶液可以是水或合适的洗涤缓冲液。如果使用 洗涤步骤，进行该洗涤使得ApoA-I蛋白留在过滤器上，而杂质被溶解 和洗掉。

根据进一步的具体实施方案中，该方法包含进一步的步骤(e)， 其中如通过加入醇例如在约40％至约96％乙醇(w/w)范围内的浓度的 乙醇，对所收集的ApoA-I沉淀物进行脱脂。在目前描述的方法的上下 文中的“脱脂”是指去除脂质，因此减少了ApoA-I产品的脂质含量。

脱脂ApoA-I沉淀物(纯化的ApoA-I)可被存储在或低于-20℃， 为期长达一年而不丧失蛋白质功能。

从本发明的方法衍生的ApoA-I可另外经受专用病毒减少步骤(病 毒灭活和/或病毒清除(病毒去除))，以确保病毒病原体的去除。常见 的病毒灭活技术包括物理方法如经典的巴氏灭菌过程(60℃加热10小 时)，短波长紫外光照射或γ射线照射和化学方法如溶剂洗涤剂或低pH 温育。病毒清除(病毒去除)技术包括尺寸排阻方法如病毒过滤，其也 常常被称为纳米过滤。这些病毒过滤方法已被证明是有效的方法，其用 于从蛋白质溶液中去除病毒。在一些实施例中本发明纯化的ApoA-I是 经受病毒减少步骤，例如热灭活和/或病毒过滤，如EP13179755.7中所 述。

本发明提供一种纯化的ApoA-I，其特征在于下列性能：

(a)每克ApoA-I的小于0.3毫克(mg)的IgA；

(b)每克ApoA-I的少于0.7毫克的IgG抗体；

(c)每克ApoA-I的少于0.05毫克的IgM抗体；

(d)每克ApoA-I的少于4.9毫克的结合珠蛋白；

(e)每克ApoA-I的少于2.7毫克的血液结合素；

(f)每克ApoA-I的少于6.4毫克的纤维蛋白原；

(g)每克ApoA-I的少于0.9毫克的铜蓝蛋白；

(h)每克ApoA-I的少于14.6毫克的白蛋白；

(i)每克ApoA-I的少于2.3毫克的α-2-巨球蛋白；

(j)每克ApoA-I的少于12毫克的α-1-抗胰蛋白酶；和

(K)每克ApoA-I的少于3.9毫克的转铁蛋白。

蛋白质的含量可通过比浊法测定。ApoA-I含量也可以用高效毛细 管电泳法测定。

在本发明的另一个方面，提供了一种纯化的ApoA-I，其包括：(a) 每克的ApoA-I的小于0.3毫克的IgA。在具体实施方案中的ApoA-I 制剂包含每克ApoA-I的少于0.2毫克的IgA；或每克ApoA-I的小于0.1 毫克的IgA；或每克ApoA-I的小于0.075毫克的IgA；或每克ApoA-I的 小于0.05毫克的IgA；或每克ApoA-I的小于0.02毫克的IgA。有利的 是具有低的IgA的纯度水平，因为它可能会影响药物制剂的安全性，所 述药物制剂包含具有较低水平的ApoA-I制剂，较低水平被期望最小化 IgA缺乏患者中抗IgA形成的风险。这种状况是最常见的原发性抗体缺 乏，其影响约1：133的人，以及因为该状况是相对温和的，它常常不 被受影响的人所意识到。

如前所述的纯化ApoA-I可以被配制成药物组合物，如被配制成重 构的HDL，其用于治疗用途。这种药物组合物可以包括药学上可接受 的载体或稀释剂。药学上可接受的载体或稀释剂的非限制性实例包括 水，乳化剂，粘合剂，填充剂，表面活性剂，缓冲剂，稳定剂，盐类， 醇类，和多元醇，洗涤剂，蛋白质和肽，脂质，树胶，糖和其它碳水化 合物，虽然对药学上可接受的载体或稀释剂没有限制。

