一种虎舌红三萜皂苷对照品的制备方法

摘要

本发明公开了一种虎舌红三萜皂苷对照品的制备方法，包括如下步骤：(1)虎舌红药材的提取；(2)大孔吸附树脂柱分离；(3)硅胶柱层析；(4)制备型高效液相色谱分离纯化，最终得到西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。采用薄层色谱多个展开系统及显色方法检查该对照品，均为一个色谱斑点，进一步采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)检查，其目标峰用峰面积归一化法计算，质量浓度大于98％；变换不同色谱柱及多个流动相系统，测定结果均一致。说明制备的虎舌红素B符合中药定量分析用化学对照品的要求。本制备方法提取溶剂安全无毒，成品收率较高。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种中药有效成分化学对照品的制备，具体涉及一种虎舌红三萜皂苷对照品的制备方法。

背景技术

虎舌红为紫金牛科紫金牛属植物虎舌红ArdisiamamillataHance的干燥全草，既是著名的观赏植物，又是我国民间常用草药，具有清热利湿、平肝解郁、活血化淤的功效，其药用价值早在《本草纲目》中就有记载，对治疗肝炎、风湿、小儿疳积等有奇效。其主要有效成分是其中的一种三萜皂苷——西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(简称虎舌红素B)，这是存在于紫金牛科紫金牛属植物虎舌红(ArdisiamamillataHance)、朱砂根(ArdisiabrevicaulisDiels)、百两金(Ardisiacrispa(Thunb.)A.DC.)等多种植物中的有效成分，现代药理研究表明该活性成分具有细胞毒活性和抗肿瘤、抗炎等药理作用。在深入研究开发该活性成分的过程中，需要进行制剂工艺、内在质量、稳定性等一系列药学研究工作，都需要相应对照品进行支撑。但目前未见虎舌红素B对照品的制备方法，为深入探讨本品的成药性及药理活性，我们从虎舌红中提取分离得到这种虎舌红三萜皂苷单体，并按照对照品研究技术指导原则进行了纯化及结构鉴定。为深入研究上述含虎舌红素B活性成分药材及制剂的内在质量提供对照物质，也为进一步的新药开发提供参考。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷对照品的制备方法。

本案发明人通过对虎舌红化学成分进行文献查阅和实验研究，发明了虎舌红药材回流提取、大孔吸附树脂和硅胶柱层析分离纯化，高效液相色谱制备西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷对照品的方法，经薄层色谱多个展开及显色系统分离均显示一个斑点，采用HPLC-ELSD峰面积归一化法计算，其质量浓度大于98％，符合中药定量分析用化学对照品纯度的质量要求，因而完成了本发明。

本发明提供了一种西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷对照品的制备方法，主要包括以下步骤：

1)取虎舌红药材，粉碎过10目筛，加50％～90％的乙醇回流提取，滤过，提取液减压回收醇得提取液；

2)将提取液上大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩干燥得浸膏；

3)将2)的浸膏与等量硅胶拌样，干燥、研细后均匀倒入装好的硅胶柱上端，缓缓加入流动相，以适宜的流速进行洗脱，收集富含虎舌红素B的流份，浓缩，甲醇重结晶，即得虎舌红素B提取物。

4)将3)得到的虎舌红素B提取物用制备高效液相色谱分离纯化。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水或乙腈-水为流动相，检测波长205nm，收集目标峰并浓缩干燥得西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

根据前述的制备方法，其中，所述的回流提取溶剂浓度为60％乙醇。

根据前述的制备方法，其中，所述的大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂，经过D101、D141、D140三种型号的比较，优选为D141。

根据前述的制备方法，其中，所述的硅胶柱洗脱剂为乙酸乙酯∶甲醇(6∶4～8∶2)和氯仿∶甲醇∶水(10∶5∶0.5)，考虑安全性，优选为前者。

根据前述的制备方法，其中，所述的HPLC的流动相中甲醇与水的体积比为62∶38～72∶28；乙腈与水的体积比为30∶70～40∶60，优选甲醇-水的体积比为60∶40，乙腈-水的体积比为35∶65，考虑安全性，优选甲醇-水系统为HPLC制备用流动相。

本发明制备的虎舌红素B经高分辨质谱(HR-FAB-MS)给出精确分子量为1074，其碳、氢核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属，结构鉴定为西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

本发明制备的虎舌红素B经高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果均为一个色谱峰，以HPLC-ELSD峰面积归一化法测定，其质量分数均大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求。

而且本发明药材提取完全，所需有机溶剂少，溶剂无毒无污染。

附图说明

图1为西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷的HPLC-UV制备色谱图

图2为西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷的HPLC-ELSD纯度检测色谱图

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明，依据现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。

