NONRATT021972小干扰RNA在制备糖尿病并发心脏自主神经疾病药物的应用

摘要

长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在制备糖尿病并发心脏自主神经疾病药物中的应用。实验观察到长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA可改善糖尿病模型大鼠的心脏功能异常变化，降低升高的血糖、血清炎性因子水平、氧化应激水平、升高抗氧化物质的活性。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后，可显著地抑制糖尿病模型大鼠颈上交感神经节缝隙连接半通道蛋白1(Pannexin-1)的上调表达，抑制胰岛素受体底物-1(IRS-1)异常丝氨酸302磷酸化，提高下调的IRS1表达。还可在Pannexin-1和IRS1功能异常介导疾病药物中的应用。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA以口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型药物进行上述疾病防治。

说明书

技术领域

本发明涉及糖尿病并发心脏自主神经病变药物用途发明领域。

背景技术

糖尿病(DiabetesMellitus，DM)是一组代谢性临床综合征，随着社会的发展和人们生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，在发达国家糖尿病患病率已达3％-7％，成为仅次于癌症、艾滋病、心脑血管病之后第4位需要优先考虑的疾病，已成为世界第5位死亡主因。糖尿病分为1型(胰岛素依赖性)和2型(非胰岛素依赖性)糖尿病。据估计，全球六个人里面就有一个人处于患糖尿病并发症的危险中。我国糖尿病人群的构成以2型糖尿病为主，占糖尿病人群的90％以上，严重影响着人民健康和社会发展。糖尿病自主神经病变(Diabeticautonomicneuropathy,DAN)是一组由自主神经功能和(或)结构受损引发的征候群，主要累及心血管、胃肠道和泌尿生殖系统，具有起病隐匿、逐渐进展、可于症状出现前发生、甚少自行缓解的临床特征。其中，糖尿病心脏自主神经病变(Diabeticcardiacautonomicneuropathy,DCAN)危害尤为严重，可以引起无痛性心肌缺血、心肌梗死及恶性心律失常甚至心源性猝死。自主神经包括交感和副交感神经，从中枢下行的交感或副交感神经通过外周自主神经节换神经元后支配心脏等内脏器官等。心率和血压的变化直接受到自主神经系统(交感神经和副交感神经)活动的影响。

Pannexin-1基因是2000年发现的缝隙连接蛋白家族新成员，研究表明Pannexin-1蛋白可以在细胞膜上组成半通道或在细胞间形成缝隙连接通道，参与多种重要的生理病理过程。缝隙连接半通道(hemichannels)是缝隙连接通道的亚单位，在脊椎动物体内每一个半通道都是由Connexin或Pannexin蛋白组成的跨膜六聚体所构成，相邻细胞的两个半通道两两对接形成中空管道，介导小分子物质的流动，实现了细胞间信息和物质的快速交流与沟通。病理情况下Pannexin-1半通道的异常激活，细胞外ATP显著增加，并作用于嘌呤受体，从而激活Pannexin-1半通道介导的ATP诱导的ATP释放，并形成恶性循环，导致细胞外大量ATP的聚集，引起各种离子的异常流动，从而导致细胞内离子的紊乱及能量的缺失，出现细胞的肿胀及细胞膜的崩溃，从而涉及炎症、免疫系统以及神经系统的多种功能紊乱与疾病。

IRS1是胰岛素信号通路中的关键蛋白，参与细胞的生长和代谢。IRS的磷酸化对于胰岛素信号途径的转导很重要，其酪氨酸位点磷酸化可使信号正常传导，但是IRS异常丝氨酸的磷酸化，常导致IRS的降解从而干扰了胰岛素信号的传导，可能是引起胰岛素抵抗的重要的分子机制。敲除IRS1的小鼠出现2型糖尿病的一系列表现：周围组织的胰岛素抵抗，高血糖以及β细胞分泌功能障碍，β细胞数目减少。有报道文献IRS异常丝氨酸磷酸化可介导的背根神经节神经元胰岛素抵抗，并涉及糖尿病周围神经病变的发病机理。

大量研究证实，糖尿病高糖高脂毒性时，体内产生过多的自由基不能被清除，即可产生氧化应激增强。本研究实验结果表明糖尿病大鼠空腹血糖和餐后血糖明显升高，血清氧化应激指标丙二醛(MDA)增多，谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)和总一氧化氮合酶(T-NOS)的活性下降，提示糖尿病大鼠颈上交感神经节存在明显的氧化应激。氧化应激可诱导大量促炎因子合成释放，引发炎症反应，从而影响神经细胞的功能，改变神经细胞的微环境，参与或加速糖尿病及其心脏自主神经病变的发生、发展。炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)通路的激活，与包括神经病变在内的糖尿病慢性并发症的发生有关。

人类和其他高等真核生物的遗传物质只有极小一部分编码蛋白质，而超过97％的转录产物是功能多样的核糖核酸(RNA)分子，它们无编码蛋白质的功能，统称为非编码核糖核酸(noncodingRNA,ncRNA)。非编码RNA以RNA形式调节基因表达。非编码RNA大致分为2类：“看家RNA”与“调控RNA”。“看家RNA”一般都属于组成型表达，是细胞生存以及基本功能的必需成份。“调控RNA”可分为转录调控子、转录后调控因子、RNA分布调控因子、蛋白功能调节因子等。“调控RNA”包括微小核糖核酸(miRNA)、小干扰核糖核酸(siRNA)、可转录的假基因、反义RNA、核调节子等。调节ncRNA又可以分为小非编码核糖核酸(如miRNA、siRNA)、长于200nt到超过100kb的长非编码核糖核酸(LongnoncodingRNA，LncRNA)。随着越来越多非编码基因及其功能被识别和揭示，人们逐渐认识到lncRNA虽无编码蛋白质的功能，但和蛋白质分子一样重要，甚至是主要的功能性分子，在细胞正常生命活动中发挥重要而广泛的调节作用。研究提示lncRNA表达的变化和影响lncRNA的因素改变均与疾病有关。我们实验室前期SOLiD高通量大鼠转录组数据库筛选和分子生物学验证确定颈部交感神经节存在长非编码核糖核酸NONRATT021972[http://www.noncode.org]，在糖尿病模型大鼠颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972表达明显增加。本研究通过糖尿病模型大鼠长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸(RNA)抑制其表达，观察长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在糖尿病并发心脏自主神经病变中的作用及其调控机制，这对探寻糖尿病神经病变的发病机理及防治的新靶点具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA的第一个新用途，即长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在制备治疗糖尿病并发心脏自主神经疾病药物中的应用。