重构的HDL可能，除了ApoA-I，包含一种或多种脂质，洗涤剂 和稳定剂，虽然不局限于此。脂质的非限制性实例包括磷脂，胆固醇， 胆固醇酯，脂肪酸和/或甘油三酸酯。优选，所述脂质是磷脂。非限制性 的磷脂的例子包括磷脂酰胆碱(PC)(卵磷脂)，磷脂酸，磷脂酰乙醇 胺(PE)(脑磷脂)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷 脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)或其天然或合成的衍生物。稳定剂可 以是碳水化合物，例如糖(例如蔗糖)或糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖 醇)，虽然不局限于此。如果存在的话，洗涤剂可以是任何离子(例如 阳离子，阴离子，两性离子)洗涤剂或非离子洗涤剂，包括胆汁酸及其 盐，如胆酸钠。

ApoA-I和/或重构的HDL制剂的治疗用途可以包括治疗或预防心 血管疾病(例如急性冠脉综合征(ACS，动脉粥样硬化和心肌梗塞)或 疾病，障碍或状况如糖尿病，中风或心肌梗塞，其使人易患ACS，高胆 固醇血症(例如升高的血清胆固醇或升高的LDL胆固醇)和低胆固醇 血症，其产生自降低的水平的高密度脂蛋白(HDL)，诸如是丹吉尔病 (tangierdisease)的症状的。

实施例

如上所述，含有大量的ApoA-I的蛋白的任何未纯化的混合物可以 用作起始材料以用于本文所述的纯化方法。

在以下的实施例中，ApoA-I用根据科恩分级分离方法或Kistler和 Nitschmann方法的冷的乙醇分级分离从人血浆萃取，得到血浆级分IV- 或IV作为起始起始材料。在步骤(a)中，级分IV悬浮于缓冲溶液(B)， 然后在步骤(b)在暴露于更高的乙醇浓度前调节pH以沉淀各种杂质。 通过深度过滤在助滤剂的存在下去除杂质，然后将pH移位至接近Apo A-I的等电点以沉淀ApoA-I，作为步骤(c)。添加助滤剂并将该ApoA-I 沉淀物通过过滤在步骤(d)收集。任选地，所述ApoA-I的沉淀物可以 被重新悬浮和加入乙醇(例如40-96％w/w的)，以除去残留的脂质， 作为步骤(e)。

利用毛细管电泳在不同的采样点对ApoA-I含量进行了测量。

纯度以百分比表示，用毛细管电泳测定，也针对SDS-PAGE凝胶进 行肉眼评价。

例1：级分IV沉淀物制备

人血浆冷却至约0℃，并调节至约7.2pH。冷的乙醇加入到约8％的 浓度(w/w)，并将温度降低到约-2℃。通过离心或过滤除去所形成的沉 淀物(级分I)。

将来自以上方法的滤液或上清液调整为约pH6.9，和冷乙醇加入到 约20％的浓度(w/w)。然后将温度降低到-5℃，并将该混合物再次进 行离心或过滤。所形成的沉淀物(级分II+III)放置一边用于其他目的。

将来自以上方法的滤液或上清液调整至pH约为5，而乙醇浓度调节 至约20％(w/w)。将温度调节至约-5℃。通过离心或过滤除去所形成 (级分IV)的沉淀物，并存储，直到需要在糊膏的形式。此级分IV糊 膏含有ApoA-I，以及污染蛋白和脂质。

例2：影响从沉淀物IV回收ApoA-I的因素

使用实验的设计(DOE)的方法的初始实验集中于沉淀物IV(例如， 含有级分IV)在碳酸氢钠缓冲液中的溶解，目的是增溶更多的ApoA-I。 表1总结了用于采用中心点运行的Plackett-Burman设计的六个方法参 数的条件。检查的参数包括缓冲液体积，乙醇浓度，温度，pH和混合 时间。针对沉淀物IV增溶步骤的初步筛选执行十三次运行。

沉淀物IV糊膏等分溶于在DOE设计中规定的缓冲液的体积。然后 将pH根据DOE设计来调节，之后在分配给该运行的温度将悬浮液混 合。对悬浮液采样，并且将样品以4500转离心十五分钟。将得到的上清 液进行分析。对测试的结果进行标准化，并表示为gApoA-I/L血浆。

表1：用于沉淀物IV的溶解的Plackett-Burman筛选设计矩阵。

表2是在初始的Plackett-Burman筛选DOE获得的结果的总结， 其中的ApoA-I产率被标准化和表示为gApoA-I/L血浆。

所述Minitab16DOE分析的结论是，只有乙醇浓度对产率有 p<0.05，其中重悬浮缓冲液中乙醇浓度越低，增溶的ApoA-I越多(图1)。

表2：用于沉淀物IV的溶解的Plackett-Burman筛选设计矩阵的结 果。

标准的运行顺序 产率(g/L PEQ) 1 0.71 2 0.36 3 1.04 4 0.69 5 0.51 6 0.41 7 0.48 8 0.53 9 0.72 10 0.49 11 0.86 12 0.85 13 0.80

