液泡分选蛋白4A在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用

摘要

液泡分选蛋白4A在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用。本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。本发明以人结肠癌细胞(Caco-2)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人结肠癌细胞(Caco-2)的宿主因子，达到从源头(肠道)有效切断EV71感染的目的。本发明通过实验发现液泡分选蛋白4A(vacuolar？protein？sorting？4homolog？A，VPS4A)在EV71感染Caco-2中发挥着重要的作用，下调VPS4A的表达，能明显抑制EV71的感染。本发明提供了VPS4A在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及 应用。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属 人肠道A类病毒，是导致手足口病(Hand-foot-mouthdisease,HFMD)的主要病 原体之一。目前，手足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。 在我国，自2008年几大省市暴发手足口病疫情以来，该病的感染人数和死亡 率一直居高不下，每年报告发病数超过100万例，死亡数近1000例。手足口 病主要发病人群为5岁以下婴幼儿，临床表现为发热，手、足、臀部以及口 腔粘膜等部位出现疱疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神经 系统(centralnervoussystem，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑 脊髓炎以及神经源性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[SolomonT, LewthwaiteP,PereraD,CardosaMJ,McMinnP,OoiMH.Virology,epidemiology, pathogenesis,andcontrolofenterovirus71.LancetInfectDis.2010 Nov；10(11):778-90.]。手足口病特别是重症病例多由肠道病毒71型(EV71) 感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特异高效的抗病毒 药物，临床上仍以对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。

EV71的传播以粪-口途径最广，在此传播途径中，肠道是人体抵御病原 体的第一道屏障。动物实验研究证实，EV71经口腔接种小鼠后，最先在小肠 组织表现出病原体阳性[ChenYC,YuCK,WangYF,etal.Amurineoral enterovirus71infectionmodelwithcentralnervoussysteminvolvement.Journal ofGeneralVirology,2004,85(1):69-77]。因此，EV71首先通过对肠道系统进 行感染，在小肠道细胞内大量快速复制，随后入血导致病毒血症并引发其它 器官的感染。然而，在EV71到达人体肠道系统后，病毒如何侵入肠道细胞的 机制尚不清楚。小肠作为人体消化系统重要器官，主要负责营养物质的消化 与吸收，其腔面最外层为小肠粘膜上皮细胞，对于抵御病原体的起着至关重 要的作用。作为人结肠癌细胞系，Caco-2在形态学和生理学功能方面与人小 肠粘膜上皮细胞相似，培养成熟的Caco-2为致密的单层细胞，具有与正常的 小肠粘膜上皮细胞相同的极性和紧密连接、微绒毛结构；且作为肿瘤细胞， 比小肠粘膜上皮细胞更易培养。因此，探明EV71感染Caco-2的机制并以此 寻找新的抗病毒靶点，对于防治EV71对人体的感染至关重要。

为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系 统完成对宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代 病毒颗粒。因此，作为病毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病 毒药物筛选的重要靶标。研究表明，EV71可利用不同的宿主因子和感染途径 来入侵不同种类的靶细胞，比如EV71借助网格蛋白依赖的内吞途径 (clathrin-mediatedendocytosis)感染人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma,RD) [Yamayoshi,S.,etal.,ScavengerreceptorB2isacellularreceptorfor enterovirus71.NatMed,2009.15(7):p.798-801.]；而感染JurkatT淋巴细胞系 则主要利用小窝依赖的内吞途径(caveolar-dependentendocytosis)[LinHY,Yang YT,YuSL,etal.CaveolarendocytosisisrequiredforhumanPSGL-1-mediated enterovirus71infection.JVirol.2013,87(16):9064-76.]。目前，关于EV71感染 Caco-2的途径及机制仍不清楚。

病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，这 些宿主细胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞以及分泌 中发挥着重要的作用。如Rab5a、Rab5b、Rab5c介导了批网格蛋白衣被小泡 从细胞质膜向早期内体的转运(GorvelJP,ChavrierP,ZerialM,etal.rab5 controlsearlyendosomefusioninvitro.[J].Cell,1991,64(5):915-925.)；网格蛋白 (clathrin)主要负责受体介导的的内吞过程；小窝蛋白家族分子caveolin-1 (CAV1)、caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)将物质运输至高尔基体； Flotillin分子能够与脂筏内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内；ADP核糖基化 因子6分子参与调解细胞质膜运输和胞内肌动蛋白装配；GTP酶激活蛋白分 子GRAF1在网格蛋白非依赖型的囊泡运输中具有重要的调节作用；白细胞介 素2受体内吞调节了信号通路并影响了细胞增殖(JasonMercer,Mario Schelhaas,etal.VirusEntrybyEndocytosis.AnnuRevBiochem. 2010；79:803-833.)。在以上这些分子中，caveolin-1和clathrin被证实分别参与 了EV71感染JurkatT淋巴细胞和RD细胞的过程，而其它分子在EV71感染 中的作用还未有报道。