本发明的第二个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA的第二个新用途，即长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在制备治疗交感神经相关疾病药物中的应用。

本发明的第三个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA的第三个新用途，即长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在制备泛连接蛋白-1(Pannexin-1)半通道介导的相关疾病的药物中的应用。

本发明的第四个目的在于提供长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA的第三个新用途，即长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在制备胰岛素受体底物-1(IRS1)功能异常介导的相关疾病的药物中的应用。

本发明通过2型糖尿病大鼠模型，观察长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后2型糖尿病并发心脏自主神经病变中的作用及其调控机制，为长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA用于糖尿病并发并发心脏自主神经病变的预防和治疗提供帮助。

本发明通过建立2型糖尿病大鼠模型，并对前期筛选出的颈上交感神经节高表达长非编码核糖核酸NONRATT021972进行小干扰RNA，采用基因芯片技术分析长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后引起颈上交感神经节细胞功能相关基因的改变，进一步通过免疫荧光双标、Real-timePCR和蛋白印迹法对长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA后改变最明显的基因进行验证，观察长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰后血糖、血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、去甲肾上腺素(NE)以及氧化应激指标丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-PX)和总一氧化氮合酶(T-NOS)的变化，结合长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA后大鼠血压、心率、心电图指标、心率变异性和动脉血压压力敏感性等心脏自主功能表现出的差异，评价长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在颈上交感神经节介导糖尿病自主神经功能损伤中的作用及可能的机制。通过本实验研究以期进一步了解长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在糖尿病治疗中的作用及其可能作用的新靶点，并为糖尿病及其并发症的防治提供新的实验依据。

本发明研究显示糖尿病模型大鼠血糖明显升高，并存在明显的氧化应激，Pannexin-1表达上调和炎症因子释放增多，IRS1异常丝氨酸磷酸化及IRS1的表达下调，心脏自主神经功能受损；长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA后，降低大鼠血糖以及氧化应激水平，抑制糖尿病颈上交感神经节Pannexin-1表达的上调和炎症因子的释放，降低糖尿病颈上交感神经节IRS1异常丝氨酸磷酸化，改善IRS1表达下调并促进颈上交感神经节细胞生长，对糖尿病受损的心脏自主神经功能产生保护作用。

长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA在防治糖尿病及并发疾病的作用机理涉及：抑制与高糖高脂毒性引发颈上交感神经节/交感PC12细胞长非编码核糖核酸NONRATT021972高表达相关的缝隙连接蛋白Pannexin-1半通道、胰岛素受体底物-1(insulinreceptorsubstrate-1,IRS-1)的表达，对糖尿病并发疾病及其它相关疾病产生防治作用。

为了更好地理解本发明的实质，下面以长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA对2型糖尿病模型大鼠交感神经、心血功能异常的作用，及对颈上交感神经节上的缝隙连接蛋白Pannexin-1半通道、胰岛素受体底物-1表达的影响实验和相关结果来证明长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA的用途。

附图说明

图1为本发明实验各周期各组大鼠血清IL-6的变化图。其中图1(a)为实验第5周末，图1(b)为实验第8周末。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型NCsi组；

图2为本发明实验第8周末各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化图。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组；其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与糖尿病模型组比较。

图3为本发明实验第8周末各组大鼠血清去甲肾上腺素(NE)的变化图。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性(NCsi)对照组；其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与糖尿病模型组比较。

图4为本发明颈上交感神经节细胞泛连接蛋白－1(Pannexin-1)和神经元标志物(NeuN)抗体免疫荧光双标结果图。糖尿病模型组大鼠Pannexin-1表达明显高于正常对照组，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠的Pannexin-1表达降低。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组；

图5为本发明颈上交感神经节细胞胰岛素受体底物-1(IRS-1)IRS1受体和神经元标志物(NeuN)抗体免疫荧光双标结果图。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节IRS1受体表达显著低于正常对照组，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠颈上交感神经节IRS1表达升高。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组；

图6为本发明实时定量PCR检测颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972的表达变化图。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972表达明显高于正常对照组，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠的颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972表达降低。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型组+乱序的小干扰RNA阴性对照组；其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与糖尿病模型组比较。

图7为本发明实时定量PCR检测颈上交感神经节Pannexin-1的mRNA表达变化图。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节Pannexin-1的mRNA表达明显高于正常对照组，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠的颈上交感神经节Pannexin-1的mRNA表达降低。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组；其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与糖尿病模型组比较。

图8为本发明实时定量PCR检测颈上交感神经节IRS1的mRNA表达变化图。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节IRS1的mRNA表达明显高于正常对照组，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠的颈上交感神经节IRS1的mRNA表达降低。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组；其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与糖尿病模型组比较。

图9为本发明蛋白印迹技术检测颈上交感神经节Pannexin-1蛋白表达变化图。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节Pannexin-1蛋白表达明显高于正常对照组，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠的颈上交感神经节Pannexin-1蛋白表达降低。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组；图9(a)为蛋白印迹实验结果图，图9(b)为实验数据分析比较柱状图，其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与糖尿病模型组比较。

