用于粘附于微量滴定板的流体填充井的底部上的样品的显微镜成像的方法

摘要

本发明描述了一种用于样品的显微镜成像的方法，其中设置有样品井，该样品井填充有液体并且包括具有底部的井结构，并且其中所述样品粘附于所述样品井的所述底部，其中：(a)使用照明辐射照亮所述样品井，并且(b)捕获所述样品井的所述底部的至少一个样品图像，其中通过如下步骤校正由所述井导致的所述底部的照明的任何不均匀性：(c)设置测试井，(d)通过使用所述照明辐射照亮所述测试井，捕获覆盖所述测试井的整个底部的参考图像，(e)分析所述参考图像，以确定亮度校正规范，(f)所述亮度校正规范被用来校正所述样品图像。本发明使得所述底部的照明被改进以用于成像。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于样品的显微镜成像的方法，其中提供有填充有液 体并且具有井结构的样品井，所述井结构包括底部，并且其中所述样品粘 附于所述样品井的底部，其中：

(a)样品井被照明辐射照亮，并且

(b)被照亮的样品井的底部从样品井的下侧被放大地成像，并且样 品井的底部的至少一个样品图像被捕捉。

背景技术

活细胞的显微镜检查在生物医学中扮演了重要的角色。这些细胞经常 在具有井的微量滴定板中被培养。然而，还使用其它独立的井。所述细胞 定位在底部上并且被培养基包围。它们通常使用倒置显微镜经历显微镜检 查；在该显微镜中，物镜位于井的底部下方。样品可以通过入射光或透射 光被照亮。对于透射光成像，光源设置在井的上方。然而，由于生物细胞 仅包含很少的吸收成分，所以明视野的透射光图像通常具有较低的对比 度。在诸如相位对比、尤其是DIC的各种透射光对比法的帮助下，单个的 细胞成分彼此之间的以及单个的细胞成分与周围介质之间的折射率的微 小差异可以被转换为光强(intensity，强度，亮度)差，然后该光强差 提供高对比度的透射光图像。

特别地，本发明涉及粘附于微量滴定板的井的底部的样品的透射光显 微镜检查。该底部被透射光照明并且被以高分辨率成像在显微镜上。这类 显微镜检查与诸如DE10200541A1中所述的整个微量滴定板的通常的成像 不同，该成像惯常用在现有技术水平的其它应用中。当底部被单独地或以 小组地在透射光中放大成像时，对透射光照明的质量的要求会更高。对于 命名为透射光对比法的方法尤其是这样。

本发明的领域还与所谓的荧光读取仪不同，该荧光读取仪检查液体是 否或者如何强烈地在微量滴定板的井中发荧光。此处，通常地，对微量滴 定板的所有井的检测也同时进行。此外，底部的照明的质量在这些应用中 是不相关的。US6074614涉及微量滴定板的这种使用并且提供盖板，该盖 板具有适于微量滴定板的多个圆柱形突起，其中该圆柱形突起浸入微量滴 定板的可能发荧光的液体中。目的是保证在激发和读取荧光时通过微量滴 定板的井的光束路径的长度尽可能地一致。微量滴定板的井的底部的照明 的问题不起任何作用。

在显微镜检查中，图像质量不仅取决于所使用的成像光学，还取决于 照明的质量。包括物镜、镜筒透镜、目镜或照相机的成像系统尽可能精确 地对样品平面中的环境成像。这些环境受样品本身以及照明光场的影响。 该光场的特性由物场(照明)中的光强分布和照明角度分布表征，即来自 所述多面角度的光线到达物场的每一个单独的点(照明的数值孔径 (numericalaperture，NA))。然而，该照明效果通常不是该研究的目的， 而感兴趣的是样品。因此，旨在实现尽可能均匀的照明以达到使用相同角 度的光谱的光线照亮物场的每一点的效果。这既适用于其中光线发出通过 样品并且被位于另一侧的成像物镜收集的透射光照明，还适用于其中照明 被发出通过成像物镜的入射光照明。

