公开/公告号CN105274090A
专利类型发明专利
公开/公告日2016-01-27
原文格式PDF
申请/专利权人 中国科学院北京基因组研究所;
申请/专利号CN201510818823.X
申请日2015-11-23
分类号
代理机构北京中政联科专利代理事务所(普通合伙);
代理人刘玉玲
地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院104号楼
入库时间 2023-12-18 13:43:06
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-01-18
授权
授权
2016-02-24
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/10 申请日:20151123
实质审查的生效
2016-01-27
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种石蜡DNA纯化方法，以及该方法在基因组学中的应用，尤其是涉及从石 蜡包埋的人类组织样本中纯化DNA的方法，属于遗传工程领域。
背景技术
基因组学的快速发展为精准医学带来契机。以肿瘤个体化治疗为例，医院病理科保存的 肿瘤石蜡标本是寻找药物靶点，实现癌症患者精准医疗的前提。然而，石蜡标本在制作过程 中所经历的处理过程(如福尔马林浸泡、石蜡包埋等)是导致石蜡DNA高度降解的主要原因。 降解后的石蜡DNA只能有限度的应用于肿瘤基因组学研究----DNA质量差(260/280比值偏 高或偏低，杂质多等)，DNA需要量大(3-10微克)，PCR循环次数大(12-18)，二代测序 后接受比例低(20-50％)(W.N,等,High-throughputdetectionofactionablegenomic alterationsinclinicaltumor,CancerDiscov2(2012)82-93.以及G.H,等， Genome-scaleDNAmethylationmappingofclinicalsamplesatsingle-nucleotide resolution,NatMethods7(2010)133-136.)。这些因素极大的阻碍了肿瘤精准医学的发 展。因此，非常有必要针对石蜡样本DNA提取的流程和纯化进行优化，为实现基因组学助力 精准医学提供充裕的材料基础。
医院病理科石蜡包埋肿瘤组织的处理步骤如下：1、固定；2、水洗；3、脱水；4、透明； 5、浸蜡；6、包埋；7、切片。病理科大夫根据石蜡切片来源的HE染色、免疫组化、免疫荧光 等最终判断疾病的性质和程度。在这个一系列的处理过程中，包埋在石蜡块中的肿瘤组织DNA 不可避免的经历了多重损伤；这也是石蜡DNA之所以高度降解的根本原因。
现已有一些文献报道了石蜡样本DNA提取的方案，一般是基于硅吸附的提取流程。在我们 前期的摸索阶段，发现这些方案提取的石蜡DNA存在产量低，质量差的普遍特点(Fassunke,J., etal.,Utilityofdifferentmassiveparallelsequencingplatformsformutation profilinginclinicalsamplesandidentificationofpitfallsusingFFPEtissue.Int JMolMed,2015)。目前，尚未有针对石蜡切片制作全流程的针对性方案来提高DNA提取的 产量和质量。因而，我们在后续的设计策略上着重全面考虑肿瘤石蜡样本所经历的制片过程， 针对性的解除或降低这些过程对DNA的降解，从而达到提高石蜡样本DNA产量和质量的最终目 的。
发明内容
本发明的目的是提供一种石蜡包埋样本中的DNA提纯方案，使其适用于大规模基因组学 研究，为实现肿瘤患者的精准医学奠定材料基础。
为此，本发明提供以下技术方案：
一种石蜡包埋样本中的DNA提纯方法，所述方法包括(1)对样本进行脱蜡；(2)去除 样本中的甲醛；(3)细胞裂解；(4)提取DNA；(5)去除DNA与蛋白质的粘连；(6)纯 化DNA，其中，所述步骤(1)包括用二甲苯对样本进行脱蜡。
优选的，所述步骤(1)中，重复多次用二甲苯对样本进行脱蜡。
更优选的，二甲苯对样本进行2-3次脱蜡。
优选的，所述步骤(2)中包括使用硼氢化钠将甲醛还原为甲醇。
更优选的，所述硼氢化钠的浓度为0.1-1.0M。
优选的，所述步骤(5)中包括使用去交联剂以去除DNA与蛋白质的粘连。
更优选的，所述去交联剂包括但不仅限于：SDS和NaHCO3。
优选的，所述方法步骤(5)中还包括联合使用蛋白酶K以去除DNA与蛋白质的粘连。
更优选的，所述蛋白酶K添加量为20-40μl。更优选为，蛋白酶K在60-65°下水浴。