液泡分选蛋白4A(vacuolarproteinsorting4homologA，VPS4A)由VPS4A 基因编码，其另一同源蛋白为Vps4B，二者都属于ATP酶AAA蛋白成员， 通过水解ATP提供能量，与转运必需内体分选复合物(EndosomalSorting ComplexRequiredforTransport，ESCRT)第三成员ESCRT-III的相关蛋白相 互作用，参与到细胞膜性结构的变形和剪切过程中。其主要生物学功能包括 多囊泡体的形成、胞质分离、病毒出芽释放等(HenneWM,BuchkovichNJ,Emr SD.TheESCRTpathway.[J].DevelopmentalCell,2011,21(1):77–91.VottelerJ, Wi.S.VirusbuddingandtheESCRTpathway.[J].CellHost&Microbe,2013, 14(3):232-241.)。

肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(hepatocytegrowthfactor-regulated tyrosinekinasesubstrate，HRS)作为ESCRT-0的一个重要分子，可识别和募集 范素化修饰的底物，使底物进入多囊泡体介导的分选和降解途径(HenneWM, BuchkovichNJ,EmrSD.TheESCRTpathway.[J].DevelopmentalCell,2011, 21(1):77–91.VottelerJ,Wi.S.VirusbuddingandtheESCRTpathway.[J].Cell Host&Microbe,2013,14(3):232-241.)。

近年来研究发现VPS4A和HRS均能介导柯萨奇病毒A9、轮转病毒等多 种病毒的的细胞入侵，表明VPS4A和HRS在病毒感染入侵阶段也发挥着重 要作用(HuttunenM,WarisM,KajanderR,etal.CoxsackievirusA9infectscells vianonacidicmultivesicularbodies.[J].JournalofVirology,2014, 88(9):5138-5151.Silva-AyalaD,LópezT,GutiérrezM,etal.Genome-wideRNAi screenrevealsarolefortheESCRTcomplexinrotaviruscellentry.[J].ProcNatl AcadSciUSA,2013,110(25):10270-10275.)。

目前还没有任何关于VPS4A和HRS分子在EV71感染宿主细胞(特别是 Caco-2细胞)中作用的报道，对于这两个分子进行深入研究不仅能够提升对 EV71感染与致病机制的认识，也可以为预防与治疗EV71感染提供新的思路 与靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。

本发明的另一目的在于提供液泡分选蛋白4A(vacuolarproteinsorting4 homologA，VPS4A)的新用途，特别是在抗肠道病毒71型感染中的应用。

本发明的第三目的在于提供干扰VPS4A分子表达的siRNA。

本发明的主要技术方案是：

本发明以人结肠癌细胞(Caco-2)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调 靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人结肠癌细胞(Caco-2) 的宿主因子，从而达到在肠道系统阻断病毒感染人体的目的。本实验选择了 一组宿主细胞跨膜转运分子来进行筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜物质运 输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它们往往也是在病毒感染过程中 易被病毒“劫持”并利用的分子。这些分子包括：ADP核糖基化因子6(ARF6)、 caveolin-1(CAV1)、caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)、网格蛋白轻链 A(CLTA)、网格蛋白轻链B(CLTB)、网格蛋白重链(CLTC)、Flotillin蛋白1 (FLOT1)、Flotillin蛋白2(FLOT2)、GTP酶激活蛋白(GRAF1)、白细胞 介素2受体(IL2RB)、VPS4A、HRS、Rab5a、Rab5b、Rab5c。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对这些 基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列，然后设计siRNA， 通过下调这些分子，来观察对EV71感染的影响。

本发明发现液泡分选蛋白4A(vacuolarproteinsorting4homologA， VPS4A)在EV71感染Caco-2中均发挥着重要的作用，下调VPS4A的表达， 能明显抑制EV71的感染。

本发明的第一方面，提供了液泡分选蛋白4A(VPS4A)在制备预防或治 疗肠道病毒71型感染(疾病)药物中的应用。

本发明提供了VPS4A作为一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。

进一步地，本发明还提供液泡分选蛋白4A(VPS4A)在制备预防或治疗 手足口病药物中的应用。

本发明所述的液泡分选蛋白4A(VPS4A)在制备预防或治疗肠道病毒71 型感染药物中的应用，该药物具体是指能够抑制或下调VPS4A的表达量的试 剂。

所述的抑制下调VPS4A的表达量的试剂可以是siRNA、shRNA、包含 siRNA、shRNA的重组载体(如质粒)等。

本发明的第二方面，本发明提供了液泡分选蛋白4A(VPS4A)的干扰 RNA在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用，所述的干扰RNA (siRNA)的序列如下：

