聚古罗糖醛酸硫酸酯在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的应用

摘要

本发明提供了聚古罗糖醛酸硫酸酯在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的应用。本发明通过实验不仅证明了聚古罗糖醛酸硫酸酯对肝癌细胞系HepG2.2.15中HBV表面抗原HBsAg和HBV？e抗原HBeAg的表达具有很好的抑制作用，而且可以显著抑制HBV-S？mRNA在HepG2.2.15细胞系中的表达，增强细胞中IFN-β的产生和分泌，并对抗病毒免疫相关的NF-κB和MAPK信号通路具有激活作用。本发明提供的聚古罗糖醛酸硫酸酯是一种海洋硫酸多糖类化合物，具有资源丰富、成本低廉和安全性高等诸多优点，且抗HBV效果明显优于阳性对照药物拉米夫定，在制备抗乙型肝炎病毒药物中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于海洋药物领域，具体涉及聚古罗糖醛酸硫酸酯在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）感染是我国当前流行最广泛、危害性最严重的一种传染病，也是世界范围内最严重的公共卫生问题之一。乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科（Hepadnavividae）。据世界卫生组织统计，全球约有20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者。我国现有9300万HBV携带者和2000万慢性感染者，每年因HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌死亡病例约28万，占因病死亡人数中的3.7%。

目前对乙肝的控制是以接种疫苗预防为主，在临床上使用的抗HBV药物主要有干扰素类（普通干扰素、聚乙二醇干扰素等），核苷类（拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、克拉夫定等）和少量的中成药三大类。不同类型药物的作用机制不同，在临床的疗效和选择也不同。干扰素虽然疗程明确，停药后稳定性较好，但总体疗效不如核苷类药物，且存在皮下给药频繁、不良反应多和费用高等缺点；核苷类药物虽然近期疗效较好，但疗程不明确，停药后容易复发，且长期用药又会导致病毒的变异和耐药性等问题。因此，研究和开发安全有效的新型抗HBV药物仍是临床上的迫切需要。

近些年来，硫酸多糖特有的抗病毒作用引起了国内外学者的广泛关注。作为一种强聚阴离子化合物，硫酸多糖能够抑制病毒的吸附和膜融合，或者干扰病毒进入细胞后的转录和复制等环节，并可通过诱导免疫因子的产生发挥其抗病毒作用。如最近文献报道的硫酸肝素、可得然胶硫酸酯等都具有明显的抗HBV感染作用。国内已报道了一种多聚甘露糖醛酸硫酸盐的制备方法及其在防治乙型肝炎及其它免疫病中的应用（CN1132209A），以及聚甘露糖醛酸丙酯硫酸盐在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用（CN102743409B）。但是目前未发现有关于聚古罗糖醛酸硫酸酯（PGS）在抗乙型肝炎病毒方面的研究和应用报道。聚古罗糖醛酸硫酸酯是一种来源于海藻的硫酸多糖，具有与现有抗HBV药物完全不同的结构，安全性好、毒副作用小，有望开发成一种具有全新结构和作用机制的抗HBV药物，造福广大乙肝患者。

发明内容

针对目前临床上治疗乙型肝炎病毒的药物不良反应多、停药易复发、长期给药导致病毒变异和耐药性等缺点，本发明提供了聚古罗糖醛酸硫酸酯在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的应用，本发明提供的聚古罗糖醛酸硫酸酯可以有效地抑制HepG2.2.15细胞中乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和乙肝病毒e抗原（HBeAg）的表达，其体外抗HBV机制主要为激活NF-κB和MAPK细胞信号通路，增强先天性免疫反应，进而抑制HBV复制。

为了实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了聚古罗糖醛酸硫酸酯在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的应用。

所述的聚古罗糖醛酸硫酸酯是由1→4连接的α-L-古罗糖醛酸组成，糖残基中C2和C3位至少有一个SO₃Na，硫酸根含量为20%~40%；聚古罗糖醛酸硫酸酯的重均分子量为2kDa~20kDa；其分子通式表述为[C₁₂H₁₆-mO₁₂Na₂·(SO₃Na)m]n，式中m=1~4，n=5~30；其化学结构通式如下所示：