在透射光中，通过Koehler型照明最佳地获得所述环境。然而，即使 那样，照明也不会是完全均一的。使用基于肉眼的检查，这是不要紧的， 因为，一方面人眼只能较差地识别光强的微小差异，并且另一方面特定地 在当前的视野中总是只能看见一个图像。即使在视野的边缘处的光强看得 见地稍微下降，在多数情况下这也不是问题。在使用基于照相机的图像捕 获的观察中，情形就严重得多。光强的微小差异被更好地检测，并且然后 被视为干扰。该效应尤其在全景/拼接图像中出现。在极端的情况下，拼 接算法可能需要更多的时间进行图像配准，或者配准甚至变得不可能。

为了避免这种效应，可以实施黑点校正(shadingcorrection)。这 例如通过捕获没有样品的参考图像来进行。该参考图像包含干扰完美的照 明和成像的照明伪影。其例如为已在上面描述的不均匀的照明，还可以是 可能位于个别镜头、镜子或光束路径中的其它元件上的灰尘和污物，正如 光束路径的任何有缺点的调整。所有这些效应在本文中被概括在术语“黑 点”之下，其在使用所述光束路径捕获的每一个图像中出现。如果已知参 考图像，那么可以通过所谓的黑点校正校正样品图像。这样的方法例如在 US2010/0188497中描述过。还存在其中在没有之前的参考图像的捕获的 情况下黑点可被识别出并且被去除的方法。关于这一点可以参考WO 13/094273。

然而，所有这些方法仅识别和校正与光束路径有关的黑点，即与样品 位置无关、但是定像于光束路径的参考系统内的黑点。样品关于一个或多 个物场在一个方向上的任何移位不会改变与该光束路径有关的黑点的任 何事情。因此，该参考图像不会随样品的移位而改变。

在US2003/039402中，描述了一种方法，该方法可以在扫描图像中去 除划痕或其它伪影。原则上，该方法也可以转用于显微镜检查，并且该方 法将可以识别和去除样品平面中的诸如微小头发的特定的伪影。然而，为 了检测黑点，将需要有关伪影的类型的先验的知识，否则，图像分析不能 确定图像的哪些元素可以被指定为样品以及哪些元素是黑点。在黑点的特 征不在于轮廓清晰的结构，而在于具有空间延伸的亮度梯度的情况下，该 方法也会失效。

发明内容

因此，本发明提供一种用于粘附于井的底部的样品的显微镜成像的方 法，以使得所述底部的照明被改进以用于成像。

本发明提供一种用于样品的显微镜成像的方法，其中设置有样品井， 该样品井填充有液体并且包括具有底部的井结构，并且其中所述样品粘附 于所述样品井的所述底部，其中：

(a)使用照明辐射照亮所述样品井，并且

(b)从所述样品井的下侧对被照亮的样品井的所述底部进行放大成 像，并且捕获所述样品井的所述底部的至少一个样品图像，

其中通过如下步骤校正由所述井导致的所述底部的照明的任何不均 匀性：

(c)设置测试井，该测试井填充有液体，并且具有与所述样品井相同 的井结构，但不具有样品，

(d)通过使用所述照明辐射照亮所述测试井，在所述测试井上实施参 考测量，从所述测试井的下侧对被照亮的测试井的底部成像，并且捕获覆 盖所述测试井的整个底部的参考图像，