图10为本发明蛋白印迹技术检测颈上交感神经节IRS1及p-IRSser302蛋白表达变化图。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节IRS1蛋白表达明显低于正常对照组，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠的颈上交感神经节IRS1蛋白表达升高。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节p-IRSser302蛋白表达明显高于正常对照组，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠的颈上交感神经节p-IRSser302蛋白表达降低。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组；图10(a)为蛋白印迹实验结果图，图10(b)为实验数据分析比较柱状图，其中^**p<0.01表示和正常组比较，其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与糖尿病模型组比较。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1。

用本技术领域公知的方法，制成适用于糖尿病并发心脏自主神经疾病治疗的口服或注射的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA制剂。

实施例2。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及交感神经相关疾病治疗的口服或注射的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA制剂。

实施例3。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及Pannexin-1功能异常介导疾病治疗的口服或注射的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA制剂。

实施例4。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及IRS1功能异常介导疾病治疗的口服或注射的长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA制剂。

总之，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸以口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型药物进行上述疾病防治。

为了更好地理解本发明的实质，下面以长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸对糖尿病并发心交感自主神经疾病治疗作用研究的实验和结果来证明长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰核糖核酸的用途。

一、材料和方法

1.建立2型糖尿病大鼠模型。

SD雄性大鼠(体重180g左右)，分笼饲养，每笼饲养7只，温度20-25℃，相对湿度40％-70％，昼夜明暗交替12h/12h，自由饮水，适应1周后剪尾采血测空腹血糖和餐后2小时血糖。将大鼠随机分成正常对照组(15只)和模型处理组(60只)，正常对照组始终喂养普通饲料(由南昌大学医学院实验动物科学部提供)，模型组喂养高糖高脂饲料(基础饲料66.5％，蔗糖20％，猪油10％，胆固醇2.5％，胆酸钠1％，加水做成条状放在恒温鼓风干燥箱中80℃干烤3小时)。第5周末(即模型组喂高糖高脂饲料4周后)，所有大鼠剪尾采血测空腹血糖和餐后2小时血糖。模型组大鼠空腹腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg(临用前将STZ溶解于4℃冰箱预冷的pH为4.2的0.1mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液中，配制成2.5g/L的STZ溶液)。第6周末，空腹血糖＜7.8mmol/L且餐后2小时血糖＜11.1mmol/L的造模组个体再空腹腹腔注射STZ30mg/kg一次，第7周末测空腹血糖和餐后2小时血糖，以空腹血糖＞7.8mmol/L或餐后2小时血糖＞11.1mmol/L确定糖尿病造模成功。

2.糖尿病大鼠长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA实验及动物分组。

长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA(siRNA)序列由Invitrogen(Carlsbad,CA)公司提供，靶序列为5’-GAATGTTGGTCATATCAAA-3’；阴性对照scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸,NCsi)购至Invitrogen(Carlsbad,CA)公司。在体转染试剂由Entranster^TM公司提供。根据Entranster^TM在体转染说明书，实验第7周末对糖尿病造模成功的大鼠进行长非编码核糖核酸NONRATT021972-siRNA在体小干扰实验。320μLsiRNA(长非编码核糖核酸NONRATT021972si)或阴性对照siRNA(NCsi)溶液通过舌下静脉注射糖尿病模型大鼠体内，大鼠随机分为正常对照组(control)、糖尿病大鼠模型组(DM)、糖尿病大鼠模型长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组(长非编码核糖核酸NONRATT021972si)和糖尿病大鼠模型小干扰RNA对照处理组(NCsi)，其中正常对照组(control)和糖尿病大鼠模型组(DM)舌下静脉注射生理盐水320μL。实验期间，大鼠自由饮水，除正常对照组外其余各组均以高糖高脂饲料继续喂养1周。分别于第5周末和第8周末，测量各组大鼠相关指标并取血样，第8周末实验结束后采集标本。

3.药物与试剂。

动物体内转染试剂(Engreen^TM公司)、长非编码核糖核酸NONRATT021972-siRNA、scrambledsiRNA(Invitrogen公司)、β-actin、长非编码核糖核酸NONRATT021972、Pannexin-1和IRS1引物(GenerayBiotech公司)、兔抗Pannexin-1抗体(Abcam公司)、兔抗IRS1抗体(UpstateBiotechnology公司)、兔抗p-IRS1ser302抗体(Santacruz公司)、链脲佐菌素(Sigma公司)、大鼠肿瘤坏死因子-α定量酶联检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)、大鼠白细胞介素-6定量酶联检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)、大鼠去甲肾上腺素酶联检测试剂盒(上海森熊科技实业有限公司)。

4.主要仪器。

罗康全活力型血糖仪(德国罗氏公司)；Softron智能无创血压计-鼠记测仪(Gene&I公司)；消毒纱布、手巾、棉签等，碘酒及75％酒精，手术器械包：剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线、有齿镊等。

5.大鼠血糖的测定。

各组大鼠分别于适应1周、第5周末和第8周末剪尾采血，采用罗康全活力型血糖仪测定禁食12h后的空腹血糖以及禁食12h并按葡萄糖2g/kg剂量灌胃2h后的餐后血糖。

6.大鼠血压、心率测定。

各组大鼠分别于适应1周、第5周末和第8周末使用BP-2006A智能无创血压计监测正常对照组(control)、糖尿病大鼠模型组(DM)、糖尿病大鼠模型长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组(长非编码核糖核酸NONRATT021972si)和糖尿病大鼠模型小干扰RNA对照处理组(NCsi)大鼠血压和心率的变化。在安静的监测室，将清醒状态的大鼠放入含鼠网的鼠袋中，尾巴置于鼠袋外面，鼠袋温度控制在37℃，待大鼠安静后，加压感应器套在鼠尾根部三分之一处，启动无创智能血压计，进入监测状态，点击开始键可自动测量各组大鼠血压和心率的变化。同一大鼠在相同时间内重复测量三次血压和心率，取其平均值，每次操作由同一人完成。