实施例3：乙醇浓度和pH对从沉淀物IV回收ApoA-I的影响

该研究包括10次运行，其中乙醇浓度在20至50％之间变化，pH 在6.4和7.2之间。这项研究是被运行作为重复的2²完全因子DOE设 计，具有中心点(表3)。该方法涉及将等分沉淀物IV糊膏溶解于2份 15mM碳酸氢钠缓冲液，其具有根据DOE的乙醇浓度。然后根据DOE 设计调节pH，之后将悬浮液调节至0±1℃的温度，混合1小时。对悬浮 液取样，并且将样品以4500转离心十五分钟。将得到的上清液进行分 析。测试的结果进行标准化，并表示为gApoA-I/L血浆。

表3：用于沉淀物IV的溶解的2²完全因子优化DOE设计矩。

标准的运行顺序 乙醇浓度(％) pH 1 50 6.4 2 20 6.4 3 35 6.8 4 20 7.2 5 50 7.2 6 50 7.2 7 20 6.4 8 50 6.4 9 20 7.2 10 35 6.8

所述Minitab16DOE分析得出的结论是，对产率有p<0.05唯一的 因素是乙醇浓度(表4)。结果表明，在重悬缓冲液中乙醇浓度越低， 增溶的ApoA-I越多，当乙醇浓度为20至30％时观察到最大产率(图2)。 再悬浮溶液的pH表现出轻微影响，将pH从6.4增加至7.2导致更高的 ApoA-I回收率。然而这并没有被发现具有显著性(p＝0.113)。

表4：用于沉淀物IV的溶解的2²完全因子优化设计的结果。

标准运行顺序 产率(g/L PEQ) 1 0.62 2 0.84 3 0.82 4 0.87 5 0.69 6 0.74 7 0.83 8 0.72 9 0.86 10 0.82

图3进一步示出了使用为20～50％范围内的乙醇浓度时pH对Apo A-I产率的影响。当ApoA-I悬浮于如本文所述的缓冲液(缓冲溶液)(B) 中时，产率最大化，缓冲液(缓冲溶液)(B)包含在15至30％的范围 内的浓度的乙醇和6.4至7.2的范围内的pH。

例4：乙醇浓度对来自沉淀物IV的ApoA-I回收率I的影响。

进行线性实验，以确定在哪些乙醇浓度的ApoA-I的产率在增溶步 骤中是最大化的。0，15和30％的乙醇浓度被一式两份地进行测试，如 上所述。表5是线性乙醇浓度实验所得到的结果的总结，其中的ApoA-I 产率被标准化和表示为gApoA-I/L血浆和纯度以百分比表示。

表5：用于沉淀物IV的溶解的线性乙醇浓度实验的结果。

标准运行顺序 乙醇浓度(％) 产率(g/L PEQ) 1 0 0.47 2 15 0.91 3 30 0.84 4 30 0.83 5 15 0.80 6 0 0.48

如图.4中所示，当使用含有在15和30％的范围内的浓度的乙醇的 缓冲液(缓冲溶液)(B)时从血浆获得的ApoA-I的产率被最大化。

实施例5：乙醇浓度和pH对从沉淀物IV回收ApoA-I的影响

沉淀物IV溶解在两份悬浮缓冲液中，所述悬浮缓冲液采用15mM 的碳酸氢钠，0.5mMEDTA在根据表6的各种的乙醇浓度中制成，之后 用根据表6的0.5M的HCl或0.5M的NaOH调整pH。

pH值设定后，对悬浮液取样并将样品在4500转离心十五分钟。将 得到的上清液进行分析。对结果进行标准化，并表示为gapoA-I/L血 浆。

以前的研究表明，在沉淀物IV重悬浮步骤中，当在悬浮缓冲液中 使用15％-30％的乙醇浓度时，ApoA-I产率最大化。重悬浮的pH被发 现仅具有微小的影响，但是检查的范围窄，pH值6.4-pH7.2。以确定 是否更宽的pH范围影响ApoA-I产率，按照表6进行实验，和计算Apo A-I产率。