(e)分析所述参考图像，以确定亮度校正规范，其中所述亮度校正规 范表示亮度波动，所述亮度波动是在所述测试井的所述底部上的位置的函 数，

(f)用所述亮度校正规范来校正所述样品图像，其中确定所述样品图 像的至少一部分在所述底部上的位置，并且使用所述亮度校正规范中被分 配给所述底部上的该位置的值。

本发明基于以下认识：相对样品容器的参考系统固定的基于样品容器 的黑点不会被所述的方法识别并且因此不能被校正。

当样品容器本身的结构导致黑点时，会存在基于样品容器的黑点。特 别地，这例如在如下文描述的小容器(微量滴定板)中发生。当样品被移 动时，所述黑点也移动。因此，它总是在基于样品容器的参考系统的同一 点处，但是不能被分配给基于光束路径的参考系统的任何固定位置。特别 地，亮度梯度发生在微量滴定板的透射光照明中。微量滴定板是尤其被用 在活细胞的观察中的样品容器。这些板配备有每隔一定间隔的例如24、96 或384个规定数量的井。诸如细胞或胚的样品可以被引入这些井的每一个 中。为了显微镜观察，所述井设置有例如由聚苯乙烯或玻璃制成的透明底 部。所述井的光学属性具有对透射光的照明的显著的干扰效应。在下文中， 将使用包括具有11mm的高度和7mm的直径的96个井的微量滴定板来说明 该效应。

井的上边缘截取透射光照明的光锥，从该锥上，光线可以到达井的底 部的特定点并且可以在通过底部之后被成像物镜检测。根据点是处于井底 部的中心还是靠近边缘，可用的光锥是不同的，即井的底部的点从不同数 值孔径被照亮。这导致取决于样品容器的黑点，该黑点效应变得越大，照 明光锥就被井截取得越多，并且均匀的照明光强就会越少地分布在不同的 照明角度上。相反地，当成像物镜的数值孔径足够大以捕获所有不同的照 明锥并且该照明在这些锥的每一个中包括大约相等的光强时，井的底部的 照明保持均匀，但是井的边缘仍会截取照明光线。

然而，样品定位在其中的水相介质在其表面上形成弯月形透镜。因此， 空气与介质之间的边界表面是弯曲的。弯月形透镜的半径取决于液体的类 型、井的壁材料和涂层，还取决于填充方法，例如是干的还是已经潮湿的 井被填充，液体是否被搅拌等。在多数情况下，液体沿井壁轻微向上回缩， 同时液面在井的中心更深。

这具有如下效应，平行的光束通过弯月形透镜后会发散。弯月形透镜 的半径越小，该发散就越强烈。在使用具有高NA的成像物镜的情况下，因 为发散光束仍然可以被检测到，所以这不会构成主要问题。然而，多数应 用需要成像大视野的弱放大的物镜，以允许形成样品的全景图像。例如， 2.5x的放大物镜的单一图像覆盖微量滴定板的96个井的整个井。

然而，弱放大的物镜通常仅具有低NA，例如0.08或0.12。NA(NA＝ n*sin(α))限定了最大角度α，该角度可以由光束与用于成像物镜成像 的光轴形成。为此，n是成像物镜与样品之间的介质的折射率。因为使用 弱放大的物镜，所述介质一般为空气，所以n＝1。所以，折射成比由物镜 NA建立的临界角度更大的角度的所有照明光束不会到达成像物镜。即使照 明光到达井的底部的每一部分，那么取决于入射角，弯月形透镜效应产生 不均匀的照明图像，来自样品的光线不会以相同比例到达物镜。

结果，捕获的图像通常具有明亮的中心和较暗的边缘区域。这产生了 不能通过已知的黑点校正方法校正的基于样品容器的黑点。

本发明使用亮度校正规范，其为在井的底部上的位置的函数。术语 “井”或“样品井”被用来表示样品容器。其可以是单独的容器，也可以 是微量滴定板的井。当下面的说明中使用单数形式(“一个井”)时，那 么也意味着使用单独的多个井以及微量滴定板的单独的多个井。

测试井对应于包含样品的样品容器的结构，最大的不同之处在于测试 井中不存在样品。当粘附于样品井的底部的样品是培养液时，即在井中还 发现有液体时，优选的是在测试井中也提供该液体。测试井会精确地产生 所述光学环境，即影响也在样品井中生效的照明辐射，但是没有样品。结 果，可以借助测试井确定亮度校正规范，其为在井的底部处的位置的函数， 然后当在样品井中成像样品时，该亮度校正规范被用于校正不均匀的亮度 分布。