7.大鼠心电图和心率变异性(heartratevariability,HRV)指标的测定。

腹腔注射10％水合氯醛(0.3ml/100g)进行麻醉。麻醉后大鼠取仰卧位，固定于手术台，心电图电极固定在双上肢和右下肢皮下，前胸备皮、消毒，使用Medlab生物信号采集处理系统记录标准II导联的心电图。将采集的心电信号用心率变异性分析软件分析，采用短时程5min频域分析法，取5min心电图作HRV分析。HRV频域分析法有关参数：

总频谱(Totalpower,TP)：为24小时内NN间期变化的总功率，是功率频度密度曲线函数在0Hz-0.4Hz范围内的积分值，也就是功率频谱密度曲线在0Hz-0.4Hz范围内与横轴所夹的面积，单位为ms²。

极低频(Verylowfrequency,VLF)：是功率谱密度曲线分解成的极低频分量曲线(中心频率位于0.003Hz-0.04Hz)的积分值，也就是极低频分量曲线与横轴所夹的面积，单位为ms²。

低频(Lowfrequency,LF)：为低频分量曲线(中心频率位于0.04Hz-0.15Hz)的积分值，也就是低频分量曲线与横轴所夹的面积，单位为ms²。

高频(Highfrequency,HF)：为高频分量曲线(中心频率位于0.15Hz-0.4Hz)的积分值，也就是高频分量曲线与横轴所夹面积，单位为ms²。

低频/高频(LF/HF)：低频与高频功率的比值，说明交感神经张力与迷走神经张力的平衡。

7.动脉血压压力反射敏感性(baroreflexsensitivity,BRS)。

用Harverd输液泵静脉注射去氧肾上腺素(5mg/kg)，升高血压(刺激动脉压力感受器)，心率则反射性减慢。连续监测各组大鼠血压及心电图R-R间期(心动周期)变化，以动脉收缩血压升高变化为横座标，跟随血压变化的反射性延长的R-R间期为纵座标，对两者进行直线回归分析。一般两者之间呈直线关系，回归直线的斜率即为动脉压力感受性反射敏感性。其意义为动脉血压每升高0.13kPa(1mmHg)时，对应反射性R-R间期延长的毫秒数，以ms/mmHg表示。斜率大，提示迷走神经反射性增强；斜率小，提示迷走神经反射性减弱，反映交感神经活性增强。

8.酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法实验。

1)样本准备：第5周末和第8周末，收集血清，-80℃保存；

2)实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温(20-25℃)；

3)取出所需数量的板条，其余密封放回4℃；

4)建立标准曲线：标准孔8孔，设3复孔，每孔中各加入样品稀释液100μl，第一孔加标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl弃去，使之体积均为100μl。第八孔为空白对照；

5)加样：待测品孔中每孔各加入待测样品100μl；

6)将反应板置37℃120分钟；

7)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；

8)每孔中加入第一抗体工作液50μl；

9)将反应板充分混匀后置37℃60分钟；

10)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；

11)每孔加酶标抗体工作液100μl；

12)将反应板置37℃60分钟；

13)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；

14)每孔加入底物液100μl，置37℃暗处反应5分钟；

15)每孔加入50μl终止液混匀；

16)在450nm处侧吸光值(应尽快，时间过长可能导致本底偏高)。

9.氧化应激指标的测定。

1)丙二醛(MDA)测定：向有盖离心管(5ml)分别加入0.05ml标准品(10nmol/ml)、无水乙醇和样品，之后加等量试剂一，混匀；加试剂二1.5ml、试剂三0.5ml，旋涡混匀器混匀，95℃水浴40分钟，取出后流水冷却，然后3500转/分，离心10分钟。取上清lml，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。计算公式：MDA含量(nmol/ml)＝(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度×样本测试前稀释倍数。

2)总一氧化氮合酶(T-NOS)活力测定：测定管加蒸馏水0.1ml和样品0.03ml，对照管加蒸馏水0.13ml，摇匀；测定管和对照管均加入试剂一0.2ml，试剂二0.01ml，试剂三0.1ml，旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴15分钟；每管加入试剂试剂四0.1ml和试剂五2ml，旋涡混匀器充分混匀，于波长530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。计算公式：T-NOS活力(U/m1)＝(测定管吸光度-空白管吸光度)/呈色物纳摩尔消光系数×反应体系总体积/取样量×1/比色光径×反应时间×1/1000，呈色物纳摩尔消光系数取38.3×10^-6。

3)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性测定：测定管和对照管分别1mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)0.2ml，试剂一0.1ml，37℃预温5分钟；加入样品/蒸馏水0.2ml，37℃准确反应5分钟；试剂二2ml，用旋涡混匀器充分混匀，4000转/分，离心10分钟，取上清1ml做显色反应。空白管加还原型谷胱甘肽标准品溶剂应用液1ml、标准管加20μmol/L还原型谷胱甘肽标准液1ml、对照管和测定管均加上清液1ml，以上四管均加入试剂三1ml，试剂四0.25ml，试剂五0.05ml，混匀，室温放置15分钟，于波长412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管吸光度值。计算公式：GSH-PX活力(U/m1)＝(对照管吸光度-测定管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度×稀释倍数×样本测试前稀释倍数。标准管浓度取20μmol/L，稀释倍数为6。

10.免疫荧光双标法。

1)取出大鼠颈上交感神经节的冰冻切片恢复室温后，用0.1MPBS洗3次，5min/次，4％多聚甲醛室温预固定15min；

2)0.1MPBS洗3次，5min/次；山羊血清封闭液37℃孵育1h；

3)加入兔来源1:100稀释的缝隙连接半通道蛋白1(Pannexin-1)、胰岛素受体底物1(IRS1)一抗和小鼠来源1:100稀释的NeuN一抗，37℃水浴孵育2h；