表6：重悬浮缓冲液和pH条件。

试验编号 悬浮缓冲液 pH 1470.E009.08 15％乙醇 5.0 1470.E009.09 15％乙醇 10.0 1470.E009.10 30％乙醇 5.0 1470.E009.11 30％乙醇 10.0 1470.E009.12 20％乙醇 7.4

这些实验的结果列于表7中。在pH5.0，ApoA-I产率是与乙醇浓 度是检测不到地无关的。在20％乙醇的溶解，在15％或30％乙醇的存 在下pH7.4和pH10.0提供ApoA-I回收率(步骤b)的相似水平(表7)。

表7：用于沉淀物Ⅳ的溶解的乙醇浓度和pH实验的结果。

N/A.-ApoA-I的检测不到的水平

例6：在回收的ApoA-I中蛋白酶活性和激活的凝血因子

ApoA-I的纯化涉及ApoA-I的沉淀和测定来自步骤(d)的ApoA-I 沉淀物中蛋白水解活性和活化的凝血因子存在。

等分的沉淀物IV糊膏被溶解在2份悬浮液缓冲液(缓冲溶液)(B) 中(15mM的NaHCO₃/20％乙醇缓冲液)。将该混悬液调整至0±1℃的 温度。冷却装置被程序化，使得悬浮液在10，65或120分钟内达到1℃ 的目标温度。然后在该温度(约0±1℃)将悬浮液混合大约一小时。混 合后，使用0.5M的NaOH或0.5M的HCl溶液调节该悬浮液的pH， 得到约7.3的pH。

预冷至-4℃的乙醇被加至60％的最终浓度，同时保持悬浮液的温度 在-1至2℃。乙醇加入后，将悬浮液混合约30分钟。

继温育后，过滤助剂加入到该悬浮液中。通过已被15mM的碳酸氢 钠/60％乙醇预先洗涤的深度过滤器进行过滤，从不溶性杂质分离可溶 性ApoA-I材料(ApoA-I滤液)。滤饼用15mM的碳酸氢钠/60％的 乙醇洗涤。

0.5M的HCl溶液的量被加入到ApoA-I滤液，得到5.4±0.1的pH 的悬浮液。该悬浮液的温度调节至约0℃，并保持所述pH/温度条件约 2小时。

接着，助滤剂加入到该悬浮液中，通过深度过滤收集ApoA-I沉淀 物。深度过滤器用60％的乙醇预先洗涤。执行用96％的乙醇的初始后 洗涤，随后是20％的乙醇后洗涤。

针对蛋白水解活性对纯化的ApoA-I的沉淀物进行分析和测量非活 化部分凝血酶时间(NaPTT)凝血时间。这些测试对在步骤(d)的Apo A-I沉淀物中残留蛋白酶的量提供指示。

为了准备来自步骤(d)的ApoA-I沉淀物以用于测试，通过添加 一份沉淀物到三份2％的SDS/100mMTrispH8.5缓冲液将其溶解。然 后将含有ApoA-I的悬浮液混合45分钟至1小时。将悬浮液随后离心， 将上清液用于测定蛋白水解活性和NaPTT)。

蛋白水解活性测定是比色法，其中含有ApoA-I的上清液以1:3与 缓冲溶液(pH8.0)混合。然后将该溶液(200μL)连同包含20μL的 pNA的底物加入微孔板孔。然后将板在37℃温育10分钟，之后在405nm 处初始读数。温育在相同条件下继续进行，在30，60和90分钟采取进 一步读数(405纳米)。在孵育结束时，通过测量0和90分钟之间所形 成的pNA量，对蛋白水解活性(nkat/L)进行了计算。

由根据欧洲药典专著2.6.22的普通的非活化部分凝血酶时间 (NaPTT)试验测定，ApoA-I沉淀物批次(来自步骤(d))的活化 的凝血因子的存在。

结果表明，在步骤(a)在级分IV的再增溶期间，通过缩短用于降 低温度至1℃的时间可以最小化ApoA-I沉淀物(在步骤(d))中蛋白 酶活性的水平和活化的凝血因子(图3)。