亮度校正规范可以以不同方式提供，其中：

在第一实施例中，测试井的底部被成像为数个局部图像，并且通过组 合该局部图像来获取参考图像。然后，亮度校正规范实质上是测试井的整 个底部上(即在参考图像上)的亮度分布。成像样品井提供样品图像。为 了校正由于放大倍率而仅示出井的底部的一部分的样品图像，底部上的样 品图像的位置被确定。然后，参考图像的相应地选定的部分提供需要的亮 度校正数据，用于校正样品图像。

第二实施例给出了参考图像中的亮度分布的功能性说明。对于测试井 的底部上的每一个位置(例如对于每一个像素)，在参考图像中确定校正 因子，该校正因子给出与均匀的亮度分布的加法的或乘法的差异。然后， 通过确定样品图像在底部上的位置，从亮度校正规范中读出用于该位置的 校正因子的一个或多个对应值，并且应用该校正因子(或者加法的或者乘 法的，取决于因子的设计)，校正样品图像。这可以在像素基础上或在样 品图像的区域的基础上进行。

在第三实施例中，特别地，其可以用在具有圆形横截面的井中，亮度 校正规范包括校正因子(也是或者加法的或者乘法的)，该校正因子排他 地取决于距离测试井的底部中心的距离。对于该实施例，仅需要在步骤(d) 的参考测量中获取图像，该图像覆盖沿径向坐标的从测试井的底部中心向 外至其边缘的区域。样品图像在该实施例的步骤(f)中被进行亮度校正， 其中确定图像的每一个像素的径向坐标，即距离井的底部中心的距离。从 亮度校正规范中读出对应的校正值，并且将该校正值应用于样品图像，给 出亮度校正。

应理解的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下，上述的特征以 及将在下文中说明的特征不仅能够以所阐明的组合应用，还可以以其它的 组合或单独地应用。

附图说明

下面参照附图通过示例更详细地解释本发明，所述附图也可能公开本 发明的特征。所述附图示出为：

图1图示在粘附于微量滴定板的底部的样品的透射光显微镜检查中 的物镜的数值孔径的影响的两个示意图；

图2图示成像与照明的数值孔径之间的相互关系的与图1类似的五 个示意图；

图3用于成像位于微量滴定板的井的底部上的样品的显微镜的示意 图；

图4图示在照明上受井的影响而导致的井底部处的光强分布的函 数；

图5说明井的底部的非均匀照明的校正的一般原则的流程图；

图6说明在第一实施例中的根据图5的校正的示意图；

图7说明第二实施例的流程图；以及

图8说明第三实施例的示意图。

具体实施方式

图1示意性地示出穿过微量滴定板的井1的剖面图，其沿着光轴OA被照 明光束2照亮。在井的底部3上存在例如为细胞培养的样品，所述样品没有 更详细地示出。例如为用于细胞培养的培养基的流体4位于该井中，该流 体在其表面上形成弯月形透镜5。

在图1中，照明光束2从上方发出。以此方式被照亮的底部3在透射光 中被具有检测锥6的成像物镜成像。

井1中的样品通常位于例如样品缓冲剂或培养基的水相环境中，以观 察活细胞。在其表面上，所述液体4形成弯月形透镜5，因此空气与介质之 间的边界表面被弯曲。弯月形透镜5的半径取决于液体4的类型、井1的壁 材料和涂层，还取决于填充的历史，例如是干的还是已经潮湿的井1被填 充、液体是否被搅拌等。在多数情况下，液体4沿井壁轻微地向上回缩， 同时液面在井的中心更深。

当平行的照明光束2通过弯月形透镜5时，光束不再平行而是被发散。 弯月形透镜5的半径越小，该发散就越明显。在具有较大检测锥6的高NA物 镜中，因为发散光束仍然会被检测到，所以这不会是问题。然而，应用通 常需要低倍率放大物镜，以成像大视野并且获取底部的全局图像。例如， 2.5x的放大物镜的单一图像几乎使具有96个井1的微量滴定板的井1的整 个底部3成像。