4)0.1MPBS洗3次，5min/次；

5)加入羊抗兔来源的FITC标记1:200稀释的二抗和羊抗小鼠来源的TRITC标记1:200稀释的二抗，避光37℃水浴孵育45min，避光；

6)0.1MPBS洗3次，5min/次；

7)荧光封片剂封片，避光。荧光显微镜下拍照，分析结果。

11.实时定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)技术。

1)总RNA的提取。

a)第8周末实验结束时，取出颈上交感神经节放入用DEPC处理过的PBS中清洗；

b)再分别转移到用DEPC处理过的匀浆器，加入1ml的Trizol充分研磨；

c)将匀浆样品在室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；

d)每管加入0.2ml氯仿充分混匀后，冰浴15分钟；

e)4℃离心12000g×15min,可见管中的液体分为上(无色液相含总RNA)、中(白色乳状含蛋白质)和下(红色含DNA)三相；

f)将上层液相移入另一经DEPC水处理的1.5ml的EP管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀数次，置-20℃约20分钟，沉淀RNA；

g)4℃离心12000g×15min，弃上清，管底可见少许白色沉淀物(为RNA)；

h)每管加75％乙醇1ml，充分洗涤RNA沉淀，4℃离心10000g×15min，弃上清×2次；

i)弃上清液，静置10分钟，使之干燥，加50μl无RNase水重悬沉淀，取20μlRNA用于定量和纯度检测，余下-20℃保存。

2)总RNA的鉴定。

a)分光光度仪检测(RNA浓度、纯度测定)：用0.1％DEPC水给比色仪调零，取2μlRNA样品，用98μl0.1％DEPC水稀释50倍后，测RNA样品的OD260nm和OD280nm，按以下公式计算RNA浓度和纯度：

RNA浓度(μg/μl)＝OD260nm×50×0.04

RNA纯度＝OD260nm/OD280nm

比值接近或大于1.8，说明RNA纯度较高，没有蛋白质的残余；比值小于1.6，说明RNA样品中有蛋白质、酚等污染；

b)甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量：配制1％甲醛变性胶→取RNA样品5μl与RNA上样缓冲液1：1混匀后，65℃水浴变性5min→在1×MOPS电泳缓冲液中电泳至满意为止(50V)，紫外灯下观察，可见28S、18S、5S三条带。

3)实时定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)。

a)cDNA合成：建立20μl逆转录反应体系：5×Reactionmix4μl，Maximaenzymemix2μl，TemplateRNA1μl(5μg)，Nuclease-freewater13μl，PCR仪逆转录30min；

b)引物序列：

NONRATT021972>上游：>5’-GATTAGGAGCAGTACGGTTCA-3’；>下游：>5’-TTGTTTGTTTGTTTGGGACA-3’；>Pannexin-1>上游：>5’-CCCTCTGGTCTGCTCTGTGTC-3’；>下游：>5’-GGGGGTCCAGGTCCGTCTCT-3’；>

IRS1>上游：>5’-CTCTACACCCGAGACGAACAC-3’；>下游：>5’-TGGGCCTTTGCCCGATTATG-3’；>β-actin>上游：>5’-GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT-3’；>下游：>5’-CTTCTGCATCCTGTCAGCAA-3’；>

c)Real-timePCR检测，20μl体系：PowerGreenPCRMasterMix10μl，10μM上下游引物各1μl，cDNA1μl，Nuclease-freewater定容至20μl。混匀，置于ABI7500PCR仪，采用SYBR-green法进行测定。反应条件为95℃10min、95℃15sec、60℃1min、40循环。并通过分析产物的溶解曲线来确定扩增的特异性。

12.蛋白印迹。

1)蛋白样品制备。

a)取各组大鼠颈上交感神经节放入预冷的0.1MPBS洗3次；

b)将组织加入400μl含PMSF去污剂裂液的匀浆器中，冰上研磨，使组织尽量碾碎，冰上裂解1h；

c)将裂解液移至1.5mlEP管中，4℃，12000rpm，离心10min，取上清于0.5mlEP管中，加入5×loadingbuffer，再加10％DTT，沸水煮5min，分装，并置于-20℃保存。

2)SDS-PAGE凝胶。

a)5％或10％分离胶10ml：

双蒸水>5.7ml(5％分离胶)4ml(10％分离胶)；>30％丙烯酰胺>3.3ml(10％分离胶)；1.6ml(5％分离胶)>1.5mol/L Tris(pH 8.8)>2.5ml>10％SDS>100μl>10％过硫酸铵>100μl>TEMED>4μl>

b)制备5％浓缩胶：

双蒸水>2.7ml>30％丙烯酰胺>0.67ml>1.0mol/L Tris(pH 6.8)>0.5ml>10％SDS>40μl>10％AP>40μl>TEMED>4μl>

3)上样及进行SDS-PAGE蛋白分离电泳。

a)加入5×凝胶上样缓冲液，再加10％DTT，95℃煮5min，使蛋白变性，电泳前进行上样；

b)进行SDS-PAGE蛋白分离电泳，浓缩胶90V，30min，分离胶120V，50min，待溴酚蓝迁移至分离胶底部，停止电泳。

4)转膜：稳流300mA转膜90min。

5)免疫学检测。

a)转膜后，用TBST洗膜10min；

b)封闭：用5％脱脂奶粉封闭液(TBST配制)，室温封闭，平摇1h；

c)加入兔来源的Pannexin-1、IRS1、p-IRS1ser302一抗(1:1000)或小鼠来源的β-actin一抗(1:1000)：用封闭液稀释抗体至工作浓度，总体积为3～5ml。4℃过夜；

d)TBST洗膜3次，10min/次，平摇；加入山羊抗兔来源的二抗或者山羊抗小鼠来源的二抗：将二抗工作液(用封闭液以1:5000稀释)，室温平摇孵育1h；

e)TBST洗膜4次，10min/次，平摇；免疫复合物的检测：膜在ECL中反应5min，暗室曝光、显影和定影。

6)光密度分析：通过Image-ProPlus图像分析系统分析目的条带在X光胶片测得的光密度值，以各组β-actin条带的OD值标化其蛋白的表达量。

13.统计方法。

实验数据用Excel及SPSS11.5统计软件进行统计分析，各实验组数据以均数±标准误表示，各组之间差异性采用方差分析，组间比较采用最小显著差法(LSD)，p<0.05为显著性差异。

