聚古罗糖醛酸硫酸酯及其寡糖的制备、结构与活性研究

摘要

尿路结石症是一种具有高复发率的常见疾病。尿大分子抑制物,特别是糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs),在抑制尿路结石的形成中发挥着重要的作用,GAGs及其类似物在临床上潜在的应用前景受到了人们广泛的关注。本论文选择以海洋褐藻中分离得到的聚古罗糖醛酸(Polyguluronate,PG)为分子骨架,经硫酸酯化修饰成功制备了一种具有高电荷密度和强聚阴离子性质的GAGs类似物――聚古罗糖醛酸硫酸酯(Polyguluronate sulfate,PGS),并采用多种现代仪器分析方法对PGS的化学结构进行了确证。经对PGS的抗尿路结石活性和安全性进行评价,PGS在尿路结石症的预防和治疗方面显示出了良好的应用前景。另外,本论文还采用多种方法制备了具有不同硫酸基取代度和不同聚合度的PGS寡糖,并对PGS寡糖与成纤维细胞生长因子(FGF)及其受体(FGFR)的结合活性进行了评价。本论文以褐藻酸为原料,经酸水解、pH分级和纯化制备得到了聚古罗糖醛酸,分别采用三氧化硫-三甲胺、三氧化硫-吡啶和氯磺酸-甲酰胺三种硫酸酯化方法制备得到了PGS。经对三种制备方法的特点进行比较,发现三氧化硫-吡啶法反应条件温和,操作简单、硫酸酯基的取代度高,适合于PGS的制备。经对PGS的结构分别采用UV、IR、GC、CD、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、1H-13C HMQC等现代仪器分析技术并结合化学方法进行分析,证实硫酸酯化反应是发生在了聚古罗糖醛酸的C2和C3位;经采用SYBYL分子模拟软件对PGS的分子构象进行模拟,结果表明PGS是一个具有较大柔性的长链分子,在水溶液中分子形成卷曲状态,并可自由摆动。对PGS分别在高温、高湿和强光照射实验条件下的质量稳定性进行考察,结果表明PGS具有较好的质量稳定性,但提示PGS的保存应尽量避免高温和高湿环境。本论文分别采用喂食乙二醇致大鼠肾结石和植入锌粒致大鼠膀胱结石两种动物模型,对PGS的抗尿路结石活性进行了评价。结果表明:PGS在50和100mg/Kg剂量下,可明显降低大鼠肾结石中肾草酸和肾钙的含量,对肾脏结石的沉积、肾脏病变具有明显的改善作用,对乙二醇致大鼠肾结石和植入性膀胱结石的形成均具有明显的预防和治疗作用。另外,采用棉球肉牙肿模型大鼠对PGS进行评价,结果表明PGS还具有明显的抗炎作用。急性毒性研究结果表明:PGS具有良好的安全性,对小鼠口服给药的最大耐受量为25g/kg;对小鼠静脉注射PGS的LD50为6.29g/kg。本论文分别采用自由基降解法、固相酸解法和PG寡糖修饰法制备了具有不同硫酸酯基取代度的PGS寡糖。固相酸解法是首次将732＃酸性树脂应用于硫酸多糖的降解,研究表明该方法不仅可对PGS进行有效降解,而且在降解过程中不产生无机盐杂质,避免了寡糖与无机盐二次的分离,但在降解过程中有较明显的硫酸酯基脱落,适合制备具有较低硫酸酯基取代度的PGS寡糖。自由基降解法和PG寡糖修饰法适合制备具有高硫酸酯基取代度的PGS寡糖,但这种高硫酸酯基取代度PGS寡糖的分离较为困难。采用Bio-Gel P6凝胶层析柱,可对固相酸解法制备的寡糖进行良好的分离,并得到了13个寡糖组分F1-F13。经采用ESI-MS分析,证实F1-F13分别为聚合度1-13的PGS寡糖。PGS寡糖与FGF-FGFR1c的结合活性研究结果表明:不同聚合度的PGS寡糖对FGF-FGFR1c具有不同的结合能力,其中与FGF1-FGFR1c和FGF19-FGFR1c结合的最小结构片段分别为PGS4糖和PGS12糖;与FGF7-FGFR1c的结合能力随PGS寡糖聚合度的增加而增加。另外,为改善PGS的口服吸收和提高生物利用度,本论文还对PGS脂质体的制备方法进行了研究,采用反相蒸发法制备的PGS包封率可达39.13％。同时,本论文还建立了一种适合于PGS脂质体包封率测定的HPGPC方法。本论文各项研究结果,对下一步PGS的临床应用研究具有较重要的指导意义和参考价值。不同聚合度PGS寡糖的制备及结构分析,不仅为PGS的构效关系研究提供了良好的基础,而且还为进一步探讨硫酸寡糖与和FGF-FGFR相关疾病如肿瘤等的相互关系研究提供了基础。