低倍率放大物镜通常仅具有低NA，例如0.08或0.12。NA＝n*sin(α) 限定了围绕光轴OA的检测锥6的最大角度α，利用物镜仍能从该光轴锥成 像。n是物镜与样品之间的介质的折射率。因为使用弱放大的物镜，其一 般为空气，所以n＝1。所有由弯月形透镜5折射成比由物镜NA建立的最大角 度更大的角度的照明光束不会到达物镜。即使照明光到达底部3的每一部 分(如图1的左手侧部分所示)，那么取决于入射角，弯月形透镜效应会 产生不均匀的图像，对于整个底部，透射光照明不会以相同比例到达物镜。

图1假定了平行照明光束2的理想情形。然而，通常的透射光照明是不 平行的，而是明显地具有角度范围，该角度范围通常与由照明的数值孔径 (NA)给出的角度一样宽。对于前述物镜，其中NA＝0.12，其它入射角的 光束导致图2中示出的照明图案。在图2的五个图示中，照明的数值孔径为 0.05、0.1、0.15、0.2和0.25。

对于底部3上的每一个入射角，照明图案是不同的。然而，事实是， 对于所有几何结构，可以被物镜使用的光束根本不会或通常较少到达边缘 区域。捕捉的图像来自所有这些单独的光束的总和。因此，图像具有明亮 的中心和暗的边缘。不管透射光照明的类型，例如不管其是Koehler型照 明、临界(critical)型照明或另一类型的照明，这个考虑都适用。不管 井1上方承载什么，所述效应仍然保持。

图3示意性地示出了用于对在微量滴定板11的井的底部3上的样品 14进行高分辨率成像的显微镜。参照图1和2，为了防止说明书重复，已 经描述的元件和部件在图3中赋予相同的附图标记。

显微镜具有照明光源16，该照明光源16沿光轴OA并且从上方通过照 明光束路径到达微量滴定板11上地发射照明光束2。光束与光轴OA对齐， 以使得包含待成像的样品14的井适当地位于照明光束路径中，即位于照 明光束2中。从被照亮的样品14透射的光从微量滴定板11的下侧15被 成像。显微镜的对应的成像光束路径从微量滴定板11下方通过物镜17延 伸并且延伸至检测器18，该对应的成像光束路径通过示例示出。成像光束 路径与光轴OA对齐，即照明光束路径与成像光束路径一样沿相同的光轴 OA定向。

控制器19从检测器18中读出数据。为了对微量滴定板11的多个井 单独地成像，板的下侧15被支撑在样品台20上，该样品台能够通过由控 制器19控制的驱动机构21移动，以使得微量滴定板11的各个井可以与 光轴OA对齐。

微量滴定板11的多个井中的一个被设置为测试井22。该井与微量滴 定板11的剩余的井相同，除了一个区别：在测试井22的底部3上没有样 品14。测试井22的底部3的照明经受与包含样品14的样品井的底部3 的照明完全相同的条件。

如已经参照图1和图2说明的，井1会影响井的底部3如何被照明。 图4通过示例以图形示出了该影响，在该图形中，照明的光强I，即底部 3上的亮度，作为离井1的中心的距离的函数下降。井的中心可以例如与 光轴OA的位置对应。最大亮度，即光强I₁在此处出现。通过示例被假设 为圆柱形的井的边缘位于半径r₁上。由于井的圆柱形形状，所以仅径向坐 标r是重要的。在井的边缘处，即在r₁处，照明光强最小，例如为零。当 距离光轴OA的距离r减小时，光强I在较长的延伸量上几乎保持不变， 并且光强I朝向井的边缘减小，即在径向坐标r₁处减小。在图3的示例中 通过示例示出为透射光照明的该照明光强图案当然会影响样品14的成像。 如果观察平面不直接位于井的底部上而是稍微更进入到样品中观看，那么 入射光照明也给出类似的光强图案。此处给出的说明也可以总是适用于具 有入射光照明的显微镜，例如照明是从成像物镜的侧面发出的显微镜。