。

进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯能显著抑制乙肝病毒表面抗原和乙肝病毒e抗原在肝癌细胞中的表达。

进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯浓度为30-250μg/mL，作用肝癌细胞9天后，能显著抑制乙肝病毒表面抗原和乙肝病毒e抗原在肝癌细胞中的表达，并呈现剂量依赖性。

进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯能显著抑制HBV-SmRNA在肝癌细胞中的表达。

进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯浓度为30-250μg/mL，作用肝癌细胞6天后，能显著抑制HBV-SmRNA在肝癌细胞中的表达，并呈现剂量依赖性。

进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯能显著增强肝癌细胞中干扰素β的产生和分泌。

进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯浓度为50-400μg/mL，作用肝癌细胞6天后，能显著增强肝癌细胞中干扰素β的产生和分泌。

进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯能显著激活抗病毒免疫相关的NF-κB和MAPK信号通路，进而增强干扰素系统，抑制HBV的复制。

进一步的，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯浓度为50-200μg/mL，作用肝癌细胞6天后，能显著激活抗病毒免疫相关的NF-κB和MAPK信号通路，细胞Raf/MEK/ERK信号通路在PGS的抗HBV活性中发挥作用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明选取来源于海洋褐藻的硫酸多糖即聚古罗糖醛酸硫酸酯（PGS）为研究对象，在细胞水平上较为系统地揭示了其抗HBV的生物活性及其抗HBV机制。

本发明通过实验不仅证明了所述PGS对于肝癌细胞系HepG2.2.15中HBV表面抗原（HBsAg）和HBVe抗原（HBeAg）的表达具有很好的抑制作用，而且可以显著抑制HBV-SmRNA在HepG2.2.15细胞系中的表达，增强细胞中IFN-β的产生和分泌，并对NF-κB和MAPK细胞信号通路具有激活作用。本发明提供的聚古罗糖醛酸硫酸酯通过上调抗病毒免疫相关的NF-κB和MAPK细胞信号通路，增强先天性免疫，进而抑制HBV的复制；其对HBV抗原的抑制作用明显优于阳性对照药物拉米夫定，在制备抗HBV药物中具有广阔的应用前景。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明所述聚古罗糖醛酸硫酸酯的核磁共振碳谱（¹³C-NMR）图。

图2是本发明所述聚古罗糖醛酸硫酸酯的分子量分布图。

图3是本发明所述聚古罗糖醛酸硫酸酯的细胞毒性结果。

图4表明本发明中聚古罗糖醛酸硫酸酯对于HepG2.2.15细胞系中HBV抗原的抑制作用，图4A表明PGS对HbsAg表达量的抑制率，图4B表明PGS对HBeAg表达量的抑制率，图4A和图4B中，对照组为不加药组；拉米夫定为阳性药处理组，作用浓度为25μg/mL；PGS组为聚古罗糖醛酸硫酸酯处理组，作用浓度分别为30，60，125和250μg/mL。图中纵坐标表示不同组的抗原抑制率大小；*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组相比。

图5表明本发明中聚古罗糖醛酸硫酸酯对HBV-SmRNA的抑制作用。图5中，对照组为不加药组；拉米夫定为阳性药处理组，作用浓度为25μg/mL；PGS组为聚古罗糖醛酸硫酸酯处理组，作用浓度分别为30，60，120和250μg/mL。图中纵坐标表示不同组的HBV-SmRNA的相对表达水平，其中对照组设定为1；*P＜0.05，与对照组相比。

图6表明本发明中聚古罗糖醛酸硫酸酯对HepG2.2.15细胞系中干扰素β（IFNβ）的产生和分泌具有促进作用。图6A和6B中，对照组为不加药组；拉米夫定为阳性药处理组，作用浓度为25μg/mL；PGS组为聚古罗糖醛酸硫酸酯处理组，作用浓度依次为50，100，200和400μg/mL。图中纵坐标表示不同组的IFNβ的相对表达水平，*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组相比。