仪器、试药与样品

高效液相色谱仪(美国安捷伦1100系列)，包括在线真空脱气机(G1322A)，四元梯度泵(G1311A)，自动进样器(G1313A)，柱温箱(G1316A)，DAD检测器(G1314A)，Chemstation色谱工作站；AlltechELSD2000型蒸发光散射检测器；制备型高效液相色谱仪(美国贝克曼库尔特BECHMAN125P型)，包含SYSTEMGOLD125PSolventModule和166pDetector等；Milli-Q超纯水器(美国Milipore公司)；Microfuge18台式离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；KQ-500DE超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司，功率300W，频率40kHz)；BP-210D型电子分析天平(德国赛多利斯，十万分之一)；过滤装置(Autoscience)及微孔滤膜(0.45μm)。分析色谱柱：WatersSymmetryC₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；PhenomenexGeminiC₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；AlltechAltimmaC₁₈(250mm×4.5mm，5μm)；制备色谱柱：BECHMANULTRAPREPC18(21.1mm×150mm，10μm)；保护拄：phenomnexC₁₈。

实施例1

1.对照品的制备

1)取虎舌红药材，粉碎过10目筛，加10倍量的80％的乙醇回流提取2小时，重复提取3次，滤过，合并滤液并减压回收乙醇得虎舌红提取物；

2)将提取液上D141大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩干燥得虎舌红浸膏；

3)将2)的浸膏与等量硅胶拌样，干燥、研细后均匀倒入装好的硅胶柱上端，缓缓加入流动相乙酸乙酯∶甲醇(7∶3)，以适宜的流速进行洗脱，收集富含虎舌红素B的流份，浓缩，甲醇重结晶，即得虎舌红素B粗品。

4)将3)得到的虎舌红素B粗品用制备高效液相色谱分离纯化。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水(70∶30)为流动相，检测波长205nm，收集目标峰并浓缩干燥得西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(产率1.64％)。

2.对照品的结构鉴定

上述虎舌红素B为白色粉末，熔点：263-265℃。[α]²⁵_D＝-23.5(MeOH，0.24)。

虎舌红素B的高分辨质谱(HR-FAB-MS)给出精确分子量：m/z1097.5432[M+Na]，对应分子式为：C₅₃H₈₆O₂₂Na(分子量计算值为：1097.5509)。

虎舌红素B的¹³C-NMR谱给出53个碳信号，其中30个信号为苷元碳信号，23个信号为糖残基碳信号。30个苷元信号中有6个为角甲基碳信号(DEPT谱信号)：δ16.1(C，25-C)，16.2(C，24-C)，18.0(C，26-C)，19.3(C，27-C)，24.0(C，29-C)和27.7(C，23-C)；1个醛基碳信号：δ207.9(C，30-C)；1个环醚亚甲基碳信号：δ75.8(CH₂，28-C)。¹H-NMR谱也显示了6个角甲基氢信号：δ0.72(3H，s)，0.80(3H，s)，1.06(3H，s)，1.17(3H，s)，0.91(3H，s)和0.94(3H，s)；1个醛基氢信号：δ9.75(1H，s)。上述¹H，¹³C-NMR谱数据为该化合物苷元的特征信号；将虎舌红素B的¹H-，¹³C-NMR谱数据与文献对照，并结合虎舌红素B的个gCOSY，HMQC，HMBC，NOESY等二维核磁共振谱分析，最终确定其苷元为西克拉敏A(cyclamineA)；

虎舌红素B的¹H-，¹³C-NMR谱还显示了4个糖残基的端基碳、氢信号：δ100.1(鼠李糖，C-1)，101.9(葡萄糖-1，C-1)，103.0(阿拉伯糖，C-1)，103.6(葡萄糖-2，C-1)和δ5.09(1H，br.s，鼠李糖，H-1)，4.44(1H，d，J＝8.4Hz，葡萄糖-1，H-1)，4.46(1H，d，J＝7.6Hz，阿拉伯糖，H-1)，4.38(1H，J＝7.6Hz，葡萄糖-2，H-1)说明该化合物中含有4个糖残基。虎舌红素B酸水解后，与D-葡萄糖，L-阿拉伯糖及L-鼠李糖共薄层层析分析，在D-葡萄糖，L-阿拉伯糖和L-鼠李糖相应的位置显示了相应的斑点，说明该化合物中的糖残基种类为D-葡萄糖，L-阿拉伯糖和L-鼠李糖。结合糖残基的¹H-，¹³C-NMR谱数据，确定该化合物中D-葡萄糖，L-阿拉伯糖和L-鼠李糖的数量比为2∶1∶1。糖残基连接位置的确定是根据虎舌红素B的HMBC谱所显示的相关关系：δ4.46(1H，d，J＝7.6Hz，阿拉伯糖，H-1)与δ87.9(苷元C-3)；4.44(1H，d，J＝8.4Hz，葡萄糖-1，H-1)与δ79.0(阿拉伯糖，C-2)；δ4.38(1H，J＝7.6Hz，葡萄糖-2，H-1)与δ74.0(阿拉伯糖，C-4)；δ5.09(1H，br.s，鼠李糖，H-1)与δ74.9(葡萄糖-2，C-2)。