至边缘的光强的减小在科学文献中被称为“黑点(shading)”。其 不是由显微镜的光束路径产生的，而是由样品容器产生的。为了校正基于 光束路径的黑点，可以使用文献中已知的所有方法，本文中没有再次描述 这些方法。然而，样品容器产生基于样品容器的黑点，该基于样品容器的 黑点可以以下面描述的方式从样品图像中去除。在所有这些方法中，优选 的是首先去除任何基于光束路径的黑点(即使下文不描述)，结果，仅基 于样品容器的黑点被保留。

根据作为流程图在图5中被示意性地示出的方法去除基于样品容器的 黑点。图6示出了在该方法中形成的单独的图像。在步骤S1中，测试井 22被置于显微镜的照明和成像光束路径中。得到测试井22的底部3的参 考图像，即没有样品14的图像。物镜17的分辨率使得物镜17的物场不 会检测到整个底部3。因此，通过获取几个单独的图像23a并且例如以马 赛克(mosaictile)成像的形式扫描底部来进行所述成像。为了扫描，测 试井22垂直于光轴OA并且平行于底部3移动。测试井22对底部3的照 明的影响在每一个井位置处都改变。这说明将被校正的黑点是基于样品容 器的黑点，而不是由照明光束路径本身带来的黑点。所述黑点将完全独立 于井22的定位。

当扫描底部3时，单独的图像23a包含在底部3处以单独的图像23a 的位置为特征的底部3的照明的变化。在步骤S1的结束处，可得到例如 以马赛克成像的形式的来自多个单独的图像23a的底部3的参考图像24。

在随后的步骤S2中，确定参考图像24中的亮度分布。这提供了亮度 校正规范，其指定了与理想的均匀照明的偏差。该规范取决于测试井22 的底部3处的位置。

步骤S1和步骤S2给出了亮度校正规范。在图5的实施例中，其在进 一步的步骤S3和步骤S4之前出现，其中，S3用于使样品(多个样品)经 受显微镜检查和亮度校正(步骤S4)。然而，步骤S1和步骤S2并非必须 在步骤S3之前实施。还完全可以在步骤S3之后的任何时刻并且可选地仅 在没有校正样品14的成像不会令人满意的情况会出现时使步骤S1和步骤 S2产生亮度校正规范并且使步骤S4实施该亮度校正。

在步骤S3中，样品井1在底部被成像，其中样品14位于所述井的底 部3上。

在步骤S4中，在步骤S3中获取的样品图像23b通过使用亮度校正规 范而被校正；因此，步骤S4假设步骤S1和步骤S2事先已经被实施。在 该校正中，首先确定步骤S3的样品图像23b位于底部3上的哪个地方。 在获取了该位置信息之后，适用于样品图像23b的恰好该位置的亮度校正 被确定并且被利用，以校正在步骤S3中产生的样品图像23b的亮度。获 取校正后的样品图像23c，该校正后的样品图像关于基于样品容器的黑点 的影响的照明被均匀化。

在所述实施例中，例如以具有单独图像23a的马赛克图像的形式扫描 整个样品容器。理想地，此处使用不具有样品14的测试井22。当样品容 器是其中样品位于流体介质中的容器时，该介质还优选地出现在测试井22 中。因此，组成的参考图像24包含基于样品容器的黑点。

为了从具有样品14的样品图像23b中除去黑点，必须确定出样品图 像23b在底部3的哪一个位置处被捕获。为此，样品图像23b中的基于样 品容器的黑点的元素可以被检测。当例如井1的边缘的一部分在样品图像 23b中是可见的时，参考图像24的对应部分25可以被容易地读出，并且 黑点从样品图像23b中被除去。