图7表明本发明中聚古罗糖醛酸硫酸酯对细胞信号通路蛋白磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)表达量的促进作用。图7A和7B中，对照组为不加药组；拉米夫定为阳性药处理组，作用浓度为25μg/mL；PGS组为聚古罗糖醛酸硫酸酯处理组，作用浓度依次为50，100和200μg/mL。**P＜0.01，与对照组相比；图7C中，加入NF-κB抑制剂（BAY11-7082）后对于PGS抗HBV作用的影响。*P＜0.05，**P＜0.01，与不加抑制剂的相应对照组相比。

图8表明本发明中聚古罗糖醛酸硫酸酯对细胞信号通路蛋白磷酸化的p38(p-p38)、磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)和磷酸化的MEK(p-MEK)表达量的促进作用。图8A和8B中，对照组为不加药组；拉米夫定为阳性药处理组，作用浓度为25μg/mL；PGS组为聚古罗糖醛酸硫酸酯处理组，作用浓度依次为50，100和200μg/mL。*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组相比；图8C和8D中，加入MEK抑制剂（U1026）和p38抑制剂（SB203580）后对于PGS抗HBV作用的影响。*P＜0.05，**P＜0.01，与不加抑制剂的相应对照组相比。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1、聚古罗糖醛酸硫酸酯的结构与理化性质分析

本发明采用的酸降解法从海藻多糖褐藻胶中制备并分离获得聚古罗糖醛酸，然后通过硫酸酯化反应后获得聚古罗糖醛酸硫酸酯（在专利ZL200310105718.9中记载有聚古罗糖醛酸硫酸酯PGS的制备方法）。

本发明所述聚古罗糖醛酸硫酸酯的分子骨架是由1→4连接的α-L-古罗糖醛酸组成，糖残基中C₂和C₃位至少有一个SO₃Na，硫酸根含量为20%~40%；聚古罗糖醛酸硫酸酯的重均分子量为2kDa~20kDa；其分子通式可表述为[C₁₂H_16-mO₁₂Na₂·(SO₃Na)_m]_n，式中m=1~4，n=5~30。

聚古罗糖醛酸硫酸酯的核磁共振碳谱图如图1所示，101.68ppm处为C₁信号，64.72ppm处为C₂信号，70.98ppm处为C_2S信号，70.53ppm处为C₃信号，75.40ppm处为C_3S信号，80.02ppm处为C₄信号，68.62ppm处为C₅信号，173.85ppm处为C₆信号。

采用高效凝胶色谱法，以TSKgelG3000PW_XL色谱柱（7.8mm×300mm，6μm）进行测定，以右旋糖酐分子量标准品（中国药品生物制品检定院）制作标准曲线，测得聚古罗糖醛酸硫酸酯的重均分子量Mw约为12.5kDa，分子量洗脱曲线如图2所示。

采用离子色谱法，以无水硫酸钾为对照品测定硫酸根含量。精密称取样品5mg，加入4mL1mol/L盐酸，于105℃密封反应6h，目的是让硫酸根游离。降解后，采用氮吹将HCl除去，然后加入一定量的电导18.2兆欧的超纯水（下简称超纯水），使样品最终浓度为0.1mg/mL。采用孔径为0.22μm的过滤膜过滤，备用。精密称取0.25mg硫酸钠，用适量超纯水溶解后，移至250mL容量瓶中，用超纯水定容为1.0mg/mL硫酸钠溶液。量取适量的母液，超纯水稀释成浓度为0.5、1、2、5、10、20μg/mL的系列硫酸钠对照品溶液。用SH-AC-1阴离子交换柱，柱温为35℃，柱压为5.5Mpa，流动相为4.5mmol/LNaHCO₃和3.6mmol/LNa₂CO₃的混合液，进样量为100μL，流速为1.5mL/min，采集时间为15min，测得硫酸根含量为33%。

实施例2、聚古罗糖醛酸硫酸酯PGS体外抗乙型肝炎病毒的作用

1）PGS在细胞水平抑制HBsAg和HBeAg表达作用的评价

利用HepG2.2.15细胞系（中国海洋大学医药学院提供）为细胞模型，采用ELISA试剂盒和噻唑蓝（MTT）比色法分别检测聚古罗糖醛酸硫酸酯PGS对于HBsAg和HBeAg表达量的抑制作用及细胞毒性大小，并计算半数有毒浓度CC₅₀值。阳性对照药物选择拉米夫定。