液泡分选蛋白4A干扰RNA序列：

CCAUGGAGAUGACUUGGAUUU(SEQIDNO:34)

GUCCCAGUCAAUACAGAGUUU(SEQIDNO:35)

GGUAUCUCAACCGGAACUACU(SEQIDNO:36)

其中，以如SEQIDNO:35所示的siRNA下调VPS4A的表达量效果最佳， 且降低EV71对Caco-2细胞的感染最为明显；

本发明筛选到能够抑制EV71感染Caco-2细胞的新的宿主细胞分子 VPS4A。VPS4A基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了 EV71对Caco-2细胞的感染。

因此本发明为临床预防和治疗因EV71感染所导致手足口病、神经系统和 心肺系统疾患提供了新的靶点和治疗方案。

附图说明

图1为转染有效siRNA后的干扰效率及细胞毒性检测，图中主坐标轴表示干 扰效率，次坐标轴表示对细胞毒性的影响；

CTRL：不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targetingsiRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组(实验组)。

图2为免疫荧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，其中A为下 调各分子后对病毒感染性的荧光检测图，B为下调各分子后对病毒感染的抑 制率图；

CTRL：不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targetingsiRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组(实验组)。

图3为转染VPS4A、HRS分子的不同干扰序列后的干扰效率及对EV71感染 性的影响图，A为VPS4A基因的mRNA水平检测图，B为HRS因的mRNA 水平检测图，C为干扰VPS4A基因后EV71病毒量检测图，D为干扰HRS基 因后EV71病毒量检测图；

CTRL：不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targetingsiRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组)；

VPS4A-34：转染针对VPS4A基因的siRNA(SEQIDNO:34)的Caco-2细 胞组；

VPS4A-35：转染针对VPS4A基因的siRNA(SEQIDNO:35)的Caco-2细 胞组；

VPS4A-36：转染针对VPS4A基因的siRNA(SEQIDNO:36)的Caco-2细 胞组。

HRS-37：转染针对HRS基因的siRNA(SEQIDNO:37)的Caco-2细胞组；

HRS-38：转染针对HRS基因的siRNA(SEQIDNO:38)的Caco-2细胞组；

HRS-39：转染针对HRS基因的siRNA(SEQIDNO:39)的Caco-2细胞组。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于 此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆： 实验室指南》(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的 条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数按重量计算。

实施例1：

1、设计、合成各宿主细胞分子的特异性siRNA序列。

1.1针对各个目的基因，检索NCBIGeneBank得到全序列和mRNA序列， 利用现有的网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析，选择编码区 作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的 blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除aitisense链的5’端 连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其 它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的 动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见表1。

1.2单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。

表1.siRNA靶点的设计

2、siRNA序列筛选与干扰效果鉴定

2.1RNA转染

转染步骤参照Lipofectamine2000说明书

1)提前12-16小时将Caco-2细胞(购自Sciencell，保藏号：1000)铺在 24孔细胞培养板上培养，使得转染时细胞密度为80％-90％。

2)取2μLLipofectamine2000加入50μLopti-MEM中并轻柔混匀，室温孵 育5分钟；另取5μL浓度为5μM的干扰RNA和50μLopti-MEM混合。孵育 结束后，将稀释的Lipofectamine2000转染试剂加入稀释的RNA中，并轻柔 吹吸混匀。室温孵育20min后，加入Caco-2细胞中，补加400μLopti-MEM， 使得RNA终浓度为50nM。

3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。

2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平

1)TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，具体步骤如下：

转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1mlTRIzol，充分混合室温 裂解细胞3-5分钟。加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15秒。于4℃、12,000 转离心15分钟。取上层水相并转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充 分混合，室温沉淀10分钟。于4℃、12,000转离心10分钟。弃上清，加入 1ml预冷的75％乙醇。于4℃、12,000离心5分钟。充分弃上清，室温晾干 RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀，得到总RNA。

2)利用takara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA，具体步 骤如下：

在PCR管中加入如下反应体系，

轻柔混合混匀，置于37℃反应15分钟，然后置于85℃加热5秒钟灭活 逆转录酶。

3)荧光定量qRT-PCR检测

利用takara的SYBRPremixExTaq试剂盒进行反应，反应体系如下，

利用RotorGene3000A仪器进行两步法扩增，95℃预变性2min，进行40 个PCR循环，95℃5秒，60℃30秒。

3、细胞毒性实验

采用CCK-8方法检测转染siRNA后对细胞增殖的影响，具体步骤如下：

收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。待细胞过夜 贴壁后，转染各siRNA，培养48小时后检测细胞增殖情况。弃去原有培养基， 每孔加入含10μLCCK-8的新鲜培养基110μL，培养3h后用多功能酶标仪在 450nm波长检测各孔吸光度值。实验独立重复3次，计算平均值。