本发明还提供一种上述任一方法在基因组学中的应用。
使用本发明的方法针对石蜡包埋的DNA可能遭受的束缚和损伤，进行了相应的改善。我 们的策略：基于石蜡标本制作流程中DNA受损点，针对性地设计相应方案。利用本发明的方 法制备得到的DNA样本接近新鲜样本的基因组表现。具体而言，本发明的技术效果是：1、通 过增加二甲苯脱蜡的次数，减少石蜡的含量，从而减少石蜡对DNA的损伤和束缚；2、用硼氢 化钠将甲醛还原为甲醇，并蒸发，解除了甲醛对细胞结构的固定，减少甲醛对细胞的约束， 从而提高石蜡DNA的产量；3、在优选的方案中，使用去交联溶液，减少初提DNA与蛋白的交 联，彻底释放DNA，提高石蜡DNA质量；4、联合加大蛋白酶K用量，提高水浴温度，促进蛋 白降解，减少对DNA的污染。通过多方案、长时间的优化和改进，我们提取的石蜡标本DNA 的基因组学表现明显强于已有方案，已非常接近于新鲜样本的基因组学表现。在同等起始石 蜡材料和同时提取流程下，我们的方案能提取数量更大，质量更高的石蜡DNA。更为重要的 是，后续基因组学应用进一步证实了这些石蜡DNA的测序质量堪比新鲜样本。为大规模开展 肿瘤患者的精准医学铺垫了材料基石。
附图说明
图1实施例1的DNA电泳结果图；
图2：实施例2的DNA电泳结果图；
图3：实施例3的DNA电泳结果图；
图4：实施例4的基因组测序质量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。可以理解的是，在此描述 的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范 围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能 够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物 被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
本发明的实施例涉及表1所示的试剂盒
表1：试剂盒信息
实施例1
1.将肾癌石蜡样本(石蜡屑)室温(20-25°)放置2小时。
2.称量≤25mg石蜡屑组织，放入2mlEP管。
3.加入1200ul二甲苯；震荡混匀10秒；放旋转仪10分钟，室温。
4.离心，10000G,70秒,室温。
5.弃上清。
6.重复步骤3-5一次。
7.加入1200ul100％乙醇，震荡混匀15秒。
8.离心，11000G,70秒,室温。
9.弃上清(不要移除任何沉淀)。
10.重复步骤7-9一次。
11.37°水浴2mlEP管30分钟。
12.加100ul0.1M，0.2M，0.5M或者1.0M硼氢化钠溶液(分别设为第2,3,4,5组)。
13.50°水浴2mlEP管30分钟。(对照组不添加硼氢化钠，无步骤12和13，设定为 第1组)
14.加180ulATL,40ul蛋白酶K；震荡混匀20秒。
15.61.5°水浴48-72小时，至液体透明(期间取出EP管并震荡3-5次)。
16.加200ulAL，震荡混匀20秒。
17.70°水浴10分钟。
18.加200ul无水乙醇，震荡混匀20秒，稍离心。
19.将EP管内所有混合物转移至QIAampMinispincolumn(套在2ml收集管)。
20.离心，6000g,1分钟；弃流出液，换2ml收集管。
21.加500ulAW1；离心，7000g,1分钟；弃流出液，换2ml收集管。
22.加500ulAW2；离心，8000g,1分钟；弃流出液，换2ml收集管。
23.离心，9000g,1分钟；弃流出液。
24.柱子开盖，室温放置10分钟；之后柱子放入新1.5mlEP管。
25.加入50ul的60°预热无核酸酶水，室温1分钟。
26.离心，12000g,1分钟。
27.重复步奏25-26一次；得到100ul含DNA的洗脱液。
28.初步定量：用NanoDrop和1％凝胶电泳图(见图1)。如图1所示，实验组2-5的 DNA条带明显多于对照组1，浓度也高于对照组。DNA定量结果见表2。如表2所示， 添加NaBH4的实验组(包括第2-5组)得到的DNA浓度明显高于对照组，有显著的统 计学差异，并且各个实验组得到的DNA质量也明显优于对照组。
表2：对照组和实验组DNA定量结果
实施例2
1.将肾癌石蜡样本(石蜡屑)室温(20-25°)放置2小时。
2.称量≤25mg石蜡屑组织，放入2mlEP管。
3.加入1200ul二甲苯；震荡混匀15秒；放旋转仪10分钟，室温。
4.离心，10000G,70秒,室温。
5.弃上清。
6.重复步骤3-5二次。
7.加入1200ul100％乙醇，震荡混匀15秒。
8.离心，11000G,70秒,室温。