实验结果如图3和图4所示。如图3所示，PGS（30-250μg/mL）对HepG2.2.15细胞增殖无明显抑制活性，PGS作用细胞6天后，最大的无毒浓度为250μg/mL。经PGS作用6天和9天后，CC₅₀值分别为931μg/mL和891μg/mL。图4中，经不同浓度的PGS作用后，与阳性对照组相比，PGS组的HBsAg和HBeAg表达量显著降低，呈现剂量依赖性。经250μg/mL的PGS作用9天后，HBsAg和HBeAg表达量的抑制率分别达到51.8%（P＜0.01，图4A）和36.2%（P＜0.05，图4B），说明聚古罗糖醛酸硫酸酯PGS具有较好的抑制HBsAg和HBeAg表达的活性。

2）PGS对细胞内HBV-SmRNA表达的影响

利用HepG2.2.15细胞系（中国海洋大学医药学院提供）为细胞模型，采用Trizol试剂提取细胞的总RNA，RNA样本经M-MLV反转录酶（Promega，USA）反转成cDNA。细胞内HBV-SmRNA的含量经荧光定量PCR（FQ-PCR）进行定量。HBV-SmRNA和内参（β-Actin）的引物分别为：

HBV-SForward:5’-CTAGGACCCCTGCTCGTG-3’,

HBV-SReverse:5’-GATGAGGCATAGCAGCAG-3’;

β-ActinForward:5’-CACCAACTGGGACGACAT-3’,

β-ActinReverse:5’-ACAGCCTGGATAGCAACG-3’。

实验结果如图5所示，聚古罗糖醛酸硫酸酯PGS作用细胞6天后，HBV-SmRNA的表达量降低，并呈现剂量依赖性;当PGS作用浓度为250μg/mL时，可显著抑制HBV-SmRNA的表达，抑制率达到42%（P＜0.05，图5）。然而，阳性对照组拉米夫定对于HBV-SmRNA的产生几乎无显著性抑制作用。这说明PGS通过干扰HBVmRNA的转录过程发挥抗HBV活性，与拉米夫定抑制DNA复制不同。

实施例3、PGS体外抗乙型肝炎病毒的作用机制

1）PGS对干扰素β（IFNβ）表达和分泌的影响

PGS对HepG2.2.15细胞中细胞因子和抗病毒蛋白（如IFNβ）表达量的影响通过ELISA方法进行评价。HepG2.2.15细胞经不同浓度的PGS（50，100，200和400μg/mL）作用6天后，上清液每3天更换一次，第6天时收集上清和细胞。细胞培养上清和细胞裂解液中的IFN-β根据ELISA试剂盒的说明方法进行测定。

实验结果如图6所示，与对照组相比，经不同浓度的PGS（100，200和400μg/mL）处理后，细胞内的IFN-β表达量显著增高（P＜0.05，图6A）。同时，当作用浓度达到400μg/mL时，PGS显著提高细胞外的IFN-β水平（P＜0.05，图6B）。然而，阳性对照组拉米夫定对细胞中IFN-β的产生无显著增强作用（图6A和图6B）。这说明PGS通过增强干扰素系统抑制HBV的复制。

2）PGS对HepG2.2.15细胞中NF-κB细胞信号通路的影响

上述实验结果表明PGS可以通过上调干扰素系统发挥抗病毒活性，所以本发明通过WesternBlot进一步评价了PGS对干扰素产生相关的NF-κB通路的影响。不同浓度的PGS（50，100，200μg/mL）作用细胞6天后，通过RadioImmunoPrecipitationAssay（RIPA）裂解液制备细胞总蛋白，蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%分离胶和5%浓缩胶）分离后，转至硝化纤维素滤膜（Bio-Rad，USA）。于5%脱脂奶粉（1.5g脱脂奶粉溶解于30mLTBST（1×）中）37℃封闭2h。漂洗后的膜于4℃与NF-κB及磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)的一抗孵育过夜，洗涤后于室温下与二抗孵育2h，1×TBST洗涤3次。最后进行碱性磷酸酯酶染色，免疫条带即可显现。

