一种奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株及其建立方法

摘要

本发明公开了一种奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株及其建立方法。所述奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号是C2014164。所述奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法以人高转移肝癌细胞株LM3为诱导对象，采用持续诱导法建立奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR。通过本发明建立奥沙利铂耐药人肝癌细胞株可用于构建体内、外肿瘤耐药模型，为肝癌揭示耐药机制、逆转耐药出现、开发新的抗癌药物提供了实验基础。

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株及其建立方法。

背景技术

肝细胞肝癌是世界第五、我国第三大常见的恶性肿瘤，全球每年有超过50万肝癌新发病例，其中超过50％发生在中国。

由于早、中期肝癌无明显的临床表现，60％以上的肝癌患者在初次就诊时便已错过最佳手术时机。EACH研究首次证实，含有奥沙利铂的FOLFOX化疗新方案使晚期肝癌患者死亡风险降低20％，复发转移风险降低38％，且肿瘤客观缓解率显著提高到达8.2％。尽管奥沙利铂疗效明确，但许多肝癌患者在连续治疗后对奥沙利铂产生耐药性，从而导致化疗失败。因此，建立对奥沙利铂耐药的人肝癌细胞株从而研究耐药机制对于提高靶向治疗效果十分重要。

近年来，肿瘤耐药细胞系已成为研究肿瘤耐药机制及逆转肿瘤耐药的重要工具。在耐药细胞株建立基础上，研究人员可展开一系列研究，如揭示耐药机制、逆转耐药出现、开发新的抗癌药物、评估治疗应答等。目前通过药物筛选建立肿瘤耐药细胞系的方法分为两种，即持续诱导法与大剂量冲击法。而前者具有耐药性产生更易、稳定性更强等优点。因此，本发明选用人高转移肝癌细胞株LM3为诱导对象，人高转移肝癌细胞株LM3在裸鼠肝脏原位种植后，具有高度自发性转移能力。其中，肺转移率为100％，腹壁转移率为100％，膈膜转移率为70％。

到目前为止，以人高转移肝癌细胞株LM3为诱导对象建立耐奥沙利铂的人肝癌细胞株LM3-OR的研究鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种对奥沙利铂耐药的人高转移肝癌细胞株及其建立方法，该细胞株可用于构建体内、外的肿瘤耐药模型。

为了达到上述目的，本发明提供了一种奥沙利铂耐药的人高转移肝癌细胞株，分类命名为肝癌细胞株LM3，已于2014年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号是CCTCCNO:C2014164，保藏地址为：中国武汉，武汉大学，邮编：430072。

本发明还提供了上述的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法，该方法以人高转移肝癌细胞株LM3为诱导对象，采用持续诱导法建立奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR。

优选地，所述持续诱导法的具体步骤包括：

第一步：将人高转移肝癌细胞株LM3复苏后，用培养液培养至对数生长期，用奥沙利铂药物进行诱导，所述诱导的方法为：将对数生长期的细胞用培养液培养至40％-60％贴壁率时加入奥沙利铂，初始浓度为0.4-0.6μg/mL，继续培养，并维持该药物浓度直至细胞可以能稳定生长、传代；

第二步：将传代细胞用培养液培养至对数生长期，重复采用第一步所述的诱导方法进行诱导，但逐步提高所加入奥沙利铂的初始浓度，直至细胞能在含8.0-12.0μg/mL浓度的奥沙利铂的培养液中稳定生长、传代及复苏，此时的细胞株即为奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR。

优选地，第一步和第二步中的培养液为含10-15％胎牛血清的DMEM培养液。

更优选地，所述DMEM培养液中还含有青霉素100-200U/mL和链霉素100-200μg/mL。

优选地，第一步和第二步中的细胞培养温度为37℃，培养气氛中CO₂浓度为5％。

优选地，第二步中所述奥沙利铂的初始浓度的逐步提高方式为：先以每次增加0.5-1μg/ml的方式增加奥沙利铂的浓度；待奥沙利铂浓度增加至4-6μg/ml时，再以每次增加1-1.5μg/ml的方式增加奥沙利铂的浓度。

在本发明的一种优选方式中，第二步中所述奥沙利铂的初始浓度的逐步提高方式为：将奥沙利铂的初始浓度依次改为1.5μg/ml、2.5μg/ml、3.5μg/ml、4.5μg/ml、5.5μg/mL、7μg/mL、8.5μg/mL、10μg/mL。

与现有技术相比，本发明提供的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR耐药性能好，可用于构建体内、外肿瘤耐药模型，为肝癌揭示耐药机制、逆转耐药出现、开发新的抗癌药物提供了实验基础。