二、结果。

1.血糖的变化。

实验开始时各组大鼠空腹血糖(FBG)、餐后血糖(PBG)无显著差异(p>0.05)，数据末列出。糖尿病模型组大鼠第5周末(经高糖高脂喂养四周)空腹血糖、餐后血糖与正常对照组相比有所升高但无显著统计学差异(p>0.05)(见表1)。第8周末(即成模且小干扰RNA处理一周后)糖尿病模型组大鼠空腹血糖和餐后血糖均高于正常对照组(p<0.01)；与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠的空腹血糖和餐后血糖均有所降低(p<0.05)。小干扰RNA对照组大鼠空腹血糖和餐后血糖与糖尿病模型组相比无显著差异(p>0.05)，但高于正常对照组(p<0.01)(见表1)。

表1实验第5周末及第8周末各组大鼠血糖的变化

每组值为均数±标准差；n为每组大鼠数量；^**p<0.01与对照组比较，^#p<0.05和^##p<0.01与糖尿病模型组和糖尿病模型加乱序小干扰RNA阴性对照组比较。

2.血压的变化。

实验开始时各组大鼠收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)比较差异无统一计学意义(p>0.05)，数据末列出。糖尿病模型组大鼠第5周末(经高糖高脂喂养四周)收缩压、舒张压和平均动脉压与正常对照组相比有所升高但无显著统计学差异(p>0.05)(见表2)。第8周末(即成模且小干扰RNA处理一周后)糖尿病模型组大鼠收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)均高于正常对照组(p<0.05)；与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)降低(p<0.05)。小干扰RNA对照组大鼠收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)与糖尿病模型组相比无显著差异(p>0.05)，但高于正常对照组(p<0.05)(见表3)。

表2实验第5周末各组大鼠血压的变化

每组值为均数±标准差；n为每组大鼠数量。

表3实验第8周末各组大鼠血压的变化

每组值为均数±标准差；n为每组大鼠数量；^*p<0.05与对照组比较，^#p<0.05与糖尿病模型组和糖尿病模型加乱序小干扰RNA阴性对照组比较。

3.心电图指标的变化。

与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠第5周末(经高糖高脂喂养四周)心率(HR)有所加快，QT间期(QTinterval)有所延长，但无显著统计学差异(p>0.05)(见表4)。第8周末(即成模且小干扰RNA处理一周后)糖尿病模型组大鼠心率高于正常对照组(p<0.01)，QT间期长于正常对照组(p<0.01)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠的心率降低(p<0.01)，QT间期缩短(p<0.01)。小干扰RNA对照组大鼠心率、QT间期与糖尿病模型组相比无显著差异(p>0.05)，但与正常对照组相比，心率加快、QT间期延长(p<0.01)(见表5)。

表4实验第5周末各组大鼠心电图各指标的变化

Valuesaremeans±SEM；nisthenumberoftheratsineachgroup.

表5实验第8周末各组大鼠心电图各指标的变化

每组值为均数±标准差；n为每组大鼠数量；^*p<0.05与对照组比较，^#p<0.05与糖尿病模型组和糖尿病模型加乱序小干扰RNA阴性对照组比较。4.心率变异性。

HRV频域分析结果表明，与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠第5周末(经高糖高脂喂养四周)总功率(TP)、极低频功率(VLF)、低频功率(LF)和高频功率(HF)有所下降，低频功率和高频功率之比(LF/HF)有所升高，但无显著统计学差异(p>0.05)(见表6)。第8周末(即成模且小干扰RNA处理一周后)糖尿病模型组大鼠TP、VLF、LF和HF低于正常对照组(p<0.01)，LF/HF高于正常对照组(p<0.01)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠的TP、VLF、LF和HF升高(p<0.05)，LF/HF降低(p<0.05)。小干扰RNA对照组大鼠TP、VLF、LFHF和LF/HF与糖尿病模型组相比无显著差异(p>0.05)，但与正常对照组存在明显差异(p<0.01)(见表7)。

表6实验第5周末各组大鼠心率变异性的变化

每组值为均数±标准差；n为每组大鼠数量。

表7实验第8周末各组大鼠心率变异性各指标的变化

每组值为均数±标准差；n为每组大鼠数量；^**p<0.01与对照组比较，^#p<0.05和^##p<0.01与糖尿病模型组和糖尿病模型加乱序小干扰RNA阴性对照组比较。5.动脉血压压力敏感性。

与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠第5周末(经高糖高脂喂养四周)动脉血压压力敏感性有所降低，但无显著统计学差异(p>0.05)(见表8)。第8周末(即成模且小干扰RNA处理一周后)糖尿病模型组大鼠动脉血压压力敏感性(BRS)低于正常对照组(p<0.05)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠的动脉血压压力敏感性升高(p<0.05)，但仍低于正常对照组；小干扰RNA对照组大鼠动脉血压压力敏感性(BRS)与糖尿病模型组相比无显著差异(p>0.05)，但明显低于正常对照组(p<0.05)(见表8)。

表8实验第5周末及第8周末各组大鼠动脉血压压力敏感性的变化

5周>8周>对照>-2.43±0.53(n＝5)>-3.76±0.13(n＝10)>糖尿病模型>-2.31±0.32(n＝5)>-1.73±0.21^*(n＝10)>糖尿病模型+NONRATT021972小干扰>-2.25±0.65(n＝5)>-3.20±0.34^#(n＝10)>糖尿病模型+乱序小干扰RNA阴性对照>-2.38±0.53(n＝5)>-1.85±0.22^*(n＝10)>