实验结果如图7所示，不同浓度的PGS（50，100和200μg/mL）作用6天后，与无药物处理的对照组相比，p-NF-κB的表达量显著增高（P＜0.01），然而总NF-κB的表达量没有显著变化（图7A和图7B）。阳性对照拉米夫定（3TC）也可以一定程度地增高p-NF-κB的表达量（图7B）。这些结果说明PGS通过激活NF-κB信号通路，增强干扰素表达。

为了验证NF-κB信号通路在PGS体外抗HBV活性中发挥的作用，本发明首先使用NF-κB的抑制剂（BAY11-7082）干扰NF-κB信号通路的激活，然后评价PGS对HBV抗原产生的影响。如图7C所示，经BAY11-7082预处理后，PGS（50，100和200μg/mL）对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用显著降低。然而，NF-κB的抑制剂并不影响拉米夫定（3TC）对HBV抗原表达量的抑制作用（图7C）。因此，PGS可以通过上调NF-κB信号通路，抑制HBV的复制。

3）PGS对HepG2.2.15细胞中MAPK细胞信号通路的影响

本发明通过WesternBlot进一步评价了PGS对抗病毒免疫相关的MAPK信号通路的影响。不同浓度的PGS（50，100，200μg/mL）作用细胞6天后，通过RadioImmunoPrecipitationAssay（RIPA）裂解液制备细胞总蛋白，蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%分离胶和5%浓缩胶）分离后，转至硝化纤维素过滤膜（Bio-Rad，USA）。于5%脱脂奶粉（1.5g脱脂奶粉溶解于30mLTBST（1×）中）37℃封闭2h。漂洗后的膜于4℃分别与磷酸化的p38(p-p38)，磷酸化的MEK(p-MEK)和磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)的一抗孵育过夜，洗涤后于室温下与二抗孵育2h，1×TBST洗涤3次。最后进行碱性磷酸酯酶染色，免疫条带即可显现。

实验结果如图8所示，不同浓度的PGS（50，100和200μg/mL）作用6天后，与无药物处理的对照组相比，p-p38，p-MEK和p-ERK1/2的表达量显著增高（P＜0.05，图8A和B）。PGS对ERK1/2的激活作用最明显；与对照组相比，不同浓度的PGS（50，100和200μg/mL）使p-ERK1/2的表达水平分别增高了3.4，2.3和2.3倍（P＜0.01，图8B）。然而阳性对照拉米夫定对p-p38，p-MEK和p-ERK1/2均无显著的促进作用，这些结果说明MAPK信号通路与PGS的抗HBV活性相关。

为了进一步验证MAPK信号通路在PGS体外抗HBV活性中发挥的作用，本发明用p38的抑制剂（SB203580）和MEK的抑制剂（U1026）干扰MAPK信号通路的激活，然后评价PGS对HBV抗原产生的影响。如图8C所示，经U1026预处理后，PGS（100，200μg/mL）对HBsAg和HBeAg的抑制作用显著降低，这说明MEK信号通路与PGS的体外抗HBV活性相关。然而，p38的抑制剂（SB203580）并不能显著影响PGS对HBV抗原的抑制（P＞0.05，图8D）。这说明细胞Raf/MEK/ERK信号通路在PGS的抗HBV活性中发挥作用，而p38MAPK通路并不涉及其中。

综上所述，本实验结果表明聚古罗糖醛酸硫酸酯PGS在一定浓度下，没有细胞毒性；PGS在体外可以显著抑制乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg的表达，而且可以显著抑制HBV-SmRNA在HepG2.2.15细胞系中的表达，增强细胞中IFN-β的产生和分泌，并对抗病毒免疫相关的NF-κB和MAPK细胞信号通路具有激活作用。

本发明的聚古罗糖醛酸硫酸酯PGS来源于海藻，具有资源丰富、成本低廉和安全性高等诸多优点，不仅可以可以显著抑制乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg的表达，而且还可通过增强先天性免疫作用来抑制HBV的复制，明显优于阳性对照药物拉米夫定，在制备抗乙型肝炎病毒药物中具有广阔的应用前景。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案范围。