目录

摘要

Abstract

第一章 前言

1 尿路结石症与结石的组成和形成机理

1.1 尿路结石症的发病特点

1.2 尿路结石症的致病因素

1.3 尿路结石症的预防与治疗

1.4 尿路结石的组成和结构

1.5 尿路结石形成的物理化学机理

2 酸性粘多糖与尿路结石症

2.1 尿液中的大分子抑制物

2.2 酸性粘多糖的结构与理化性质

2.3 酸性粘多糖的代谢

2.4 酸性粘多糖抑制结石形成的机制

2.5 外源性酸性多糖在抗尿路结石中的应用前景

3 褐藻胶的结构与活性

3.1 褐藻胶的来源

3.2 褐藻胶的结构

3.3 褐藻胶及其衍生物的活性与应用

4 硫酸寡糖的制备与活性

4.1 硫酸多糖在临床应用中存在的问题

4.2 多糖的降解方法

4.3 硫酸寡糖的活性

5 本论文的选题依据及研究意义

5.1 选题依据

5.2 研究方案

5.3 研究意义

第二章 聚古罗糖醛酸硫酸酯的制备

引言

1 材料与仪器

2 实验方法

2.1 PGS的制备工艺流程

2.2 中间体聚古罗糖醛酸的制备

2.3 PGS的制备

2.4 PGS的稳定性

2.5 分析方法

3 结果与讨论

3.1 中间体聚古罗糖醛酸的制备

3.2 PGS的制备

3.3 PGS的稳定性

4 小结

第三章 聚古罗糖醛酸硫酸酯的结构研究

引言

1 材料与仪器

2 实验方法

2.1 样品精制方法

2.2 醋酸纤维素薄膜电泳法检查纯度

2.3 高效液相色谱法检查纯度

2.4 元素分析方法

2.5 气相色谱（GC）分析

2.6 紫外光谱（UV）分析

2.7 红外光谱（IR）分析

2.8 圆二色谱（CD）分析

2.9 核磁共振（NMR）分析

2.10 分子构象模拟

3 结果与讨论

3.1 PG的结构研究

3.2 PGS的结构研究

3.3 PGS的分子构象模拟

4 小结

第四章 聚古罗糖醛酸硫酸酯寡糖的制备及结构分析

引言

1 材料与仪器

2 实验方法

2.1 PGS寡糖的制备

2.2 PGS寡糖的分析方法

2.3 PGS寡糖的分离

2.4 PGS寡糖的电喷雾质谱分析

3 结果与讨论

3.1 PGS寡糖的制备

3.2 PGS寡糖的分离

3.3 PGS寡糖的ESI-MS分析

4 小结

第五章 聚古罗糖醛酸硫酸酯及其寡糖的活性研究

引言

1 实验材料

2 实验方法

2.1 PGS对尿路结石的预防作用

2.2 PGS对尿路结石的治疗作用

2.3 PGS的抗炎作用

2.4 PGS对小鼠的急性毒性

2.5 PGS寡糖与FGF-FGFR1c的结合活性

3 结果与讨论

3.1 PGS对尿路结石的预防作用

3.2 PGS对尿路结石的治疗作用

3.3 PGS的抗炎作用

3.4 PGS的急性毒性

3.5 PGS寡糖与FGF的结合活性

4 小结

第六章 聚古罗糖醛酸硫酸酯脂质体的制备

引言

1 材料与仪器

2 实验方法

2.1 空白脂质体的制备

2.2 PGS脂质体的制备

2.2 脂质体的分离

2.3 脂质体包封率的测定

2.4 形态观察

3 结果与讨论

3.1 PGS脂质体的制备

3.2 PGS脂质体的分离

3.3 PGS脂质体的包封率测定

4 小结

结语

1 主要结论

2 创新点

3 下一步研究计划

参考文献

致谢

博士期间发表的论文和申请的专利

1 论文

2 专利