虎舌红素B的碳、氢核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属。虎舌红素B的¹H，¹³C-NMR谱数据见附表所示。该化合物为西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷；英文名：cyclamiretinA3-O-α-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-]-α-L-arabinopyranoside。其对照品结构鉴定的数据见附页，其结构示意如下：

虎舌红素B结构示意

3.高效液相色谱-蒸发光散射检测器纯度检测

制备的虎舌红素B经薄层色谱多个展开及显色系统均显示一个斑点，故用HPLC-ELSD进行纯度检查如下：

溶液制备：精密称取虎舌红素B适量，加50％乙醇制成0.5～5mg·mL^-1的溶液。

色谱条件A：色谱柱：AlltechAltimmaC₁₈(250mm×4.5mm，5μm)；流动相：甲醇-水(65∶35)；柱温：30，；流速：0.8ml·min^-1；漂移管温度为95℃；气体流速为2.0L·min^-1。

色谱条件B：色谱柱：PhenomenexGeminiC₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；流动相：乙腈-水(35∶65)；柱温：30，；流速：0.8ml·min^-1；漂移管温度为95℃；气体流速为2.0L·min^-1。

色谱条件C：色谱柱：WatersSymmetryC₁₈(150mm×4.5mm，5μm)；流动相：甲醇-水(65∶35)；柱温：30，；流速：0.8ml·min^-1；漂移管温度为95℃；气体流速为2.0L·min^-1。

方法与结果：精密吸取10～20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷为一个色谱峰，改变色谱柱和流动相测定，均未出现异常峰。

另取高浓度虎舌红素B：精密注入液相色谱仪10μL，记录时间比主峰保留时间延长1倍以上。测定各杂质峰面积和色谱图总色谱峰，计算各杂质峰面积之和占总色谱峰面积的百分数。结果虎舌红素B的质量分数为99.87％(见图1)。

实施例2

1虎舌红素B提取工艺对提取率的影响

1)提取方式对提取率的影响

取10目虎舌红药粉3份，每份50.00g。分别加入10倍量的80％乙醇，浸泡30min后一份室温超声提取30min；一份回流提取30min；另一份再加入10倍量的80％乙醇渗漉提取。提取液分别200目筛过滤，滤液减压浓缩。水浴蒸干浓缩液。干膏置于70℃烘箱减压干燥8小时，测定虎舌红素B含量，结果见表1。

表1提取方式比较

2)提取溶剂对虎舌红素B提取率的影响

取10目虎舌红药粉5份，每份50.00g，分别加入10倍量的水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇，浸泡30分钟后回流提取2h。提取液分别200目筛过滤，滤液减压浓缩。水浴蒸干浓缩液。干膏置于70℃减压烘箱干燥8小时。测定虎舌红素B含量，结果随着溶剂中乙醇浓度的增加，提取率逐渐增加至最大值，但是高浓度的乙醇反而降低提取率(见表2)。

表2提取溶剂浓度比较

3)溶剂量对虎舌红素B提取率的影响

取10目虎舌红药粉3份，每份50.00g。分别加入10倍量、8倍量、6倍量的60％乙醇，浸泡30分钟后回流提取2小时。提取液分别200目筛过滤，滤液减压浓缩至50ml，离心(3000r/min)处理20分钟，上清液水浴蒸干，置于70℃烘箱减压干燥8小时，分别测定虎舌红素B含量，结果10倍量最佳(见表3)。

表3提取溶剂用量比较

4)提取时间对虎舌红素B提取率的影响

取10目虎舌红药粉3份，每份50.00g。各加入10倍量的60％乙醇，浸泡30分钟后分别回流提取1、1.5、2小时。提取液200目筛过滤后分别滤液减压浓缩至50ml，离心(3000r/min)处理20分钟，上清液水浴蒸干，置于70℃烘箱减压干燥8小时，分别测定虎舌红素B含量，结果随着提取时间延长，提取率增加(见表4)。

表4提取时间比较

2虎舌红素B对照品的制备

1)取虎舌红药材，粉碎过10目筛，加10倍量的60％的乙醇回流提取2小时，重复提取3次，滤过，合并滤液并减压回收乙醇得虎舌红提取物；

2)将提取液上D101大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓缩干燥得虎舌红浸膏；

3)将2)的浸膏与等量硅胶拌样，干燥、研细后均匀倒入装好的硅胶柱上端，缓缓加入流动相乙酸乙酯∶甲醇(7∶3)，以适宜的流速进行洗脱，收集富含虎舌红素B的流份，浓缩，甲醇重结晶，即得虎舌红素B粗品。

4)将3)得到的虎舌红素B粗品用制备高效液相色谱分离纯化(见图2)。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水(60∶40)为流动相，检测波长205nm，收集目标峰并浓缩干燥得西克拉敏A3-O-α-鼠李吡喃糖-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-]-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(产率1.71％)。

经HPLC-ELSD纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定，均未出现异常峰；用峰面积归一化法测定质量分数为99.21％。

附表

化合物虎舌红素B¹H-NMR数据

附表

化合物虎舌红素B¹³C-NMR数据