附图说明

图1为LM3、LM3-OR的细胞在含不同奥沙利铂有效浓度下集落形成结果；

图2为显微镜下观察LM3(A)、LM3-OR(B)细胞系在含10.0μg/ml奥沙利铂有效浓度培养液中的形态(100×)；

图3为LM3、LM3-OR的细胞生长曲线图；

图4为LM3(A)、LM3-OR(B)细胞侵袭实验结果(400×)；

图5为LM3、LM3-OR细胞基因聚类分析图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR的诱导建立

一种奥沙利铂耐药的人高转移肝癌细胞株，名称为奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号是C2014164，其建立方法为：采用人高转移肝癌细胞株LM3为诱导对象，采用持续诱导法建立奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR，所述的持续诱导法为：

(1)取市售的人高转移肝癌细胞株LM3，复苏后用DMEM培养液(含10％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)于5％CO₂、37℃条件下培养至对数生长期；

(2)取对数生长期LM3细胞，换新鲜DMEM培养液(含10％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)，用奥沙利铂药物进行诱导，所述的诱导方法为：将对数生长期的细胞用培养液培养至40％-60％贴壁率时加入奥沙利铂，初始浓度为0.5μg/mL，在5％CO₂、37℃条件下继续培养，适时换液，维持0.5μg/mL药物浓度直至细胞能在此浓度存活并缓慢生长；

(3)将传代细胞用培养液培养至对数生长期，重复采用步骤(2)中的诱导方法进行诱导，将奥沙利铂的初始浓度依次改为1.5μg/mL、2.5μg/mL、3.5μg/mL、4.5μg/mL、5.5μg/mL、7μg/mL、8.5μg/mL和10μg/mL，如此反复诱导、换液、传代，历时约6个月，最终细胞能在含10.0μg/mL浓度的奥沙利铂的培养液中生长及传代，此时的细胞株即为奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR；

(4)将上述LM3及LM3-OR细胞接种于6孔板(每孔1000个细胞)，24小时后加入不同浓度梯度的奥沙利铂(5-10μg/mL)，10天后固定，Giemsa染色后拍照。如图1所示，LM3细胞在5μg/mL浓度无克隆形成；LM-OR细胞对5-10μg/mL奥沙利铂均可生长并形成集落，说明LM3-OR细胞可较好的耐受奥沙利铂。

实施例2：耐药细胞株形态学观察

取对数生长期的人高转移肝癌细胞株LM3和奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR，于10μg/mL培养液中生长72小时后，倒置显微镜下观察细胞形态，结果如图2所示：相比于LM3细胞，LM3-OR细胞生长良好，呈梭形，有的甚至成线状。

实施例3：细胞生长曲线测定

将人高转移肝癌细胞株LM3和奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR分别消化、计数，按照3000个/孔接种于96孔板，分别培养24、48、72、96小时后，每孔加入CCK8(碧云天，No.C0037)，孵育2小时。570nm酶标仪(Model680，Bio-Rad)测吸光度。LM3及LM3-OR细胞生长曲线见图3。

实施例4：细胞侵袭实验测定

用Matrigel(BD公司，No.356234)按1：7稀释后，取75μL包被Transwell上室，置于37℃下4小时。将人高转移肝癌细胞株LM3和奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR分别用胰酶消化、离心，加DMEM培养基制成含2×10⁴细胞悬液500μL，加入Transwell(Corning公司，No.3422)上室中，下室中加入含10％胎牛血清培养液500μL。放入5％CO₂、37℃培养箱常规培养12小时后固定，Giemsa染色，于倒置显微镜下拍照。LM3-OR较LM3细胞侵袭能力增强(结果见图4)。

实施例5细胞基因表达谱芯片检测

本实验选用Agilent人表达谱芯片4×44K(designID：014850)，芯片包含了超过41,000人类基因和转录本。RNA质检合格后，参照Afilent表达谱芯片标准流程进行反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cy3标记的cRNA，芯片杂交，洗脱后利用AgilentScanner扫描得到原始图像，采用FeatureExtraction软件处理原始图像提取原始数据，利用Genespring软件进行quantile标准化处理。

表达谱差异分析结果表明，LM3与LM3-OR细胞相比，共发现差异(P005FC2)基因264个，其中上调(LM3-OR/LM3)基因46个，下调基因218个。实验重点分析了与耐药相关的基因，发现ABC转运体(ABCtransporters)、细胞周期(Cellcycle)、细胞凋亡(Apoptosis)、上皮细胞间质转型(Epithelia-mesenchymetransition)、药物代谢-脂质合成(Drugmetabolism-lipidsynthesis)通路发生显著富集，尤其ABC转运体通路基因发生明显变化，呈现上调(给药组/对照组)趋势，ABCB、CASP、MAPK相关基因在通路中处于重要调控地位，证明了奥沙利铂对耐药肿瘤细胞杀伤的重要机制。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。