9.弃上清(不要移除任何沉淀)。
10.重复步骤7-9一次。
11.37°水浴2mlEP管30分钟。
12.加入100ul0.2M硼氢化钠溶液。
13.50°水浴2mlEP管30分钟。
14.加180ulATL,40ul蛋白酶K；震荡混匀20秒。
15.61.5°水浴48-72小时，至液体透明(期间取出EP管并震荡3-5次)。
16.加200ulAL，震荡混匀20秒。
17.70°水浴10分钟。
18.加200ul无水乙醇，震荡混匀20秒，稍离心。
19.将EP管内所有混合物转移至QIAampMinispincolumn(套在2ml收集管)。
20.离心，6000g,1分钟；弃流出液，换2ml收集管。
21.加500ulAW1；离心，7000g,1分钟；弃流出液，换2ml收集管。
22.加500ulAW2；离心，8000g,1分钟；弃流出液，换2ml收集管。
23.离心，9000g,1分钟；弃流出液。
24.柱子开盖，室温放置10分钟；之后柱子放入新1.5mlEP管。
25.加入50ul的60°预热无核酸酶水，室温1分钟。
26.离心，12000g,1分钟。
27.重复步奏25-26一次；得到100ul含DNA的洗脱液。
28.初步定量：用NanoDrop和Qubit。
29.加入10ul5M氯化钠溶液，震荡混匀20秒。
30.加90ul复合溶液(1％SDS，100mMNaHCO3)，震荡混匀20秒
31.水浴80°，1小时。
32.加蛋白酶K40ul或者20ul(分别设定为第2和3组)。
33.水浴60°，48小时。(对照组没有步骤30-33，设定为第1组)。
34.加3-4倍体积ChIPDNABindingBuffer，震荡混匀20秒。
35.将EP管内容物转移至Zymo-SpinTMIC-XLColumn(ZymoResearch).
36.离心，6000g,30秒；弃流出物。
37.加200ulDNAWashBuffer.离心，7000g,30秒；弃流出物。重复2次。
38.柱子开盖，室温5分钟；之后柱子放入新1.5mlEP管。
39.加入25ul的60°预热无核酸酶水，室温1分钟。
40.离心，12000g,1分钟。
41.重复步骤39-40一次；得到50ul最终纯化的DNA。
42.定量：用Qubit和1％凝胶电泳图(参见图2)；如图2所示，实验组2-3的DNA 条带明显多于对照组1，浓度也高于对照组。备后续基因组学应用。DNA定量结果见表 3。如表3所示，各个实验组和对照组相比得到的DNA浓度明显高，两者具有统计学的 显著差异。
表3：对照组和实验组DNA定量结果
实施例3
1.肝癌、淋巴结、前列腺癌、前列腺增生样本(石蜡屑)(分别设定为实验组1-4)室 温(20-25°)放置2小时。
2.称量≤25mg石蜡屑组织，放入2mlEP管。
3.加入1200ul二甲苯；震荡混匀15秒；放旋转仪10分钟，室温。
4.离心，10000G,70秒,室温。
5.弃上清。
6.重复步骤3-5一次。
7.加入1200ul100％乙醇，震荡混匀15秒。
8.离心，11000G,70秒,室温。
9.弃上清(不要移除任何沉淀)。
10.重复步骤7-9一次。
11.37°水浴2mlEP管30分钟。
12.加入100ul0.2M硼氢化钠溶液。
13.50°水浴2mlEP管30分钟。
14.加180ulATL,40ul蛋白酶K；震荡混匀20秒。
15.61.5°水浴48-72小时，至液体透明(期间取出EP管并震荡3-5次)。
16.加200ulAL，震荡混匀20秒。
17.70°水浴10分钟。
18.加200ul无水乙醇，震荡混匀20秒，稍离心。
19.将EP管内所有混合物转移至QIAampMinispincolumn(套在2ml收集管)。
20.离心，6000g,1分钟；弃流出液，换2ml收集管。
21.加500ulAW1；离心，7000g,1分钟；弃流出液，换2ml收集管。
22.加500ulAW2；离心，8000g,1分钟；弃流出液，换2ml收集管。
23.离心，9000g,1分钟；弃流出液。
24.柱子开盖，室温放置10分钟；之后柱子放入新1.5mlEP管。
25.加入50ul的60°预热无核酸酶水，室温1分钟。
26.离心，12000g,1分钟。
27.重复步奏25-26一次；得到100ul含DNA的洗脱液。
28.初步定量：用NanoDrop和Qubit。
29.加入10ul5M氯化钠溶液，震荡混匀20秒。
30.加90ul复合溶液(1％SDS，100mMNaHCO3)，震荡混匀20秒。
31.水浴80°，1小时。
32.加3-4倍体积ChIPDNABindingBuffer，震荡混匀20秒。
33.将EP管内容物转移至Zymo-SpinTMIC-XLColumn(ZymoResearch).