实施例7：ApoA-I的大规模回收率

通过将沉淀物IV糊膏(500-550千克)溶解在2份15mM碳酸氢 钠/20％乙醇缓冲液中，制造较大规模的批次(n＝17)。然后将悬浮液 调节到0±1℃的温度，并且混合大约一小时。混合后，用0.5M的NaOH 或0.5M的HCl将pH调节至7.3。

加入乙醇溶液至高达60％的终浓度，将悬浮液混合约15分钟。然 后将悬浮液通过已被预先用15mM的NaHCO₃/60％乙醇洗涤的压滤机 过滤。随后的滤饼也用15mM的NaHCO₃/60％乙醇洗涤。

对测试的结果进行标准化，并将其表示为gApoA-I每L血浆。根 据17个批次，平均回收率为0.6g/L(在步骤(b))。

例8：来自Kistler-Nitschmann级分IV的ApoA-I的纯化-在悬浮 期间pH的效果

通过改变在7.2-12.0的范围内的pH，评价pH在重新悬浮来自沉 淀物IV的ApoA-I中对纯化的ApoA-I的总产率影响。

获得纯化的ApoA-I的方法涉及将沉淀物IV溶解于两份20％的 EtOH沉淀物IV溶解缓冲液，其含15mM碳酸钠(22±2℃)。在将缓 冲液加入沉淀物Ⅳ后，将悬浮液温度在约15分钟内降低至2℃(2±1℃)。 混合约15分钟后，将悬浮液的pH调节到在7.2至12.0的范围内的目标 pH，之后添加96％的乙醇以达到60％的终浓度。

随后的悬浮液在C盐(Celite)574的存在下被过滤。滤液的pH然 后降低至约pH5.3，并且在约0℃被温育约2小时。然后加入助滤剂， 悬浮液混合约30分钟，之后被过滤，ApoA-I沉淀物被收集。然后用 96％的乙醇对ApoA-I沉淀物进行脱脂。

为了确定脱脂的ApoA-I沉淀物的ApoA-I含量和其它特性，沉淀 物在室温在3份pH8.5含有2％SDS的100mMTris缓冲液中溶解45 分钟。将样品在分析前进行离心。

研究了pH在沉淀物IV再悬浮步骤对脱脂的ApoA-I沉淀物中整 体的ApoA-I产率的影响，当使用较高的pH的提取条件时得到更高的 回收水平(表8)。采用高效毛细管电泳(惠普(HewlettPackard)3D CE，安捷伦科技)测定ApoA-I的数量。在变性条件下，即，在SDS 的存在下进行测定。随后可以在水性和含脂质样品(例如，重构的HDL) 中测定ApoA-I含量。简言之，将含有约2-3毫克/毫升ApoA-I的样品 (150μL)(如果需要用水稀释)采用16％的SDS(25μL)和苯丙氨酸 (25μL，2或4毫克/毫升)制备。然后将样品在沸水浴中温育3分钟， 然后在电泳缓冲液(50mM硼酸钠，0.2％SDS，pH9.1，300μL)中1:2.5 稀释并过滤(0.45μm)。然后将样品加载到熔融石英毛细管(56厘米 乘50微米内径(id)，安捷伦G1600-61232)。电泳反应在25kV进行。 所用的标准是一个国际ApoA-I标准(BCR-393)，并从20至950微 克/mL建立了标准曲线。定量是基于与内标(苯丙氨酸)比较的相对峰 面积。

表8：纯化ApoA-I(每升血浆克)的产率作为用于从级分IV提取 ApoA-I的pH的函数。

生产批次 pH 7.3 pH 8.1 pH 8.3 pH 8.4 pH 8.5 pH 8.7 产率 0.22 0.28 0.37 0.53 0.51 0.50 0.56

通过比浊法(BNProSpec，西门子)，采用从西门子获得的参照， 对照和抗血清，来确定在纯化ApoA-I制剂(每克ApoA-I的血浆蛋白 mg)中其他血浆蛋白的水平。针对IgA含量，按照制造商的说明使用 来自西门子的N胶乳的IgA试剂盒。

在纯化ApoA-I制剂中其他血浆蛋白的水平保持稳定，直到级分IV 提取步骤的pH达到pH8.5。在较高的pH提取条件，例如pH8.7，血 浆蛋白的水平增加(表9)。

表9：纯化的ApoA-I中杂质含量作为用于从级分IV提取ApoA-I 的pH值的函数。