校正的最简单的方法包括：将样品图像23b的像素的光强值除以参考 图像24的对应部分25的对应像素的光强值，并且然后重整该结果。该方 法也可以从用于基于光束路径的黑点的校正的方法中获知。此处，一个根 本的差异包括获取参考图像24的对应部分，即从较大的全景图像，匹配 在底部5上的样品图像23b的位置上。

以此方式，获取校正后的样品图像23c，其在样品图像23b上对基于 样品容器的黑点的影响进行了校正。

在所述实施例中，可能发生如下情况，即不能清晰地确定在底部3处 的样品图像23b的位置的清楚定位，以及由此不能清晰地确定参考图像24 的对应部分25的选择。当例如由于样品场没有覆盖边缘而使得没有样品容 器的清楚边缘在样品图像23b中是可见的时，基于样品容器的黑点仍可能 出现，正像不能明显地确定哪个可为用于校正样品图像23b的黑点的参考 图像24的合适部分25一样强烈地出现。

甚至可以在样品台20的驱动机构21给出底部5的定位的位置反馈的情 况下进行校正。于其处单独的图像23a被捕获用于参考图像24的每一点的 xy坐标被存储，即已知参考图像24中的每一点的xy位置。如果现在测试井 22被具有样品14的样品井1替代，相对于井1的xy位置也不会改变。不管于 其处样品图像23b目前被捕获的位置，参考图像24的合适部分25可以被确 定并且校正可以如上所述地被实施。

在具有多个类似的子单元的样品容器中，例如具有多个类似的井1的 微量滴定板11中，单个子单元(例如一个井)作为参考容器(即在测试 井22中)是足够的。单独的子单元被设置为固定图案，该固定图案或者 从制造商处获知，或者可以容易地独自地被测量出来。因此，在于其处样 品图像23b被捕获的每一对xy台坐标处，样品图像23b相对于各自的井1 的位置可以被直接地确定，并且参考图像24的合适部分25被选定。其使 用微量滴定板11的示例的一种可能的顺序在图7中示出。

在图7中，存在与图5的流程图对应的步骤，以使用相同的附图标记 表示，其中，一些子步骤以通过附加后缀来表示。在步骤S1.1中，寻找 用于测试井22的中心(x₀，y₀)。然后，例如通过马赛克图像获取测试井22 的底部3的参考图像24。

在步骤S3中，例如通过计算给出与平均亮度的偏差的加法的或乘法 的校正因子，将参考图像24的亮度分布转换成亮度校正规范。该亮度校 正规范取决于参考图像24中的坐标(x，y)。

在步骤S2中，样品图像23b在期望的坐标(x，y)处被捕获。

在步骤S4.1中，计算从样品图像23b的中心至井的中心的距离向量r。 该向量限定了在亮度校正规范中的对应部分25。

在步骤S4.2中，用于该部分25的对应的校正被从用于所述距离向量 r的亮度校正规范中读出。

最后，步骤S4.3通过用于该部分的亮度校正规范，提供基于样品容 器的黑点的校正，其中该部分的中心已经被限定为由距离向量r应用。

亮度校正规范可以或者具有参考图像24的形式或具有从其计算的校 正值的图像的形式，当与参考图像(或者加法地或者乘法地)组合时，其 给出一致的亮度。当亮度校正被设置为参考图像24时，校正步骤S4从参 考图像24的对应部分25的亮度分布中提取校正因子。然而，当亮度校正 规范已经包含校正因子，即这些因子已经从参考图像24中被计算，步骤 S4不需要再这样做。关于基于样品容器的黑点的校正的重要性，术语参考 图像24和亮度校正规范是相同的(第一选项)，或者参考图像24表示亮 度校正规范的初步阶段(第二选项)，其中该转换可以是简单的数学运算 (例如，计算与平均值的乘法的或加法的偏差等)。

图8涉及图7的实施例。参考图像24表示亮度校正规范。图8示出 了参考图像24。参考图像24的中心26是已知的。对于给定的样品图像 23b，距离向量r是已知的。该向量指向样品图像23b的中心。现在，在 参考图像24中寻找与样品图像23b具有相同的距离向量r和相同的延伸 量的部分25。然后，该部分25正是将被用于给定的样品图像23b的校正 的参考图像(或亮度校正规范)的部分。