每组值为均数±标准差；n为每组大鼠数量；^*p<0.05与对照组比较，^#p<0.05与糖尿病模型组和糖尿病模型加乱序小干扰RNA阴性对照组比较。6.大鼠血清白细胞介素-6(IL-6)。

第8周末正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型长非编码核糖核酸NONRATT021972si组和糖尿病模型NCsi组大鼠血清白细胞介素-6的浓度分别为：198.272±17.858pg/ml(n＝10)，765.899±18.904pg/ml(n＝10)，260.345±17.112pg/ml(n＝10)，720.863±18.835pg/ml(n＝10)(图1)。经统计分析，第8周末糖尿病模型组大鼠血清白细胞介素-6含量明显高于正常对照组(p<0.01)；与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠血清白细胞介素-6含量明显降低(p<0.01)。小干扰RNA对照组大鼠血清白细胞介素-6含量与糖尿病模型组相比无显著差异(p>0.05)，但高于正常对照组(p<0.01)。

7.大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。

第8周末正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型长非编码核糖核酸NONRATT021972si组和糖尿病模型NCsi组大鼠血清肿瘤坏死因子-α分别为：176.655±17.854pg/ml(n＝10)，723.370±18.965pg/ml(n＝10)，309.833±17.170pg/ml(n＝10)，698.576±18.891pg/ml(n＝10)(图2)。经统计分析第8周末糖尿病模型组大鼠血清肿瘤坏死因子-α含量明显高于正常对照组(p<0.01)；与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠血清肿瘤坏死因子-α含量明显降低(p<0.01)。小干扰RNA对照组大鼠血清肿瘤坏死因子-α含量与糖尿病模型组相比无显著差异(p>0.05)，但高于正常对照组(p<0.01)。

8.大鼠血清去甲肾上腺素(NE)。

第8周末正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型长非编码核糖核酸NONRATT021972si组和糖尿病模型NCsi组大鼠血清的去甲肾上腺素分别为：68.379±3.685pg/ml(n＝10)，159.422±4.213pg/ml(n＝10)，82.134±2.274pg/ml(n＝10)，148.721±3.532pg/ml(n＝10)(图3)。经统计分析第8周末糖尿病模型组大鼠血清去甲肾上腺素含量明显高于正常对照组(p<0.01)；与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠血清去甲肾上腺素含量明显降低(p<0.01)。小干扰RNA对照组大鼠血清去甲肾上腺素含量与糖尿病模型组相比无显著差异(p>0.05)，但高于正常对照组(p<0.01)。

9.大鼠血清氧化应激指标。

第5周和第8周末正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型长非编码核糖核酸NONRATT021972si组和糖尿病模型NCsi组大鼠血清氧化应激指标MDA、GSH-PX和T-NOS值见表9和表10；经统计分析第5周末各组大鼠血清MDA、GSH-PX和T-NOS含量无显著差异(p>0.05)(见表9)；第8周末(即成模且小干扰RNA一周后)糖尿病模型组大鼠血清MDA高于正常对照组(p<0.01)，GSH-PX和T-NOS低于正常对照组(p<0.05)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠血清MDA降低(p<0.05)，GSH-PX和T-NOS升高(p<0.01)；小干扰RNA对照组大鼠血清MDA、GSH-PX和T-NOS与糖尿病模型组相比无显著差异(p>0.05)，但于正常对照组有显著差异(p<0.05)(见表10)。

表9实验第5周末各组大鼠血清氧化应激指标的变化

每组值为均数±标准差；n为每组大鼠数量。

表10实验第8周末各组大鼠血清氧化应激指标的变化

每组值为均数±标准差；n为每组大鼠数量；^*p<0.05和^**p<0.01与对照组比较，^#p<0.05和^##p<0.01与糖尿病模型组和糖尿病模型加乱序小干扰RNA阴性对照组比较。10.免疫荧光双标。

10.1.颈上交感神经节荧光双标(Pannexin-1和NeuN)。

颈上交感神经节细胞Pannexin-1和神经元标志物(NeuN)抗体免疫荧光双标结果显示颈上交感神经节细胞Pannexin-1和NeuN抗体存在共表达。糖尿病模型组大鼠Pannexin-1表达明显高于正常对照组(n＝5,p<0.05)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠的Pannexin-1表达降低(n＝5,p<0.05)；小干扰RNA对照组大鼠Pannexin-1表达与糖尿病模型组相比无显著差异(n＝5,p>0.05)，但高于正常对照组(n＝5,p<0.05)(图4)。

10.2.颈上交感神经节荧光双标(IRS1和NeuN)。

颈上交感神经节细胞IRS1受体和神经元标志物(NeuN)抗体免疫荧光双标结果显示颈上交感神经节细胞IRS1受体和NeuN抗体存在共表达。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节IRS1受体表达显著低于正常对照组(n＝5,p<0.05)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠颈上交感神经节IRS1表达升高(n＝5,p<0.05)；小干扰RNA对照组大鼠颈上交感神经节IRS1表达与糖尿病模型组相比无显著差异(n＝5,p>0.05)，但低于正常对照组(n＝5,p<0.05)(图5)。

11.实时定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)。

11.1.颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972的表达。

Real-timePCR检测颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972表达水平，以正常对照组长非编码核糖核酸NONRATT021972相对表达量水平为参照，正常对照组、糖尿病模型组、长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组和小干扰RNA对照组颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972表达水平分别为100.0％(n＝5)，255.3±6.9％(n＝5)，89.3±7.1％(n＝5)和245.6±5.2％(n＝5)。结果显示糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972表达显著高于正常对照组(n＝5,p<0.01)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972表达明显下降(n＝5,p<0.01)，干扰效率达到65％左右；小干扰RNA对照组颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972表达与糖尿病模型组相比无显著差异(n＝5,p>0.05)，但高于正常对照组(n＝5,p<0.01)。表明在体长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA实验可有效降低糖尿病大鼠颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972上调表达的水平(图6)。