4、EV71病毒感染Caco-2细胞

4.1Caco-2细胞的EV71病毒感染实验

Caco-2细胞转染RNA后60小时，进行EV71病毒感染实验。将培养上 清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝0.1的病毒量接种EV71，37℃孵 育2h后弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，加入新鲜培养基继续培养。

4.2免疫荧光染色检测EV71抗原表达

Caco-2细胞感染病毒后继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的 表达，具体步骤如下：

1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每 孔加入100μl预冷甲醇，于-20℃条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细 胞3次。

2)透膜：固定后的细胞每孔加入100μl0.1％TritonX-100，室温孵育15 min，用预冷PBS洗涤3次。

3)封闭：每孔加入100μl3％BSA，于室温下孵育1h。

4)一抗孵育：每孔加入EV71特异性鼠源单抗10F0(1:2000稀释)100 μl，室温孵育1h，用预冷的PBS洗涤3次。

5)二抗孵育：每孔加入AF488荧光标记抗鼠IgG(1:1000稀释)100μl， 室温避光孵育1h，用预冷的PBS避光洗涤2次。

6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000，PBS稀释)， 室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤3次。

7)荧光显微镜下检测并计算绿色AF488阳性细胞克隆数。

4.3qRT-PCR检测细胞中EV71病毒量

Caco-2细胞感染病毒后继续培养48h，采用TRIzol提取对照组与干扰组 细胞的总RNA，并逆转录获得cDNA，通过qRT-PCR检测EV71病毒量。具 体步骤同2.2所示。

5、实验结果：

1、设计、合成并筛选有效的siRNA

针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰靶点序列，并利用设 计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程， 每一基因共合成3条干扰序列，如表1所示。

采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到Caco-2细胞中去， 48h后通过qRT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，最终筛选到干扰效果最佳 的siRNA序列进行后续实验，其干扰效率如表2所示。

表2qRT-PCR法检测siRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率

注：CTRL：不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空细胞组)

NT：转染non-targetingsiRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组)

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组(实验组)。

2、siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测

挑选出的针对各宿主分子的有效siRNA转染Caco-2细胞，转染后48h 通过qRT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，同时采用CCK8检测转染后 对Caco-2细胞毒性的影响。

结果如图1所示，转染有效siRNA组与CTRL组相比，转染各siRNA后 能够明显抑制相应基因的表达水平(P＜0.01)。转染VPS4AsiRNA(SEQID NO:35)和HRSsiRNA(SEQIDNO:39)的抑制效率分别高达72.17％和78.88％。

细胞毒性实验表明，各siRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P＞ 0.05)，对细胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。

3、siRNA干扰后对EV71病毒感染的影响

转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染 相同剂量的EV71病毒，感染48h后，采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后 对EV71感染的影响，发现与对照组相比，转染VPS4AsiRNA(SEQIDNO:35) 和HRSsiRNA(SEQIDNO:39)分别使VPS4A基因和HRS基因下调后，明 显降低了EV71对Caco-2细胞的感染(图2A)。通过计算病毒量发现，VPS4A 和HRS基因下调后对病毒的抑制率分别达到59.44％和68.57％，而其余分子 的下调并没有明显抑制EV71对Caco-2细胞的感染(P＞0.05)(图2B)。

为明确VPS4A和HRS对EV71感染的抑制作用，分别转染三条VPS4A 和HRS分子的siRNA观察对病毒感染性的影响。结果表明不同的siRNA对 VPS4A和HRS分子的下调效率不同(图3A、3B)，其中VPS4AsiRNA(SEQ IDNO:35)和HRSsiRNA(SEQIDNO:39)的干扰效率最高，与前面的结果 相一致。检测干扰后对EV71感染性的影响发现，三条VPS4A和三条HRS 分子的siRNA对病毒感染的抑制率均可达到50％以上，而且随着对VPS4A 和HRS分子的下调效率的增高，对EV71感染的抑制率也在升高(图3C、3D)， 提示VPS4A和HRS分子在EV71感染Caco-2中发挥着重要作用。

因此，VPS4A和HRS可作为抑制EV71对Caco-2细胞感染的新的宿主 靶点。

通过以上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制EV71感染Caco-2细胞 的两个新的宿主细胞分子VPS4A和HRS。VPS4A和HRS基因下调以后，不 影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了EV71对Caco-2细胞的感染。因此 本发明为临床预防和治疗EV71感染提供了新的靶点。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不 限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下 还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请 权利要求所限定的范围内。