如果井是圆形的，那么简化的实施例仅获取距离向量r的大小(长度)。 为了改进该实施例，不仅可以读出该部分25的中心的距离向量的大小， 还可以读出该部分的每一个像素的距离向量的大小。

另一可能的实施例以参考图像24的绝对像素坐标给出参考图像24 (或亮度校正规范)。可以通过评估样品台20的驱动机构21的位置反馈 来获取这些像素坐标。然后，确定待校正的样品图像23b中的像素的坐标， 其中这些坐标参考参考图像24(或亮度校正规范)。对于来自参考图像 24(或亮度校正规范)的每一个像素，对应于该坐标的校正因子被读出并 且被应用以校正样品图像23b。

下面的修改和改进对于本发明是可选的：

参考图像24不必是组合图像。在需要时，保存单独的图像23a并从其 直接计算样品的合适的校正图像23b可能是足够的。

所述方法可以以其它顺序的步骤实施。例如，参考图像24不必被捕获， 直至后来在以后的时间进行样品图像23b的黑点校正才捕获参考图像。

已经描述了如下情况，其中，仅井的一部分被成像在检测器18上，并 且因此需要多个单独的图像23a来产生整个参考图像24。然而，在足够弱 的放大物镜和足够小的样品容器或井1的情况下，成像也可以使用整个底 部3的单一的捕获完成；那时，马赛克图像不再是必须的。否则，上述的 过程仍将保持有效。

当样品容器是圆形容器时，不必捕获整个容器作为参考图像24，以校 正由容器的边缘产生的黑点的影响。在圆形容器中，黑点相对于容器的中 心径向对称。这是例如在皮氏(Petri)培养皿或微量滴定板11的圆形井1 中的情形。那么，捕获从容器的中心至边缘的线I₀(r)作为参考图像是足够 的。为了校正样品图像，仅需要样品图像的每一个图像像素r_p＝(x，y)距 离容器的中心r₀的距离，即r＝|r_p-r₀|。校正值I₀(r)是直接从对于每一 个像素的这些距离r应用于样品图像23b，还是首先生成整个参考图像24、 然后使用它来校正样品图像，这都是不重要的。在两个变型中，基于样品 容器的黑点可以轻易地从样品的图像中被去除。

根据物镜的放大倍率和所使用的样品容器的尺寸，参考图像24可以由 非常大量的单独图像23a构成，非常大量的单独图像的捕获需要大量时间， 并且其存储或处理需要大量存储空间。然而，一般地，不同的物镜将显示 出不同程度的取决于样品的黑点。当考虑微量滴定板11的井1时，这可以 容易地看出。如前述已经说明的，井1中的液体的弯月形透镜5确保入射光 束被折射为较大的角度，特别是通过井的边缘附近的那些光束。通常，低 NA的物镜17不能再捕捉该光线，因此井的边缘将比中心明显更暗。另一方 面，高NA的物镜收集多得多的上述光线，这是边缘黑点较少以及基于样品 容器的黑点不同的原因。然而，差异仅在于黑点的强度，而不在于其类型。 两个物镜都可以在相同的物场中测试该黑点强度。原则上，位于容器的中 心的一个图像和位于边缘处的一个图像足以从其计算黑点强度因子 (shadingstrengthfactor)，该黑点强度因子使由两个物镜看到的黑 点效应彼此不同。参考图像24用较低放大倍率的物镜获得并且在考虑其物 镜的相应的黑点强度因子的情况下还用于较高放大倍率的物镜。以此方 式，参考图像24可以由明显较少的单独图像23a组成，这节约了时间、储 存以及计算能力。此外，在物镜改变的情况下，不需要捕获新的参考图像 来校正基于样品容器的黑点。可以简单地切换至合适的黑点强度因子。