34.离心，6000g,30秒；弃流出物。
35.加200ulDNAWashBuffer.离心，7000g,30秒；弃流出物。重复2次。
36.柱子开盖，室温5分钟；之后柱子放入新1.5mlEP管。
37.加入25ul的60°预热无核酸酶水，室温1分钟。
38.离心，12000g,1分钟。
39.重复步骤37-38一次；得到50ul最终纯化的DNA。
40.定量：用Qubit和1％凝胶电泳图(参见图3)；如图3所示，使用本发明的方法， 添加硼氢化钠和去交联剂后，同样适用于其他的组织样本，提取的DNA条带都非常多， 浓度也高。备后续基因组学应用。DNA定量结果见表4。如表4所示，各个样本的DNA 浓度都非常高。
表4：各个组织样本DNA定量结果
同时，发明还单独以肝癌组织为例，比较在不使用去交联剂(即没有本实施例的步骤 30-31，设为对照组，第1组)和使用交联剂(即本实施例的上述方法，设为实验组， 第2组)的情况下的DNA纯化效果，结果如表5所示：实验组的DNA浓度明显高于对照组， 两者具有统计学的显著差异。
表5：对照组和实验组DNA定量结果
实施例4石蜡DNA全基因组建库
根据实施例2提纯化的石蜡DNA，我们开始全基因组建库(依据NEBUltraTMDNA LibraryPrepKitfor#E7370L)。在Illunima公司的Hiseq-2000平台上进行测 序。关键测序质量参数见图4：如图4所示，A图：新鲜样本DNA测序后>90％的reads碱基质量高 于30(碱基质量范围0-40；越高越好)。B图：石蜡样本DNA(我们改进的方法)测序后>80％ 的reads碱基质量高于30。C图：石蜡样本DNA测序后仅40％的reads碱基质量高于30。如表6所 示，我们的方法得到的石蜡样本B组的MappingB比例高达70-85％，接近于A组新鲜样本。
表6：各种样本的Mapping比例
以上结果表明，用我们改进的方案能极大提高石蜡DNA的测序质量，接近于新鲜样本，使 之完全适应于肿瘤患者的精准医学需要。
机译： 一种分离和纯化具有对蛇毒腺（bpps），特别是贾拉卡双峰植物分泌的或具有血管扩张和抗高血压作用的内源性（evasins）分泌的血管紧张素转化酶羧基位点具有特异性的血管肽酶抑制肽的方法;确定蛇毒（bpps）或内源性（evasin）毒液分泌的抑制剂肽的淀粉序列的过程;通过从蛇组织中表达的这些分子的前体中减去cdna来确定bpps氨基酸序列的过程，尤其是杂种植物。通过从在蛇组织中表达的这些分子的前体推导cdna来确定evasins氨基酸序列的过程，特别是在蛇和蛇脑cdna文库中扩增cdna的过程，尤其是在蛇和草cdna文库中;血管肽酶抑制肽具有血管舒张和降压作用的固相合成方法
机译： 在编码dna的人细胞中获得干扰素的方法，富集提供的干扰素-rna（mrna）或另一种蛋白质或多肽的可诱导性mrna的方法，载体，分离另一种mrna的诱导型蛋白质的mrna的方法，是人干扰素的mrna，可以以高度纯化的形式安装在具有干扰素-aktivitaet编码dna的多肽以及人干扰素β-1和β-2的多肽的载体中
机译： 用组织学材料从石蜡块中纯化DNA的方法