11.2.颈上交感神经节Pannexin-1mRNA的表达。

Real-timePCR检测颈上交感神经节Pannexin-1mRNA表达水平，以正常对照组Pannexin-1mRNA相对表达量水平为参照，正常对照组、糖尿病模型组、长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组和小干扰RNA对照组大鼠颈上交感神经节Pannexin-1mRNA表达水平分别为100.0％(n＝5)，195.3±7.3％(n＝5)，115.8±7.8％(n＝5)和188.9±6.9％(n＝5)。结果显示糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节Pannexin-1mRNA表达显著高于正常对照组(n＝5,p<0.01)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠颈上交感神经节Pannexin-1mRNA表达明显下降(n＝5,p<0.01)；小干扰RNA对照组大鼠颈上交感神经节Pannexin-1mRNA表达与糖尿病模型组相比无显著差异(n＝5,p>0.05)，但高于正常对照组(n＝5,p<0.01)。表明长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA后可降低糖尿病大鼠颈上交感神经节Pannexin-1mRNA上调表达的水平(图7)。

11.3.颈上交感神经节IRS1mRNA的表达。

Real-timePCR检测颈上交感神经节IRS1mRNA表达水平，以正常对照组IRS1mRNA相对表达量水平为参照，正常对照组、糖尿病模型组、长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组和小干扰RNA对照组大鼠颈上交感神经节IRS1mRNA表达水平分别为100.0％(n＝5)，53.6±8.2％(n＝5)，94.3±4.7％(n＝5)和57.9±4.9％(n＝5)。结果显示糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节IRS1mRNA表达显著低于正常对照组(n＝5,p<0.01)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠颈上交感神经节IRS1mRNA表达明显升高(n＝5,p<0.01)；小干扰RNA对照组大鼠颈上交感神经节IRS1mRNA表达与糖尿病模型组相比无显著差异(n＝5,p>0.05)，但低于正常对照组(n＝5,p<0.01)。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA后可提高糖尿病大鼠颈上交感神经节IRS1mRNA下调表达的水平(图8)。

12.蛋白印迹。

12.1.颈上交感神经节Pannexin-1的蛋白表达。

蛋白印迹结果经β-actin(43KD)标化，以正常对照组颈上交感神经节Pannexin-1蛋白(48KD)表达为参照，颈上交感神经节Pannexin-1蛋白表达的光密度值在正常对照组、糖尿病模型组、长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组和小干扰RNA对照组分别为：100.0％(n＝5)，237.6±7.9％(n＝5)，103.2±5.9％(n＝5)和240.1±8.7％(n＝5)。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节Pannexin-1蛋白表达高于正常对照组(n＝5,p<0.01)。与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠颈上交感神经节Pannexin-1蛋白表达明显下降(n＝5,p<0.01)；小干扰RNA对照组和糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节Pannexin-1蛋白表达无明显差异(n＝5,p>0.05)，但高于正常对照组(n＝5,p<0.01)(图9)。

12.2.颈上交感神经节IRS1及p-IRSser302的蛋白表达。

蛋白印迹结果经β-actin(43KD)标化后，以正常对照组颈上交感神经节IRS1蛋白(180KD)表达为参照，颈上交感神经节蛋白表达的光密度值在正常对照组、糖尿病模型组、长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组和小干扰RNA对照组分别为：100.0％(n＝5)，21.2±2.8％(n＝5)，95.3±5.8％(n＝5)和25.9±1.8％(n＝5)。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节IRS1蛋白表达低于正常对照组(n＝5,p<0.01)；与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠颈上交感神经节IRS1蛋白表达明显升高(n＝5,p<0.01)；小干扰RNA对照组与糖尿病模型组相比大鼠颈上交感神经节IRS1蛋白表达无明显差异(n＝5,p>0.05)，但低于正常对照组(n＝5,p<0.01)(图10)。

蛋白印迹结果经IRS1(180KD)标化后，以正常对照组颈上交感神经节p-IRS1ser302蛋白(180KD)表达为参照，颈上交感神经节的p-IRS1ser302蛋白表达的光密度值在正常对照组、糖尿病模型组、长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组和小干扰RNA对照组分别为：100.0％(n＝5)，308.4±10.8％(n＝5)，103.3±8.8％(n＝5)和325.9±8.9％(n＝5)。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节p-IRS1ser302蛋白的表达高于正常对照组(n＝5,p<0.01)；与糖尿病模型组和小干扰RNA对照组相比，长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA处理组大鼠颈上交感神经节p-IRS1ser302蛋白的表达明显下降(n＝5,p<0.01)；小干扰RNA对照组与糖尿病模型组相比大鼠颈上交感神经节p-IRS1ser302的蛋白表达无明显差异(n＝5,p>0.05)，但高于正常对照组(n＝5,p<0.01)(图10)。

申请人实验室的研究发现通过高通量基因芯片结果显示颈上交感神经节的IRS1和Pannexin-1分别是颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972基因敲降后的显著上调和下调基因。经进一步功能学实验验证表明糖尿病颈上交感神经节长非编码核糖核酸NONRATT021972高表达可调节颈上交感神经节Pannexin-1和IRS1等与神经元细胞生长及炎性相关基因的表达，参与糖尿病心脏自主神经功能损伤介导的病理变化。长非编码核糖核酸NONRATT021972小干扰RNA通过降低颈上交感神经节Pannexin-1和IRS1表达，从而减轻糖尿病心脏自主功能的损伤，对糖尿病心脏自主功能的异常产生防治作用。